Застосування клітинних технологій для поліпшення вигляду рубців

Сучасна наука характеризується стрімким розвитком низки споріднених дисциплін, об'єднаних під загальною назвою «біотехнологія». Цей розділ науки, що базується на новітніх досягненнях у галузі біології, цитології, молекулярної генетики, генної інженерії, трансплантології, має на меті використовувати величезний потенціал, закладений у рослинних і тваринних клітинах – основних структурних одиницях усього живого. «Жива клітина – це готовий біотехнологічний реактор, у якому реалізуються не тільки процеси, що призводять до утворення кінцевого продукту, але й низка інших, що допомагають підтримувати каталітичну активність системи на високому рівні», – Джон Вудворд, 1992. Початок клітинної науки було покладено в 1665 році, коли англійський фізик Р. Гук створив перший мікроскоп і відкрив клітини – cellulae («клітини») у корку. У 1829 році М. Шлейден і Т. Шванн обґрунтували «клітинну теорію», яка довела, що всі живі організми складаються з клітин. У 1858 році Р. Вірхов довів, що всі хвороби мають основу в порушенні структурної організації та метаболізму клітин. Він став засновником «клітинної патології». Фундаментальний внесок у науку про клітину зробили у 1907-1911 роках Р. Гаррісон та А.А. Максимов, які довели можливість культивування клітин поза організмом. Їхні роботи показали, що для культивування клітин тканини тварин та частини рослин необхідно механічно розділяти на дрібні шматочки. Для виділення клітин тканини розрізають гострим ножем або мікротомом на тонкі зрізи, приблизно 0,5-1,0 мм. Фізичне розділення клітин називається іммобілізацією. Ізольовані клітини отримують шляхом ферментативного диспергування шматочків рослин або тканин. Після подрібнення гострими ножицями шматочки обробляють трипсином або колагеназою для отримання суспензії - суспензії окремих клітин або їх мікроагрегатів у спеціальному середовищі. Альгінатні гелі (альгінат кальцію) широко використовуються для іммобілізації рослинних клітин. Доведено, що іммобілізовані рослинні та тваринні клітини зберігають здатність до біосинтезу. Продукти клітинного біосинтезу накопичуються в клітинах, їх експресія відбувається або спонтанно, або за допомогою спеціальних речовин, що сприяють підвищенню проникності клітинних мембран.

Культивування клітин тварин є набагато складнішим процесом, ніж культивування клітин рослин, що вимагає спеціального сучасного обладнання, високих технологій, наявності різних середовищ, факторів росту, призначених для збереження життєздатності клітин та підтримки їх у стані високої функціональної активності. Було виявлено, що більшість клітин твердих тканин, таких як тканини нирок, печінки та шкіри, є поверхнево-залежними, тому їх можна культивувати in vitro лише у вигляді тонких листів або моношарів, безпосередньо пов'язаних з поверхнею субстрату. Тривалість життя, проліферація та функціональна стабільність клітин, отриманих ферментативною дисперсією тканин, значною мірою залежать від субстрату, на якому вони вирощуються. Відомо, що всі клітини, отримані з тканин хребетних, мають негативний поверхневий заряд, тому позитивно заряджені субстрати підходять для їх іммобілізації. Ізольовані клітини, отримані безпосередньо з цілих тканин, можуть підтримуватися в первинній культурі в іммобілізованому стані, зберігаючи високу специфічність та чутливість протягом 10-14 днів. Іммобілізовані, поверхнево-залежні клітини відіграють важливу роль у біології сьогодні, особливо в клінічних дослідженнях. Вони використовуються для вивчення циклів розвитку клітин, регуляції їх росту та диференціації, функціональних та морфологічних відмінностей між нормальними та пухлинними клітинами. Іммобілізовані клітинні моношари використовуються в біотестах, для кількісного визначення біологічно активних речовин, а також для вивчення впливу на них різних лікарських засобів і токсинів. Лікарі всіх спеціальностей протягом десятиліть виявляють великий інтерес до клітини як терапевтичного засобу. Клітинні технології наразі стрімко розвиваються в цьому напрямку.

Початок тканинної та клітинної терапії пов'язаний з іменем відомого російського вченого В. П. Філатова, який у 1913 році заклав основи вчення про тканинну терапію, вивчаючи результати пересадки рогівки від здорових донорів хворим на катаракту. У процесі роботи з трансплантатами рогівки він виявив, що рогівка, законсервована на холоді протягом 1-3 днів при температурі -2-4 градуси С, приживається краще, ніж свіжа. Так, була виявлена властивість клітин виділяти в несприятливих умовах деякі речовини, що збуджують життєво важливі процеси в пересаджених тканинах і регенеративні - в тканинах реципієнта. Тканини та клітини, відокремлені від організму, перебувають у стані стресу, тобто уповільнюють життєдіяльність. Кровообіг у них зупиняється, а отже, і живлення. Тканинне дихання вкрай утруднене, порушується іннервація та трофіка. Перебуваючи в новому якісному стані, адаптуючись до нових умов існування, клітини виробляють особливі речовини з лікувальними властивостями. Ці речовини небілкової природи В. П. Філатов назвав біогенними стимуляторами. Він разом із В.В. Скородинською встановив, що матеріал тваринного та рослинного походження можна вільно автоклавувати при температурі 120 градусів Цельсія протягом години після витримування в несприятливих умовах, причому вони не тільки не втрачали активності, а навпаки, підвищували її, що пояснювалося вивільненням біологічних стимуляторів із консервованих тканин. Крім того, вони втрачали антигенні властивості, що значно знижувало можливість відторгнення. Консервований стерильний матеріал вводили в організм шляхом імплантації (плантації) під шкіру або у вигляді ін'єкцій екстрактів, що дало адекватні результати. Також було виявлено, що тканини плода містять значно більшу кількість біологічно активних речовин, ніж тканини дорослих особин, а деякі фактори виявляються лише в ембріонах. Інокульовані тканини плода не сприймаються організмом реципієнта як чужорідні через відсутність у цитоплазматичних мембранах білків, відповідальних за видову, тканинну та індивідуальну специфічність (білки головного комплексу гістосумісності). В результаті інокуляція тканин тваринного плода в організм людини не запускає механізми імунного захисту та реакції несумісності та відторгнення. В. П. Філатов широко використовував у своїй медичній практиці плаценту та шкіру людини. Курси лікування складалися з 30-45 ін'єкцій тканинних екстрактів та 1-2 імплантацій тканин, оброблених автоклавом.

Розпочавши свої дослідження з тканин і клітин людини та тварин, він переніс свої узагальнення на рослинний світ. Проводячи експерименти з живими частинами рослин (алое, подорожник, агава, бадилля буряка, звіробій тощо), він створював для них несприятливі умови, поміщаючи зрізане листя в темне місце, оскільки рослині для життєдіяльності потрібне світло. Він також виділив біогенні стимулятори з естуарного мулу та торфу, що пов'язано з тим, що мул і торф утворюються за участю мікрофлори та мікрофауни.

Тканинна терапія отримала новий виток свого розвитку наприкінці 70-х років, коли накопичені десятиліттями знання та досвід дозволили використовувати тваринні та рослинні тканини та клітини на якісно новому рівні для лікування людини та продовження її активного довголіття. Так, у деяких вітчизняних клініках та низці зарубіжних жінкам у фізіологічній менопаузі з клімактеричним синдромом або на тлі оваріектомії почали проводити тканинну терапію фетальними тканинами плаценти, гіпоталамуса, печінки, яєчників, тимуса та щитовидної залози для уповільнення процесів старіння, розвитку атеросклерозу, остеопорозу, порушень функцій імунної, ендокринної та нервової систем. В одній з найпрестижніших геронтокосметологічних клінік Західної Європи ін'єкції екстрактів, отриманих з фетальних тканин гонад баранів, використовуються для цих же цілей вже кілька десятиліть.

У нашій країні біостимулююче лікування також знайшло широке застосування. Донедавна пацієнтам з різними захворюваннями активно призначали ін'єкції екстрактів плаценти, алое, каланхое, седума великого (біоседу), ФіБС, дистиляту пелоїдів, пелоїдину, торфу, гумісолу, приготованих за методикою В. П. Філатова. Наразі придбати ці високоефективні та недорогі вітчизняні тканинні препарати тваринного, рослинного та мінерального походження в аптеках практично неможливо.

Основою для отримання різних біогенних препаратів з тканин та органів людини імпортного виробництва, таких як румалон (з хрящової тканини та кісткового мозку), актовегін (з телячої крові), солкосерил (екстракт крові великої рогатої худоби), а також вітчизняних препаратів - склоподібного тіла (зі склоподібного тіла ока великої рогатої худоби), керакол (з рогівки великої рогатої худоби), спленін (із селезінки великої рогатої худоби), епіталамін (з епіталамо-епіфізарної області) також є дослідження В.П. Філатова. Об'єднуючою властивістю для всіх тканинних препаратів є загальний вплив на весь організм в цілому. Так, «Тканинна терапія» академіка В.П. Філатова лягла в основу більшості сучасних розробок та напрямків у хірургії, імунології, акушерстві та гінекології, геронтології, комбустіології, дерматології та косметології, пов'язаних з клітиною та продуктами її біосинтезу.

Проблема трансплантації тканин хвилювала людство з давніх часів. Так, у папірусі Еберса, датованому 8000 роком до нашої ери, вже є згадка про використання трансплантації тканин для компенсації дефектів окремих ділянок тіла. У «Книзі життя» індійського вченого Сушрути, який жив 1000 років до нашої ери, є детальний опис відновлення носа зі шкіри щік та чола.

Потреба в донорській шкірі зростала пропорційно зростанню кількості пластичних та реконструктивних операцій. У зв'язку з цим почали використовувати трупну та фетальну шкіру. Виникла потреба зберегти донорські ресурси та знайти способи заміни шкіри людини тканинами тварин, різні варіанти моделювання шкіри. І саме в цьому напрямку працювали вчені, коли в 1941 році П. Медовар вперше продемонстрував принципову можливість росту кератиноцитів in vitro. Наступним важливим етапом у розвитку клітинних технологій стала робота Карасека М. та Чарльтона М., які в 1971 році здійснили першу успішну трансплантацію аутологічних кератиноцитів з первинної культури на рани кроликів, використовуючи колагеновий гель як субстрат для культивування КС, що покращило проліферацію клітин у культурі. Дж. Рейнвальд. Х. Грін. розробили технологію серійного культивування великої кількості кератиноцитів людини. У 1979 році Грін та його співавтори відкрили перспективи терапевтичного використання культури клітин кератиноцитів у відновленні шкіри у випадках великих опіків, після чого ця методика, постійно вдосконалюючись, почала використовуватися хірургами в опікових центрах за кордоном та в нашій країні.

У процесі вивчення живих клітин було виявлено, що клітини виробляють не тільки біогенні стимулятори небілкового походження, але й ряд цитокінів, медіаторів, факторів росту, поліпептидів, які відіграють важливу роль у регуляції гомеостазу всього організму. Було виявлено, що різні клітини та тканини містять пептидні біорегулятори, які мають широкий спектр біологічної дії та координують процеси розвитку та функціонування багатоклітинних систем. Почалася ера використання клітинної культури як терапевтичного засобу. У нашій країні в останні десятиліття в комбустіології прийнято трансплантацію суспензії фібробластів та багатошарових шарів клітин кератиноцитів. Такий активний інтерес до трансплантації клітин шкіри обпеченим пацієнтам пояснюється необхідністю швидкого закриття великих опікових поверхонь та дефіцитом донорської шкіри. Можливість виділення клітин з невеликого шматочка шкіри, здатного покривати ранову поверхню в 1000 або навіть 10 000 разів більшу за площу донорської шкіри, виявилася дуже привабливою та важливою для комбустіології та пацієнтів з опіками. Відсоток приживлення шару кератиноцитів варіюється залежно від площі опіку, віку та стану здоров'я пацієнта від 71,5 до 93,6%. Інтерес до трансплантації кератиноцитів та фібробластів пов'язаний не лише з можливістю швидкого закриття дефекту шкіри, але й з тим, що ці трансплантати мають потужний біологічно активний потенціал для покращення зовнішнього вигляду тканин, отриманих в результаті трансплантації. Формування нових судин, купірування гіпоксії, покращення трофіки, прискорене дозрівання незрілої тканини - це морфофункціональна основа цих позитивних змін, що відбуваються завдяки вивільненню пересадженими клітинами факторів росту та цитокінів. Таким чином, завдяки впровадженню в медичну практику прогресивних клітинних технологій трансплантації багатоклітинних шарів аутологічних та алогенних кератиноцитів та фібробластів на великі ранові поверхні, комбустіологи змогли не тільки знизити рівень смертності постраждалих від опіків з високим відсотком ураження шкіри, але й якісно покращити рубцеву тканину, яка неминуче виникає на місці опіків IIb та IIIa та b ступеня. Досвід комбустіологів, отриманий при обробці ранових поверхонь у хворих на опіки, наштовхнув на ідею використання вже модифікованого методу Гріна в дерматохірургічній практиці при різних шкірних та косметичних патологіях (трофічні виразки, вітіліго, невуси, бульозний епідермоліз, видалення татуювань, вікові зміни шкіри, а також для покращення зовнішнього вигляду рубців).

Використання алогенних кератиноцитів у хірургії, комбустіології та дерматокосметології має низку переваг порівняно з використанням аутологічних кератиноцитів, оскільки клітинний матеріал можна готувати заздалегідь у необмежених кількостях, консервувати та використовувати за потреби. Також відомо, що алогенні кератиноцити мають знижену антигенну активність, оскільки при культивуванні in vitro вони втрачають клітини Лангерганса, які є носіями антигенів комплексу HLA. Використання алогенних кератиноцитів підтверджується також тим фактом, що вони замінюються аутологічними після трансплантації, за даними різних авторів, протягом від 10 днів до 3 місяців. У зв'язку з цим сьогодні в багатьох країнах створені клітинні банки, завдяки яким можна отримувати клітинні трансплантати в необхідній кількості та у потрібний час. Такі банки існують у Німеччині, США та Японії.

Інтерес до використання клітинних технологій у дерматокосметології зумовлений тим, що «клітинні композиції» несуть потужний біоенергетичний та інформаційний потенціал, завдяки якому можна отримати якісно нові результати лікування. Аутокіни, що виділяються трансплантованими клітинами (фактори росту, цитокіни, оксид азоту тощо), в першу чергу діють на власні фібробласти організму, підвищуючи їх синтетичну та проліферативну активність. Цей факт особливо приваблює дослідників, оскільки фібробласт є ключовою клітиною дерми, функціональна активність якої визначає стан усіх шарів шкіри. Також відомо, що після пошкодження шкіри припіканням, лазером, голкою та іншими інструментами шкіра поповнюється свіжими стовбуровими попередниками фібробластів з кісткового мозку, жирової тканини та капілярних перицитів, що сприяє «омолодженню» пулу клітин організму. Вони активно починають синтезувати колаген, еластин, ферменти, глікозаміноглікани, фактори росту та інші біологічно активні молекули, що призводить до посилення гідратації та васкуляризації дерми, покращення її міцності,