Невірусна генна терапія дає надію за хронічного болю в попереку

У нещодавньому дослідженні, опублікованому в журналі Biomaterials, дослідники розробили нову невірусну генну терапію для лікування дискогенного болю в спині (ДБС) шляхом доставки транскрипційного фактора Forkhead Box F1 (FOXF1) за допомогою сконструйованих позаклітинних везикул (eEV) у дегенеративні міжхребцеві диски (МХД) in vivo.

Хронічний біль у попереку (ХБП) є зростаючою глобальною проблемою через старіння населення та погіршення проблеми з опіоїдами. Сучасні методи лікування включають короткочасне полегшення або дорогі хірургічні втручання, що підкреслює необхідність незалежних та менш інвазивних методів лікування.

Сучасні біологічні підходи, включаючи введення факторів росту, клітинну терапію та генну терапію вірусами, можуть зменшити дегенерацію на тваринних та людських моделях. Однак такі проблеми, як короткострокові ефекти, низька довгострокова ефективність, а також надмірна імуногенність та онкогенність, можуть перешкоджати безпосередньому застосуванню цих підходів.

У цьому дослідженні вчені розробили невірусну генну терапію для лікування дегенерації міжхребцевих дисків (ДМД) за допомогою FOXF1-eEV.

Дослідники трансфікували первинні ембріональні фібробласти мишей (PMEF) плазмідами, що містять FOXF1 або pCMV6 як контроль, та охарактеризували зразки eEV за допомогою аналізу відстеження наночастинок (NTA).

Вони оцінили ефективність завантаження молекулярного вантажу в електронні електромобілі (eEV) за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією (qRT-PCR) та звичайної ПЛР. Вестерн-блот аналіз ідентифікував FOXF1 та специфічні для EV білки у формаціях eEV. Команда використовувала плазміди, що посилюють верхні та нижні полілінкерні області, щоб визначити наявність плазмідної ДНК FOXF1 у клітинах-донорах та створити eEV.

Вони досліджували повнорозмірну мРНК, отриману з плазмідної ДНК в eEV та клітинах донорів.

Дослідники створили позаклітинні везикули з транскрипційними факторами для відновлення функції тканин та зміни больових реакцій у тваринній моделі ДБП.

Вони ідентифікували EV для транспортування та розподілу FOXF1 у пошкоджені міжхребцеві диски на мишачій моделі дискогенного болю в спині, щоб визначити інгібування FOXF1 eEV дегенерації міжхребцевих дисків.

Команда поєднала біомеханічне тестування міжхребцевих дисків мишей із візуалізацією, змінами позаклітинного матриксу (ECM) та больовими реакціями, оціненими через 12 тижнів, щоб підтвердити зміни в структурі та функції, а також біль, викликані терапевтичним втручанням.

Передопераційна та післяопераційна оцінка болю включала мікрокомп'ютерну томографію (мікро-КТ), магнітно-резонансну томографію (МРТ), механічне тестування, фарбування альціановим синім (AB) та пікросіріусовим червоним (PSR), тест з диметилметиленовим синім та імуногістохімію (IHC).

Дослідження включало хірургічну техніку, за якої дослідники вводили бупренорфін ER підшкірно мишам для контролю післяопераційного болю.

Команда проводила оцінку поведінки перед операцією та кожні два тижні від чотирьох до 12 тижнів після операції, використовуючи різні методи, включаючи тест відкритого поля, холодну пластину, підвішування за хвіст та підвішування за дротом.

Тест відкритого поля оцінював спонтанну активність мишей; тести з холодною пластиною вимірювали термічну гіпералгезію; тести з підвішуванням за хвіст вимірювали осьовий біль; а тести з підвішуванням за дротом вимірювали силу.

Через дванадцять тижнів після операції команда препарувала поперекові відділи хребта тварин, використовуючи трасування стегнових нервів та артерій, щоб ідентифікувати міжхребцеві диски між L4 та L5, L5 та L6, а також L6 та S1 міжхребцевим диском. Вони використовували міжхребцевий диск L5/L6 для оцінки гістології та визначення вмісту глікозаміногліканів (ГАГ).

Електронні електронні перетворювачі FOXF1 значно зменшили больові реакції, відновлюючи структуру та функцію міжхребцевого диска, включаючи покращення висоти диска, гідратації тканин, вмісту протеогліканів та механічних властивостей.

Дослідження було зосереджено на вивільненні завантажених FOXF1 електронів (eEV) з первинних фібробластів, трансфікованих транскрипційним фактором FOXF1. Кількісна зворотна ПЛР показала значне збільшення рівнів транскриптів мРНК FOXF1 та рівнів повнорозмірної транскрипції мРНК FOXF1 порівняно з клітинами, трансфікованими pCMV6.

Терапія FOXF1 eEV може зменшувати больові реакції в моделі пункції поперекового диска у мишей на термін до 12 тижнів. У самок мишей у групі, що отримувала FOXF1, спостерігався довший час судом, ніж у групі з травмами, який тривав щонайменше 12 тижнів після лікування.

Терапія FOXF1 eEV покращила гідратацію та висоту тканини міжхребцевого диска (МХД) у тварин з травмами та дегенеративними захворюваннями in vivo, зберігаючи при цьому рівень гідратації та інтенсивність T2-зваженого зображення диска МХД.

Однак команда спостерігала зменшення висоти диска у травмованих тварин та тварин, яких лікували pCMV6 eEV. У мишей, яких лікували FOXF1 eEV, не спостерігалося зменшення висоти диска через 12 тижнів після лікування. Стать не впливала на функціональні результати.

FOXF1 eEV відновлювали механічну функцію пошкоджених та дегенерованих міжхребцевих дисків in vivo. Під впливом осьового навантаження міжхребцеві диски, оброблені FOXF1 eEV, демонстрували вищу нормалізовану жорсткість NZ порівняно з пошкодженими міжхребцевими дисками.

В умовах повзучості пошкоджені міжфазні диски демонстрували збільшення нормалізованих переміщень повзучості, що свідчить про зниження нормалізованої пружної жорсткості при повзучості.

Результати показують, що зниження вмісту глікозаміногліканів (ГАГ) у пошкоджених міжхребцевих дисках (МХД) збільшує механічну гнучкість, але терапія електронного електромагнітного випромінювання (ЕВ) запобігає втраті глікозаміногліканів та подальшим змінам механічної функції.

FOXF1 eEV індукували структурні та функціональні зміни в міжхребцевому дискі шляхом підвищення рівня протеогліканів та глікозаміногліканів (ГАГ).

Результати дослідження показали, що електронні електронні переносники (eEV), завантажені факторами розвитку транскрипції, можуть лікувати болючі захворювання суглобів, такі як ДБП, шляхом доставляння цих транскрипційних факторів у дегенеративні та болючі суглоби за допомогою міжхребцевого диска.

Ця стратегія може допомогти зменшити структурні та функціональні порушення, спричинені захворюванням, та регулювати больові реакції з урахуванням статі.

Дослідники також рекомендували використовувати фактори розвитку транскрипції, такі як FOXF1, для переведення дегенеративних клітин нуклеотидів у проанаболічний стан in vivo. Необхідні подальші дослідження, щоб визначити його терапевтичну ефективність.