Невірусна генна терапія дає надію на хронічний біль у попереку

У нещодавньому дослідженні, опублікованому в журналі Biomaterials, дослідники розробили нову невірусну генну терапію для лікування дискогенного болю в спині (DBP) шляхом доставки фактора транскрипції Forkhead Блок F1 (FOXF1) з використанням сконструйованих позаклітинних везикул (eEV) у дегенеративних міжхребцевих дисках (МХД) in vivo.

Хронічний біль у попереку (ББП) стає все більшою глобальною проблемою через старіння населення та загострення проблем з опіоїдами. Сучасні методи лікування включають короткострокове полегшення або дорогі операції, що підкреслює потребу в лікуванні, яке не викликає звикання та є менш інвазивним.

Поточні біологічні методи лікування, включаючи введення фактора росту, клітинну терапію та вірусну генну терапію, можуть зменшити дегенерацію на тваринних і людських моделях. Однак такі проблеми, як короткострокові ефекти, низька довгострокова ефективність і непотрібна імуногенність і пухлиногенність, можуть перешкодити прямому застосуванню цих методів.

У цьому дослідженні дослідники створили невірусну генну терапію дегенерації міжхребцевого диска (МХД) за допомогою FOXF1-eEV.

Дослідники трансфікували первинні ембріональні фібробласти миші (PMEF) плазмідою, що містить FOXF1 або pCMV6 як контроль, і охарактеризували зразки eEV за допомогою аналізу відстеження наночастинок (NTA).

Вони оцінили ефективність завантаження молекулярного вантажу в eEV за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції (qRT-PCR) і звичайної ПЛР. Вестерн-блоттинг ідентифікував FOXF1 і специфічні білки EV в утвореннях eEV. Команда використовувала плазміди, які підсилюють полілінкерні області вище та нижче за течією, щоб визначити присутність плазмідної ДНК FOXF1 у донорських клітинах і створили eEV.

Вони досліджували повнорозмірну мРНК, отриману з плазмідної ДНК в eEV і донорських клітинах.

Дослідники створили позаклітинні везикули з факторами транскрипції, щоб відновити функцію тканин і змінити реакцію на біль у тваринній моделі DBP.

Вони ідентифікували EV для транспортування та розподілу FOXF1 до пошкоджених міжхребцевих дисків у мишачій моделі дискогенного болю в спині, щоб визначити інгібування FOXF1 eEV дегенерації міжхребцевих дисків.

Команда поєднала біомеханічне тестування міжхребцевих дисків мишей із візуалізацією, змінами позаклітинного матриксу (ECM) і реакцією на біль, оціненими через 12 тижнів, щоб підтвердити зміни в структурі та функції, а також біль, викликаний терапевтичним втручанням.

Оцінка болю перед операцією та після лікування включала мікрокомп’ютерну томографію (мікро-КТ), магнітно-резонансну томографію (МРТ), механічні тести, фарбування альціановим синім (AB) і пікросиріусовим червоним (PSR), тест на диметилметиленовий синій та імуногістохімію (IHC). ) ).

Дослідження включало хірургічну техніку, за якої дослідники вводили мишам бупренорфін ER підшкірно для контролю післяопераційного болю.

Команда проводила оцінку поведінки перед операцією та кожні два тижні від чотирьох до дванадцяти тижнів після операції, використовуючи різноманітні методи, такі як тест у відкритому полі, холодна пластина, підвішування за хвіст і підвішування на дроті.

Тест у відкритому полі оцінював спонтанну активність мишей; тести холодної пластини вимірюють теплову гіпералгезію; Тести підвішування хвоста вимірювали осьовий біль; і випробування дротяної підвіски на міцність.

Через дванадцять тижнів після операції команда досліджувала поперековий відділ хребта тварин, використовуючи трасування стегнового нерва та артерії, щоб ідентифікувати міжхребцеві диски між L4 і L5, L5 і L6, а також L6 і S1 IVD. Вони використовували IVD L5/L6 для оцінки гістології та визначення вмісту глікозаміногліканів (GAG).

FOXF1 eEV значно зменшили реакцію на біль, одночасно відновивши структуру та функцію IVD, включаючи покращення висоти диска, гідратації тканин, вмісту протеогліканів і механічних властивостей.

Дослідження було зосереджено на вивільненні eEV, завантажених FOXF1, із первинних фібробластів, трансфікованих фактором транскрипції FOXF1. Кількісна ОТ-ПЛР показала значне підвищення рівнів транскриптів мРНК FOXF1 і повнорозмірних транскрибованих мРНК FOXF1 порівняно з клітинами, трансфікованими pCMV6.

Терапія FOXF1 eEV може зменшити реакцію на біль у моделі миші з пункцією поперекового диска на термін до 12 тижнів. У самок мишей у групі, яка отримувала FOXF1, спостерігався довший час одержання даних, ніж у групі з ураженими ураженнями, що тривало щонайменше 12 тижнів після лікування.

Терапія FOXF1 eEV покращила гідратацію та висоту тканин IVD у травмованих і дегенеративних тварин in vivo, зберігаючи рівень гідратації та інтенсивність Т2-зваженого зображення IVD.

Однак команда спостерігала зменшення висоти диска у поранених тварин і тварин, які отримували pCMV6 eEV. Миші, які отримували FOXF1 eEV, не мали зменшення висоти диска через 12 тижнів після лікування. Стать не впливала на функціональні результати.

FOXF1 eEVs відновили механічну функцію пошкоджених і дегенерованих IVD in vivo. Під осьовим навантаженням IVD, оброблені FOXF1 eEV, продемонстрували вищу нормалізовану жорсткість NZ порівняно з пошкодженими IVD.

В умовах повзучості пошкоджені IVD демонстрували збільшені нормалізовані переміщення повзучості, що вказує на зменшення нормалізованої пружної жорсткості повзучості.

Результати показують, що зменшення вмісту GAG у пошкоджених IVD збільшує механічну гнучкість, але терапія eEV запобігає втраті глікозаміноглікану та подальшим змінам механічної функції.

Високі електричні викиди FOXF1 спричинили структурні та функціональні зміни в IVD шляхом підвищення рівня протеогліканів і GAG.

Результати дослідження показали, що eEV, завантажені факторами транскрипції розвитку, можуть лікувати хворобливі захворювання суглобів, такі як DBP, доставляючи ці фактори транскрипції до дегенеративних і болючих суглобів IVD.

Ця стратегія може допомогти зменшити структурні та функціональні аномалії, спричинені хворобою, а також регулювати реакцію на біль, залежну від статі.

Дослідники також рекомендували використовувати фактори транскрипції розвитку, такі як FOXF1, для перетворення дегенеративних NP-клітин у проанаболічний стан in vivo. Для визначення його терапевтичної ефективності необхідні подальші дослідження.