Застосування клітинних технологій для поліпшення виду рубців

Сучасна наука характеризується бурхливим розвитком ряду суміжних дисциплін, об'єднаних під загальною назвою «біотехнологія». Цей розділ науки, ґрунтуючись на останніх досягненнях в області біології, цитології, молекулярної генетики, генної інженерії, трансплантантологіі, ставить собі за мету використовувати величезний потенціал, закладений в рослинних і тваринних клітинах - основних структурних одиницях всього живого. «Жива клітина являє собою готовий біотехнологічний реактор, в якому реалізуються не тільки процеси, що призводять до утворення кінцевого продукту, але і ряд інших, що сприяють підтриманню каталітичної активності системи на високому рівні», - Джон Вудворд, 1992. Початок науки про клітині було покладено в 1665 року, коли англійський фізик Р. Гук створив перший мікроскоп і в пробці виявив осередки - cellulae ( «клітини»). У 1829 р М.Шлейден і Т.Шванн обгрунтували «клітинну теорію», яка доводила, що все живе складається з клітин. Р.Вірхов в 1858 р довів, що в основі всіх хвороб лежить порушення структурної організації і метаболізму клітин. Він став засновником «клітинної патології». Основний внесок в науку про клітці внесли в 1907-1911 рр. Р.Гаррісон і А.А.Максімов, довівши можливість культивування клітин поза організмом. Їх роботи показали, що для культивування клітин, тварини тканини і частини рослин повинні бути механічно роз'єднані до маленьких шматочків. Для виділення клітин тканини зрізаються гострим ножем або мікротомів тонкими зрізами, приблизно 0,5-1,0 мм. Фізичне розділення клітин називається іммобілізацією. Ізольовані клітини отримують ферментативним диспергированием шматочків рослин або тканин. Після роздрібнення гострими ножицями, шматочки обробляють трипсином або колагеназою для отримання суспензії - суспензії окремих клітин або їх мікроагрегатів в спеціальному середовищі. Для іммобілізації рослинних клітин широко використовуються альгінатние гелі (альгінат кальцію). Доведено, що іммобілізовані рослинні і тваринні клітини зберігають здатність до біосинтезу. Продукти клітинного біосинтезу накопичуються в клітинах, їх експресія відбувається або спонтанно, або за допомогою спеціальних речовин, що сприяють підвищенню проникності клітинних мембран.

Культивування тваринних клітин - значно складніший процес, ніж культивування рослинних клітин, що вимагає спеціальної сучасної апаратури, високих технологій, наявності різних середовищ, факторів росту, призначених для збереження життєздатності клітин і підтримки їх в стані високої функціональної активності. Було виявлено, що більшість клітин твердих тканин, таких, як тканини нирок, печінки, і шкіри є поверхнево залежними, тому in vitro їх можна культивувати тільки у вигляді тонких пластів або монослоев, безпосередньо пов'язаних з поверхнею підкладки. Тривалість життя, проліферація і функціональна стабільність клітин, отриманих ферментативним диспергированием тканин, у великій мірі залежить від підкладки, на якій вони вирощуються. Відомо, що всі клітини, отримані з тканин хребетних мають негативним поверхневим зарядом, тому для їх іммобілізації підходять позитивно заряджені підкладки. Ізольовані клітини, отримані безпосередньо з цілих тканин можна підтримати в первинній культурі в іммобілізованим стані при збереженні високої специфічності та чутливості протягом 10-14 діб. Іммобілізовані, поверхнево-залежні клітини грають на сьогоднішній день велику роль в біології, особливо їх роль важлива для клінічних досліджень. Їх застосовують для вивчення циклів розвитку клітин, регуляції їх росту і диференціювання, функціональних і морфологічних відмінностей між нормальними і пухлинними клітинами. Іммобілізовані моношарів клітин використовують в БІОТЕСТ, для кількісного визначення біологічно активних речовин, а також для вивчення на них дії різних лікарських препаратів і токсинів. Великий інтерес до клітки, як до лікувального засобу вже не одне десятиліття виявляють лікарі всіх спеціальностей. У цьому напрямку і бурхливо розвиваються в даний час клітинні технології.

З початком тканинної і клітинної терапії пов'язане ім'я знаменитого вітчизняного вченого В.П. Філатова, який в 1913 р заклав основи вчення про тканинної терапії, вивчаючи результати пересадок рогівки здорових донорів хворим з катарактою .. В процесі роботи з трансплантацією рогівки, він виявив, що рогівка, консервована на холоді протягом 1-3 діб при температурі -2 -4 градуси З приживається краще, ніж свіжа. Так було виявлено властивість клітин виділяти в несприятливих умовах якісь речовини, які збуджують життєві процеси в трансплантуються тканинах і регенеративні в тканинах реципієнта. Тканина і клітини, відокремлені від організму знаходяться в стані переживання, тобто уповільненою життєдіяльності. У них припиняється кровообіг, а отже і харчування. Вкрай складно тканинне дихання, засмучена іннервація і трофіка. Перебуваючи в новому якісному стані, пристосовуючись до нових умов існування клітини виробляють особливі речовини, що володіють лікувальними властивостями. Ці речовини небілкової природи були названі В.П.Філатова біогенними стимуляторами. Він встановив спільно з В.В.Скородінской, що матеріал від тварин і рослин вільно можна автоклавувати при t 120 градусів С протягом години після витримування в несприятливих умовах, при цьому вони не тільки не втрачали активність, а навпаки її підсилювали, що пояснювалося виходом біологічних стимуляторів з консервованих тканин. Крім того, вони втрачали антигенні властивості, що значно знижувало можливість відторгнення. Консервований стерильний матеріал вводився в організм методом імплантації (підсадки) під шкіру або в вигляді ін'єкцій екстрактів, з отриманням адекватних результатів. Було також виявлено, що фетальні тканини містять значно більшу кількість біологічно активних речовин, ніж тканини дорослих особин, а деякі фактори зустрічаються тільки у ембріонів. Інокульовані фетальні тканини не сприймаються організмом реципієнта, як чужорідні в зв'язку з відсутністю в складі цитоплазматичних мембран протеїнів, що відповідають за видову, тканинну і індивідуальну специфічність (білків головного комплексу гістосумісності). В результаті інокуляція в організм людини фетальних тканин тварин працює програмне забезпечення механізмів імунологічного захисту і реакції несумісності і відторгнення. В.П.Філатова в лікувальній практиці широко використовувалася плацента людини і шкіра. Курси лікування складалися з 30-45 ін'єкцій тканинних екстрактів і 1-2 імплантацій автоклавуватися тканин.

Почавши дослідження з людських і тваринних тканин і клітин, свої узагальнення він переніс і на рослинний світ. Виробляючи досліди з живими частинами рослин (алое, подорожник, агава, бадилля буряка, звіробій та ін), він створював для них несприятливі умови, поміщаючи зрізані листя в темне місце, оскільки для життєдіяльності рослині необхідне світло. З лимановою бруду і торфів їм також були виділені біогенні стимулятори, завдяки тому, що бруд і торф утворюються за участю мікрофлори і мікрофауни.

Новий виток свого розвитку тканинна терапія отримала в кінці 70-х років, коли накопичені десятиліттями знання і досвід дозволили на якісно новому рівні використовувати тваринні і рослинні тканини і клітини для лікування людини і продовження його активного довголіття. Так в деяких вітчизняних клініках і ряді зарубіжних жінкам в фізіологічної менопаузи з клімактеричним синдромом або на тлі оваріектомія для уповільнення процесів старіння, розвитку атеросклерозу, остеопорозу, дисфункцій з боку імунної, ендокринної та нервової систем стали проводити тканинну терапію фетальними тканинами плаценти, гіпоталамуса, печінки, яєчників, вилочкової і щитовидної залоз. В одній з найпрестижніших геронто-косметологічних клінік західної Європи для цих же цілей вже не одне десятиліття використовують ін'єкції екстрактів, отриманих з фетальних тканин статевих залоз баранів.

У нашій країні биостимулирующее лікування також набуло широкого застосування. Пацієнтам з різними захворюваннями до недавнього часу активно призначали ін'єкції екстрактів плаценти, алое, коланхое, очитки великого (биосед), ФіБС, пелоидодистиллят, пелоидин, торфот, гумизоль приготованих за методикою В.П.Філатова. В даний час в аптеках практично не можливо купити ці високоефективні і недорогі вітчизняні тканинні препарати тваринного, рослинного і мінерального походження.

В основі отримання різних біогенних препаратів з тканин і органів людини імпортного виробництва, таких як румалон (з хрящової тканини і кісткового мозку), актовегін (з крові телят), солкосерил (екстракт крові великої рогатої худоби), а також вітчизняних препаратів - склоподібне тіло ( з склоподібного тіла ока худоби), керакол (з рогівки великої рогатої худоби), спленин (з селезінки великої рогатої худоби), епіталямін (з епіталямо-епіфізарно області) також лежать дослідження В.П.Філатова. Об'єднуючим для всіх тканинних препаратів властивістю є загальний вплив на весь організм в цілому. Таким чином, «Тканинна терапія» академіка Філатова лягла в основу більшості сучасних розробок і напрямів в хірургії, імунології, акушерстві та гінеколоіі, геронтології, комбустіології, дерматології і косметології, пов'язаних з кліткою і продуктами її біосинтезу.

Проблема пересадки тканин хвилювала людство з давніх часів. Так в папірусі Еберса, датованому 8 000 років до н.е вже є згадка про застосування пересадки тканин з метою відшкодування дефектів окремих ділянок тіла. У «Книзі життя» індійського вченого Сушрута, що жив за 1 000 л. До н.е. Є докладний опис відновлення носа зі шкіри щік і чола.

Потреба в донорській шкірі росла пропорційно збільшенню кількості пластичних і реконструктивних операцій. У зв'язку з цим стали використовувати трупну і фетальний шкіру. Виникла необхідність в консервуванні донорських ресурсів і вишукування можливостей заміни людської шкіри тканинами тварин, різними варіантами моделювання шкіри. І саме в цьому напрямку працювали вчені, коли в 1941 році P.Medovar вперше показав принципову можливість зростання кератиноцитів in vitro. Наступним важливим етапом у розвитку клітинних технологій стала робота Karasek M. І Charlton M., які в 1971 р здійснили першу успішну трансплантацію аутологічних кератиноцитів з первинної культури на рани кроликів, застосувавши в якості підкладки для культивування КЦ колагеновий гель, що дозволило поліпшити проліферацію клітин в культурі. J.Rheinvvald. H Green. Розробили технологію серійного культивування великих кількостей кератиноцитів людини. У 1979 р Green зі співавторами відкрили перспективи лікувального застосування клітинної культури кератиноцитів у відновленні шкірних покривів при великих опіках, після чого ця методика, постійно вдосконалюючись, стала використовуватися хірургами опікових центрів за кордоном і в нашій країні.

У процесі вивчення живої клітини було виявлено, що клітини виробляють не тільки біогенні стимулятори небелкового походження, але і цілий ряд цитокінів, медіаторів, факторів росту, поліпептидів, які відіграють важливу роль в регуляції гомеостазу всього організму. Було виявлено, що, в різних клітинах і тканинах містяться пептидні біорегулятори. Які мають широкий спектр біологічної дії і координують процеси розвитку і функціонування багатоклітинних систем. Почалася епоха застосування культури клітин як лікувальний засіб. У нашій країні тансплантацію суспензії фібробластів і багатошарових клітинних пластів кератиноцитів в останні десятиліття взяли на озброєння в комбустіології. Такий активний інтерес до пересадки клітин шкіри обпаленим пояснюється необхідністю швидкого закриття великих опікових поверхонь і дефіциту донорської шкіри. Можливість з невеликого за величиною шматочка шкіри виділити клітини, здатні покрити поверхню рани в 1000 і навіть в 10 000 разів перевищує площу донорської шкіри виявилася дуже привабливою і важливою для комбустіології та опікових хворих. Відсоток приживлюваності пластів кератиноцитів варіює залежно від площі опіку, віку і стану здоров'я пацієнта від 71.5 до 93,6%. Інтерес до трансплантації кератиноцитів і фібробластів пов'язаний не тільки з можливістю швидко закрити дефект в шкірі, але і з тим, що ці трансплантат мають потужний біологічно активним потенціалом для поліпшення виду тканин, отриманих в результаті пересадок. Новоутворення судин, зняття гіпоксії, покращення трофіки, прискорення дозрівання незрілої тканини - ось морфо-функціональна основа цих позитивних змін, що відбуваються завдяки виділенню пересадженими клітинами чинників зростання і цитокінів. Таким чином, завдяки впровадженню в лікувальну практику прогресивних клітинних технологій з пересадки багатоклітинних пластів аутологічних і алогенних кератиноцитів і фібробластів на великі ранові поверхні, комбустіологи отримали можливість не тільки зменшити відсоток смертності обпалених з великим відсотком ураження шкіри, але і якісно поліпшити рубцеву тканину, яка неминуче виникає на місці опіків IIб і ІІІА і б ступенів. Досвід комбустіологів, отриманий при лікуванні ранових поверхонь у опікових пацієнтів підказав ідею використовувати, вже модифікований метод Гріна, в дермато-хірургічній практиці при різній шкірної і косметологічної патології (трофічні виразки, вітіліго, невуса, бульозної епідермолізе, при видаленні татуювань, вікові зміни шкіри, а також для поліпшення виду рубців).

Використання алогенних кератиноцитів в хірургії, комбустіології та дерматокосметології має ряд переваг перед ВЖИВАННЯМ аутологічних кератиноцитами, так як клітинний матеріал може бути приготований заздалегідь в необмежених обсягах, консервований і застосований в разі потреби. Відомо також, що алогенних КЦ мають зниженою антигенну активність, так як при культивуванні in vitro втрачають клітини Лангерганса, які є носіями антигенів комплексу HLA. На користь застосування алогенних КЦ свідчить також те, що вони заміщаються аутологічними після пересадки, за даними різних авторів в терміни від 10 днів до 3-х місяців. У зв'язку з цим сьогодні в багатьох країнах створені банки клітин, завдяки яким можна отримувати клітинні трансплантат в потрібній кількості і в потрібний момент. Такі банки є в Німеччині, США, Японії.

Інтерес до застосування клітинних технологій в дерматокосметології пов'язаний з тим, що «клітинні композиції» несуть в собі потужний біоенергетичний і інформаційний потенціал, завдяки якому можливе отримання якісно нових результатів лікування. Засоби, виділені пересадженими клітинами аутокіни (фактори росту, цитокіни, окис азоту та ін.), В першу чергу діють на власні фібробласти, підвищуючи їх синтетичну і проліферативну активність. Цей факт є особливо привабливим для дослідників, так як фібробласт є ключовою клітиною дерми, від функціональної активності якого залежить стан всіх шарів шкіри. Відомо також, що після травмування шкіри Каутер, лазером, голкою та іншими інструментами, з кісткового мозку, жирової тканини і перицитів капілярів відбувається поповнення шкіри свіжими стовбуровими попередниками фібробластів, що сприяє «омолодження» пулу власних клітин. Вони активно починають синтезувати колаген, еластин, ферменти, глікозаміноглікани, фактори росту та інші біологічно активні молекули, що і призводить до підвищення гідратації і васкуляризації дерми, поліпшенню її міцності,