Експериментальна робота з пересадки алогенних кератиноцитів на штучно створені рубці білих щурів

Бажання використовувати клітинний потенціал і необхідність пошуку нових ефективних методів поліпшення естетичного вигляду рубців привели до ідеї спробувати вивчити можливість пересадки кератиноцитів на рубцеві поверхні.

Для того, щоб довести вірогідність використання культури кератиноцитів для поліпшення виду рубців була пророблена експериментальна робота на білих лабораторних щурах, яким створювалися рубцеві поверхні. Модель рубців щурів отримували в результаті загоєння штучно нанесених ран на спині, уздовж хребта. Щурам вирізалися однакові шматки шкіри, розміром 2x3 см. Через 2,5 місяця після операції "моделювання рубців", щурам була проведена операція дермабразии (зняття верхніх шарів рубця за допомогою термокаустікі) і пересаджені алогенних кератиноцити, виділені зі шкіри щурят на 2-4 добу після народження.

Виділення і вирощування щурячих епідермоцітов здійснювалося в лабораторії клітинних технологій Інституту цитології РАН подальшої технології.

Шкіру промивали в сольовому розчині Хенкса, що містить 200 U / ml гентаміцину, розрізали на дрібні шматочки, площею 0,2-0,5 см ². Шматочки шкіри інкубували в 0,5% розчині діспази в збалансованому сольовому фосфатно-буферному розчині при температурі 37 ° С протягом години. Потім шматочки переносили в фосфатний сольовий буферний розчин Дульбекко і відокремлювали епідерміс від дерми. Епідерміс інкубували в 0,125% розчині трипсину протягом 10-15 хвилин при перемішуванні зі швидкістю 50 об / хв, після чого дія ферменту зупиняли додаванням 5% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Одну третину отриманої суспензії клітин використовували в чистому вигляді для одного з варіантів пересадки на рубці, другу третину вирощували на біосумісних вітчизняних плівкових покриттях «Поліпор», третю - на чашках Петрі без підкладки. Операція дермабразии отриманих рубців у щурів з подальшою пересадкою на них щурячих епідермоцітов здійснювалася під ефірним наркозом за допомогою термокаутера.

Першій групі щурів після дермабразії на відшліфовану, промиту фізіологічним розчином і висушену поверхню рубця накладалися стерильні шматочки батисту, на які наносилася збовтати суспензія алогенних щурячих епідермоцітов в концентрації 1,5 мільйона клітин в 1 мл (за даними інституту цитології). Батистові шматочки укладалися на відшліфований рубець так, щоб клітини лягли на поверхню рубця. Зверху накладалася пов'язка з декількох шарів марлі, яка пришивалась до країв рубця.

Частина отриманої суспензії клітин висівали в чашки Петрі на стерильні плівки «Поліпор», вирізані по формі чашок, інша частина - на чашки Петрі без плівки. Культивування здійснювали в середовищі FAD, що складається з суміші середовища DMEM і F12 в співвідношенні 3: 1. З додаванням 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби, 5 мкг / мл інсуліну (Sigma), 0,5мкг / мл гідрокортизону гемисукцината (Sigma). 10 мкг / мл епідермального фактора росту ЕФР (Інститут цитології РАН, СПб). Друга і третя групи щурів по 7 особин були прооперовані через 6 днів після першої. До цього часу в чашках Петрі з суспензії висіяних кератиноцитів утворювалися багатошарові пласти, які і пересідали щурам. Другій групі пересідали епідермоцітов на плівці, третьої - багатошаровим пластом без підкладки. Через 7 днів, отримані багатошарові пласти аллогічних кератиноцитів (МПАлК), висіяні на плівках «Поліпор» пересідали культурою безпосередньо на поверхню рани. Зверху плівка, щоб уникнути її здирання фіксувалася багатошарової марлевою пов'язкою і пришивалась до шкіри щурів.

Перед пересадкою кератиноцитів третьої групи щурів, вирощених без підкладки, вироблялося відділення ПАК від дна чашки Петрі обробкою діспазой, що володіє здатністю вибірково порушувати дермо-епідермальні зв'язку. При дії на багатошаровий пласт діспаза руйнує зв'язок клітин базального шару з дном чашки Петрі і в значно меншій мірі впливає на міжклітинні зв'язку, що дає можливість «знімати» пласт цілком. Відкріплення багатошарового клітинного пласта діспазой здійснювалося наступним чином. З чашок Петрі зливалася транспортне середовище, клітинні пласти тричі промивалися живильним середовищем, що містить антибіотики, зокрема - гентаміцин (0,2 мг / мл). Багатошарові пласти заливалися 0,125% розчину діспази ( «Sigma») і містилися в термостат, де їх інкубували при t = 37 ° C протягом 20-30 хвилин. Поява білого віночка, що відшаровується по периферії пласта - показник початку процесу відділення його від країв і дна чашки Петрі. Через кілька хвилин після початку процесу відділення, розчин діспази зливався, епітеліальні пласти 2-3 рази промивалися середовищем. На поверхню епідермального пласта накладали, вирізаний за розміром чашки шматок стерильної рани пов'язки "Літа-колір, до якого прилипав відокремлений діспазой пласт, додатково відшарований від дна чашки шпателем. За допомогою очних пінцетів пласт разом з покриттям із серветки« Літа-колір »(Росія ) відривався від дна чашки Петрі і обережно переносився на підготовлену поверхню рубця. Серветки «Літа-колір» містять в своєму складі гентаміцин і ексолін (екстракт колагену), який при зволоженні залишками росткової середовища і в подальшого вдоско шем фізіологічним розчином розбухав і ставав сучасним раневим покриттям, що забезпечує хороший захист від зовнішньої інфекції та швидке загоєння завдяки вологоємним структурі.

На плівки «Поліпор» і серветки «Літа-колір» накладалися багатошарові марлеві пов'язки, які пришивались до шкіри щурів для більш міцної їх фіксації. Кожна щур відкидають в окрему клітку, для створення оптимальних умов її утримання і приживлення пересаджених кератиноцитів. Пов'язки щурів, яким пересаджувалася суспензія і багатошаровий пласт епідермоцітов, знятий діспазой, щодня по кілька разів на день зволожувалися стерильним фізіологічним розчином, для створення клітин найбільш сприятливих умов для приживлення. З огляду на, що плівка «Поліпор» була непроникна для води, щурам другої групи зволоження пов'язок не проводилося, що було одним з переваг перед пересадками без плівок. Через 10 днів пов'язки були видалені. Клінічна картина рубців після трансплантації клітин мало чим відрізнялася від рубців без трансплантації, за винятком більш рожевою їх забарвлення (за рахунок дермабразии) і більшого лущення. Цей факт говорить про те. Що відразу після відпадання ранових покриттів з МПК в рубці не відбулося ніяких змін.

Взяття біопсії у щурів.

Через 1, 2, 5 і 9 місяців після пересадки щурячих аллогічних кератиноцитів на шліфовані рубці білих щурів, вироблялося взяття матеріалу для гістологічного, цитоморфологічного і електронномікроськопічеського дослідження. В якості контролю були взяті зразки нормальної щурячої шкіри і рубця без трансплантації клітин. Анестезія щурам здійснювалася за допомогою ефірного наркозу.

Після анестезії із зазначених ділянок, на які пересідали кератиноцити, біопсійним пробійником діаметром 2 мм. Бралися шматочки рубцевої тканини і містилися в 2,5% розчин глютарового альдегіду для підготовки матеріалу до Електронномікроськопічеськие дослідженню. Шматочки тканин, взяті для гістологічного дослідження, містилися в 10% розчин нейтрального формаліну з подальшою проводкою через спирти і заливкою в парафін, з подальшою нарізкою ультратонких зрізів і переглядом їх в світлооптичному мікроскопах.

Контроль I. Нормальна шкіра щури.

Для того щоб побачити різницю між мікроскопічної картиною нормальної рубцово-зміненої шкіри щурів і рубців через певні терміни після пересадки МПК, демонструються фотографії та опис до них на всіх етапах даного дослідження.

Епідерміс нормальної шкіри складається з 7-9 шарів клітин. Роговий шар помірної товщини. Місцями складається з 6-8 шарів рогових лусочок. Базальний шар представлений клітинами циліндричних форми з великими світлими, правильної форми ядрами і декількома ядерця. Чітко виражені десмосомальние зв'язку між клітинами і з базальноїмембраною. Під добре вираженою базальноїмембраною, яка має дрібні вирости в субепідермальной шар, паралельно їй лежать ніжні пучки колагенових і еластинових волокон, серед яких подовженої форми фібробласти, дрібні судини. У більш глибоких шарах пучки колагенових і еластинових волокон лежать в різних напрямках. Серед них багато судин з тонкими стінками однакового калібру, клітинних елементів (фібробласти. Огрядні клітини, лейкоцити). У великій кількості волосяні фолікули, сальні залози.

Контроль 2. Рубець щури 2-х місячної давності.

Клінічна картина. Рубці блідо-рожеві, з лущенням, місцями зберігаються скоринки. Їх площа зменшилася за рахунок контракції колагенових волокон і стала приблизно 3,0-3,5 см ^:. Придатки шкіри відсутні.

Мікроскопічна картина. Епідерміс складається з 3-5 шарів клітин, складчастий, представлений базальними клітинами округлої форми, одним рядом шиловидних, 1-2 рядами зернистих з зернами кератогиалина в верхньому шарі, є ділянки внутрішньоклітинного набряку. Роговий шар неоднорідний змінений від дуже тонкого до потовщеного. Відзначається складчастість рубця за рахунок (контракції) рубцевої тканини. Складки проникають до сосочкового шару і створюють враження сосочків. Кордон між епідермісом і дермою є пряму лінію. Базальна мембрана не скрізь простежується. У нижній частині субепідермальной і глибших шарів - судини з товстої, розпушеному стінкою, багато запустевшіх, з явищами стазу. Навколо судин - скупчення макрофагів, фібробластів. Макрофаги обступають вийшли з капілярів еритроцити і фагоцитируют їх. У більш поверхневих шарах - дрібні капіляри. Під епідермісом колагенові волокна пухко розташовані. У глибшому шарі рубця - грубі пучки колагенових волокон серед яких багато фібробластів.

Рубець щури через місяць після пересадки Мпала щурячих кератиноцитів.

Клінічна картина. Рубці рожеві, їх площа зменшилася, особливо в поперечнику і становить в середньому 2,5-3 см ². Волосся і сальні залози відсутні.

Дані мікроскопічного дослідження матеріалу, отриманого від щурів з пересадкою МПАлК на плівці і МПАлК без підкладки, практично однакові. Однак чисто технічно робота з МПАлК без підкладки на багато складніше і копітка, ніж при вирощуванні МПАлК на підкладці, тому при подальшому вивченні питання пересадки кертаіноцітов на рубці ми використовували в якості основи для вирощування ( «підкладок») багатошаровий батист.

Мікроскопічна картина. Відзначається потовщення епідермісу до 15-20 шарів, практично до середини якого кератиноцити мають вузьку, подовжену, вертикальну форму і компактне розташування. Базальні клітини розташовуються нерівною лінією. Їх ядра світлі, великі, округлої форми з одним або двома ядерця, що говорить про їх високу синтетичної і проліферативної активності. Кордон між епідермісом і дермою є пряму лінію. Шипуватий шар добре розвинений, складається з 3-5 шарів клітин округлої форми, є 2-х ядерцеві клітини.

Відразу під базальноїмембраною - плотнорасположенние тонкі пучки колагенових волокон, паралельно їм велику кількість запустевшіх судин, глибше колагенові волокна грубіші, зібрані в щільні пучки. Багато великих фібробластів, тучних клітин (2-3 в полі зору), макрофагів, лейкоцитів і запустевшіх судин, стінки яких розпушені, навколо них - пухко розташовані колагенові волокна. У деяких судинах - стаз, диапедез формених елементів. Навколо судин - фібробласти, поодинокі лімфоцити. Придатки шкіри відсутні.

При пересадці на шліфований рубець суспензії кератиноцитів мікроскопічна картина відрізняється від попередньої. У більшості тварин - епідерміс тонкий, складається з 5-6 шарів клітин. Нижній шар складається з клітин неправильної, полігональної форми з ядрами округло-неправильної форми. Стан субепідермальной шару аналогічно його станом в групі тварин без пересадки МПАлК.

В даному випадку можна говорити або про запізненні процесів, супутніх трансплантації клітин, або про велику втрату клітин, пересаджених у вигляді суспензії. Звідси був зроблений висновок про недоцільність корекції рубців пересадкою кератиноцитів у вигляді суспензії.

Рубець щури через 2 місяці після пересадки Мпала щурячих кератиноцитів.

Клінічна картина. Рубець виглядає тонким, ніжним. Місцями відмічається лущення, лусочки.

Мікроскопічна картінa. Роговий шар потовщений, місцями - гіперкератоз. Епідерміс потовщений, складається з 12-20 рядів клітин. Кордон між епідермісом і дермою є пряму лінію. Ніжні колагенові волокна під епідермісом лежать досить щільно. У більш глибоких шарах рубця вони зібрані в грубі великі пучки. У субепідермальной шарі з'являється новоутворення судин. У більш нижніх шарах рубцевої тканини - багато запустевшіх судин, розташованих паралельно поверхні епідермісу. Великі фібробласти рівномірно розподілені в товщі рубця, є гігантські, многоотростчатие, багато макрофагів.

Рубець щури через 5 місяців після пересадки МП щурячих зпідермоцітов.

Клінічна картина. Рубець виглядає рівним, гладким без лущення, є поодинокі волосся, їх густота більше на периферії рубців, що говорить про крайовому вростання волосяних фолікулів в рубець і новоутворення волосяних фолікулів. Площа рубців продовжує зменшуватися.

Мікроскопічна картина. Епідерміс і раніше товстий (15-20 верств, місцями до 30) у верхніх шарах заповнений зернами кератогиалина. Чітко видно базальнамембрана. Під нею колагенові волокна лежать пухко. У нижніх шарах - колаген більш потужний і щільно упакований. Серед пучків колагену багато капілярів .. У верхніх шарах зменшилася кількість запустевшіх судин. З'єднання епідермісу і дерми злегка хвилеподібний. Місцями є глибокі епідермальні вирости в рубцеву тканину. Серед колагенових волокон видно новоутворені судини. Є поодинокі волосяні фолікули і сальні залози.

Рубець щури через 9 місяців після пересадки Мпала щурячих епідермоцітов.

Клінічна картина. Рубці стали значно менших розмірів у порівнянні з більш ранніми термінами, їх площа в середньому становить близько 1,5-2,0 см ². Рубці нерівномірно покриті тонким, особливо по периферії. Зберігається незначне мелкопластінчатое лущення.

Мікроскопічна картина.

Епідерміс став тоншим, представлений з 6-8 рядів клітин, нагадує за будовою епідерміс нормальної шкіри щурів, тільки щільність клітин на 1 мм. Вище і вони дрібніше. Базальний шар складається з дрібних клітин округло-циліндричної форми. Базальна мембрана добре виражена, чітко видно полудесмосомами. Відзначається наявність епідермальних виростів в субепідермальной шар. Сосочковий шар виражений по всій довжині рубця. Дані факти свідчать про те, що цього періоду часу зчеплення пересаджених кератиноцитів стало значно міцнішим з нижчого рівня тканинами рубця. Отже, догляд за рубцями людей з пересадкою МПАлК через 9 місяців після пересадки МПК може бути традиційним. Під епідермісом ніжніші колагенові волокна, ніж в глибоких шарах. З'явилося багато судин, особливо поверхнево розташованих. У більш великих судинах стінки потовщені. Волосяні фолікули і сальні залози у великій кількості. Мікроскопічна картина нагадує дермоподобную тканину.

Результати експериментальної роботи та їх обговорення.

У процесі даної роботи на штучно створені рубці шкіри щурів, після операції дермабразии, пересідали кератиноцити в різних формах-на ранових покриттях, у вигляді суспензії на батисті і багатошаровим пластом без підкладки. Робота проводилася з метою отримання морфологічних даних про вплив пересаджених алогенних кератиноцитів на рубці, а також визначення оптимальних варіантів пересадки.

Було виявлено, що всі три способи пересадки реальні, проте пересадка МПАК без підкладки - дуже трудомістка процедура, в процесі якої МПАК може бути травмований, що відбивається на результатах пересадки. Більш того, даний спосіб пересадки виключає роботу на великих поверхнях.

Пересадка суспензії кератиноцитів - спосіб значно економічніший, не вимагає тривалого культивування клітин і простий в пропонованому нами варіанті з використанням стерильних батистових заготовок, розміри яких відповідають величині рубців. Відставання лікувального ефекту при пересадці суспензії клітин приблизно на місяць у порівнянні з МПК на раневом покритті - з суттєвий момент при тривалості лікування, яка обчислюється багатьма місяцями. Відомо, що при пересадці МПК опіковим пацієнтам, трансформація стану структури шкіри відбувалася поступово і протягом декількох років. Пересадка культури кератиноцитів на ранових покриттях - найзручніший і перспективний метод, однак і значно дорожчий. До того ж, вимагає на сьогоднішній день пошуку більш досконалих варіантів покриттів, які повинні бути пластичними, гігроскопічними, володіти бактериостатическими або бактерицидними властивостями і бути біологічно нейтральні для клітин. Плівка «Поліпор» - проміжний варіант вітчизняного плівкового раневого покриття, незважаючи на деяку недосконалість, дозволила нам вивчити в експерименті пересадку кератиноцитів щурів на рубці і зробити висновки про ефективність даного напрямку потяг рубців.

Автори, які робили пересадку МПК на рани обпалених, відзначали, що протягом першого тижня після трансплантації багатошарового пласта кератиноцитів на сановані рани, епідерміс утолщался і стратифікована. Всі шари епідермісу були добре виражені. Цікаво, що кількість клітинних шарів в трансплантантів на 10-30% більше, ніж в біоптатах шкіри. Автори відзначали появу гранул кератогиалина на 5-ту добу після пересадки MПК, базальної мембрани і полудесмосом - вже на 3-й добі.

J.Rives et al .. (l994), Парамонов Б.А. (1996); Кузнєцов Н.М та ін. (1998), встановили, що в ранні терміни після трансплантації МПК пацієнтам з полнослойних дефектами шкіри після опіків, зв'язок між дермою і епідермісом дуже слабка і являє собою пряму лінію, сосочковий шар відсутній. На кінець 2-го місяця починається формування неглибоких сосочків і придатків шкіри, зв'язок дерми і епідермісу стає міцнішою. Дані літератури говорято пересадці алогенних кератиноцитів на рани обпаленим пацієнтам, як про перспективний метод. Незважаючи на те, що відторгнення алогенних кератиноцитів відбувається поданням різних авторів в терміни від 10 днів до 3-х місяців, проте вони виконують свою роль в загоєнні поверхні рани, виділяючи фактори росту і механічно закриваючи дефект. Вважають, що МПАлК володіють зниженою антигенну активність, так як при культивуванні in vitro втрачають клітини Лангерганса, що дозволяє їм тривалий час існувати в організмі реципієнта. Крім того, алогенна культура, отримана зі шкіри молодих здорових людей має незрівнянно більшим біологічним потенціалом, ніж аутологичная культура пацієнтів після травми.

Основною метою нашого дослідження було з'ясувати чи будуть приживатися алогенних кератиноцити на рубці і які будуть зміни в рубцевої тканини під впливом такого біологічно активного «раневого покриття». У разі позитивного результату, відпрацювати максимально ефективну і найменш трудомістку технологію даного напрямку реабілітаційної медицини.

Отримані нами дані багато в чому виявилися подібними з даними літератури про морфологічні зміни, що відбуваються в епідермісі людини після пересадки алогенних кератиноцитів на опікові рани. Але є і суттєві відмінності, як в плані морфологічного субстрату, на який відбувається трансплантація, так і в плані технології. Так. Процес утворення базальної мембрани і дермо-епідермальних зв'язків (полудесмосом, сосочків) відбувається в більш пізні терміни в порівнянні з пересадкою кератиноцитів на ранові поверхні без рубцевих змін. Певне, це відбувається за рахунок більш поганого харчування тканин рубця в порівнянні з дермою або фасції м'язів. Рубець, особливо старий - це щільна сполучна тканина з дуже незначною кількістю судин, дно опікової рани є грануляційної тканини, багату судинами. Таким чином, очевидно, що умови, в яких відбувається трансплантація і приживлення кератиноцитів абсолютно різні. Чим більше васкуляризована область пересадки клітин, тим легше йде процес їх приживлення. З цього постулату випливає висновок про перевагу роботи з молодими рубцями, в яких сполучна тканина ще досить пухка і багата судинами.

В результаті цієї експериментальної роботи доведено, що:

1. Пересадка МПАлК на рубці можлива. 
2. Оптимальним способом пересадки є пересадка кератиноцитів на раневом покритті.
3. Поверхня рубця повинна бути відшліфована за допомогою оперативної дермабразии лазером або фрезою Шумана.
4. Під впливом МПАлК відбувається швидка епітелізація відшліфованою поверхні рубця.
5. Чим краще васкуляризована тканина рубця, тобто чим молодша рубець, тим краще результати трансплантації кератиноцитів.
6. Тканина рубця під впливом пересаджених кератиноцитів поступово трансформується і перетворюється в дермоподобную (більш пухку рубцеву тканину з придатками шкіри).
7. Поступове розпушення рубцевої тканини, починається з субепідермальной шару. Поліпшується її васкуляризація, пучки колагенових волокон у верхній і нижній частинах рубця приймають більш пухке розташування, ніж в рубцевої тканини без трансплантації клітин. З'являються волосяні фолікули і сальні залози. Епідерміс за своєю будовою, пройшовши фазу гіпертрофії, наближається до епідермісу нормальної шкіри.
8. Спостережувані зміни пов'язані з виділяються кератиноцитами факторами зростання, цитокінами, які покращуючи трофіку рубцевої тканини сприяють її трансформації з грубої фіброзної тканини в більш пухку, що і призводить до поліпшення виду рубця.

Таким чином, на підставі даного дослідження можна зробити висновок про сприятливий вплив трансплантованих кератиноцитів на рубцеву тканину, що може мати практичне значення для реабілітації пацієнтів з різного виду рубцями.

Дана робота на щурах дозволила також сформулювати вимоги. Пред'являються до раневим покриттям, на яких вирощуються кератиноцити.

Ранові покриття повинні бути:

• біосумісними з клітинами,
• повітропроникними,
• мати еластичну, формоутворювальну основу,
• бути гідрофільними,
• в якості лікарських добавок містити антибактеріальні препарати і антиоксиданти не токсичні для культивованих клітин.

Клінічні результати біотехнологічного лікування рубців.

Раніше роботами N.Carver et al. (1993) було встановлено, що оклюзійні пов'язки найкраще сприяє прикріпленню до рани і виживання кератиноцитів, але не дозволяють формуватися стратифікована (зрілому) епідермісу. Для утворення стратифікованого епідермісу необхідно повітряне оточення. Тому після прикріплення багатошарового пласта оклюзійне раневое покриття пропонувалося через 7-10 видаляти і вести рани під сухими пов'язками або водорозчинними мазями. Можна сказати, що якість і властивості «підкладки», на якій вирощуються клітини є дуже важливим моментом для ефективності трансплантації клітинного матеріалу, а отже для результатів роботи лікарів. Але ідеального раневого покриття на сьогоднішній день немає, незважаючи на велику кількість пропонованих варіантів (штучна шкіра, нетканное полотно з карбоксиметилцелюлози, фібрину покриття, напівпроникні поліуретанові плівки). Чи не маловажним моментом в цьому питанні є вартість «підкладок» (спеціальних ранових покриттів), так як їх дорожнеча збільшує загальну вартість біотехнологічного лікування.

Ефективність клітинних технологій на сьогоднішній день доведена, але, на жаль, ці технології дуже дорогі, особливо в країнах, де не налагоджено промислове виробництво клітинних композицій. Проте, такі країни, як США вже давно налагодили індустрію з виробництва клітинного матеріалу для трансплантації обпаленим. Зокрема, компанія BioSurface Technology Inc, починаючи з 1989 року, виростила 37 000 багатошарових пластів кератиноцитів, які були використані для лікування 240 хворих у 79 країнах світу (R.Odessey, 1992) при цьому 1 см ² клітинної культури коштує близько 7-8 $ США.

Технологія лікування різних захворювань і проблем шкіри має цілий ряд відмінностей, але в основі будь-якого лікування клітинами лежить отримання якісного клітинного матеріалу і його трансплантація.

Цей процес складається з наступних етапів:

• відбір шкіри у постраждалих (або у донорів),
• транспортування клаптів шкіри в біотехнологічний центр,
• виділення клітин базального шару і їх розмноження,
• нарощування багатошарових пластів кератиноцитів (МПК).
• трансплантація клітинних культур.

Основною проблемою при проведенні лікування за допомогою пересадки багатошарових пластів кератиноцитів є необхідність наявності життєздатних клітин на всіх етапах клітинної трансплантації. Шматочки шкіри для виділення аутологічних або алогенних клітин повинні бути максимально тонкими, так як в цьому випадку їх легше розділити, використовуючи механічні та ферментативні методи і отримати суспензію живих клітин для вирощування. Їх можна отримувати, зрізуючи дерматомом або використовуючи шкіру повік, крайньої плоті, внутрішньої поверхні плеча. З огляду на, що клітини чутливі до галогенів (хлор, йод), перекису водню, їх не можна використовувати при обробці шкіри під час взяття матеріалу.

Кількісний та якісний вихід клітин з шкірних клаптів і ефективність їх культивування залежать також від стану здоров'я і віку донора. Крім того, шкірні біоптати повинні бути максимально швидко і в відповідних умовах (середа, температура) доставлені в сертіфіцірованнную і акредитованих для цих цілей лабораторію.

Для зберігання і транспортування клаптів шкіри можуть бути використане середовище Голка або середовище 199 з додаванням 10% сироватки великої рогатої худоби, середа DMEM з додаванням 5% фетальної бичачої сироватки та антибіотиків.

У цитологічної лабораторії шкірний биоптат спочатку механічно поділяють на дрібні шматочки, потім йде обробка шкірних шматочків за допомогою ферментів: трипсину, колагенази, діспази і ін.

Під дією ферментів відбувається руйнування десмосом і кератиноцити вивільняються в середу в вигляді окремих клітин або агрегатів, що складаються з різної кількості клітин. Для культивування використовують тільки базальні кератиноцити, які вирощують на спеціальних середовищах в термостатах, що містять 5% CO., В чашках Петрі або у флаконах при t = 37 ° C. Вже через 48 годин спостерігається утворення колоній кератиноцитів, які поступово зливаючись перетворюються в моношар. Після отримання достатньої кількості клітин, отриману суспензію зітру на ранові покриття, підготовлені для цієї мети і поміщені в чашки Петрі. З суспензії формується спочатку моношар а потім і багатошаровий пласт кератиноцитів. Схематично етапи процесу культивування кератиноцитів представлені на рис. 12 (33,43,54,65).

Формування багатошарового пласта кератиноцитів, придатного для пересадки займає зазвичай 7-10 днів. Іноді цей термін виявляється більше, що залежить від якості вихідного матеріалу (віку, стану здоров'я донора, правильності взяття матеріалу, якості використовуваних середовищ і ін.). Якщо багатошаровий пласт переростає, то на його поверхні можуть виявитися клітини з явищами апоптозу, непридатні для трансплантації. Чашки Петрі, з вирощеним в них на ранових покриттях багатошаровими пластами кератиноцитів (МПК), доставляються в клініку в спеціальних контейнерах при температурі не нижче + 15 ° С.

Модифікована методика Гріна по вирощуванню МПК

У своїй роботі в якості раневого покриття ми використовували багатошаровий батист, відмовившись від плівок «Поліпор», з якими ми починали працювати в експерименті з пацюками. Таким чином, багатошарові пласти кератиноцитів вирощувалися нами на попередньо знежиреному і стерильному батисті, хоча він також не є оптимальним раневим покриттям.

Клінічні дослідження проводилися на волонтерах з дотриманням необхідних етичних норм: підписання договору і інформованої згоди.

1. Застосовувалася культура власних (аутологічних) і взятих з банку клітин (алогенних) кератиноцитів.
2. Власні кератиноцити отримували з шматочка шкіри, вирізаної з внутрішньої сторони плеча пацієнтів.
3. Операція дермабразии рубців проводилася за допомогою термокаустікі, ротаційних дисків і ербіевого лазера.
4. Були взяті групи пацієнтів з нормотрофіческая, гипотрофических і гіпертрофічних рубців.

Технологічний процес щодо застосування клітинних технології для поліпшення виду рубців шкіри складався з наступних етапів:

1. Відбір пацієнтів.
2. Роз'яснення суті лікування, термінів отримання очікуваних результатів, підписання договору та інформованої згоди.
3. Призначення пацієнтам за 2-3 тижні до операції Селмевіт по 1т. 3 рази на день, Цинктерал по 1т. 3 рази на день.
4. Взяття шматочка шкіри довжиною 2,0 см і шириною 0,7-1,0 см з внутрішньої поверхні плеча, високо, практично в нижній частині аксиллярной області для отримання аутологічних кератиноцитів.
5. У разі відмови пацієнтів на виділення власних кератиноцитів через можливість отримання лінійного рубця на внутрішній поверхні плеча, клітинний матеріал брався з банку клітин (алогенних кератиноцити).
6. Кератиноцити виділялися і вирощувалися в умовах сертифікованої для цього роду робіт лабораторії.
7. Після отримання МПК достатнього для трансплантації на рубці призначався день операції в клініці, куди привозиться до спеціальних контейнерах матеріал в чашках Петрі.
8. Було зроблене операція дермабразии рубця, гемостаз, відшліфована поверхня промивалася стерильним фізіологічним розчином, висушувалася, після чого на неї пересідали МПК на стерильному батисті «клітинами вниз». Тобто клітини, які були верхніми в МПК виявлялися нижніми, прилеглими до відшліфованою поверхні.
9. Зверху накладалася стерильна плівка, яка фіксувалася до шкіри еластичним бинтом або еластичним пластиром Omnifix. Замість плівки можна використовувати і індиферентні ранові покриття, що містять силікон, наприклад Mepitel, Mepiform, пластини силіконового гелю.

Через 5-7 днів плівка або силіконове покриття видаляється. До цього часу всі кератиноцити повинні переповзти на відшліфований рубець і прикріпитися до його поверхні.

10. Вологе середовище, створена під плівкою і силіконовим покриттям цьому активно сприяє. Батист, що залишається на рубці з цього моменту можна просочувати Куріозину або Хітозановий гелем. В результаті на 2-ий день створюється щільна кірка, яку, для зручності пацієнта краще фіксувати еластичним, повітропроникним пластиром, наприклад Omnifix. Повітропроникна кірка дозволяє утворився епідермісу диференціюватися і перетворюватися в зрілий.

Залежно від виду рубця і глибини шліфування, пов'язка відторгається через 8-10 днів. Епідерміс в цей час має на 30-40% більше клітинних шарів, ніж в нормальній шкірі. Базальна мембрана не сформована. Кератиноцити утолщенного епідермісу виділяють в рубцеву тканину масу біологічно активних молекул.

Успіх біотехнологічного лікування рубців багато в чому залежить від способу догляду за ними в післяопераційному періоді. Клітинні культури є «ніжним» видом ранового покриття і в ранні терміни після пересадки МПК можуть бути легко відшарувати від підлягаючих тканин. Тому пацієнтам рекомендується дбайливо поводитися з рубцем після операції. Протягом 8-9 місяців не терти і легко обробляти холодною кип'яченою водою, щоб уникнути здирання тонкого, новоствореного епідермісу, який не має щільного зчеплення з нижчого рівня тканинами.

Примітка.

Перед операцією і в процесі дермабразии застосування галогенсодержащих антисептиків і окислювачів (йодопірон, Сульйодопирон, иодинолом, йодінат, хлоргексидин, перекис водню) допустимо, перед пересадкою клітин категорично протипоказано через їх цитотоксичної дії. Токсичними для клітин також є також метиленовийсиній. Діамантовий зелений.

Щоб уникнути приєднання інфекції, особливо при роботі з гіпертрофічних рубців, можлива обробка операційного поля неоміцином сульфатом, полимиксином або гентаміцином. Вони не роблять цитотоксичного ефекту на кератиноцити.

В результаті такого лікування досягається потрійний ефект.

1. Вирівнювання поверхні рубця.
2. Створення над ним шару нового епідермісу, нормальної товщини.
3. Перетворення рубцевої тканини в дермоподобную за рахунок дії, цитокінів, факторів росту та інших біологічно активних молекул, які виділяються пересадженими клітинами і стимульований ними кератиноцитами, фібробластами і макрофагами.

Рубець стає менш помітним, більш еластичним, в ньому з'являються пори, Пушкова волосся, може відновитися пігментація за рахунок наявності в МПК меланоцитів.

Однак всі ці позитивні моменти в рубці настають не відразу. У зв'язку з цим необхідно попереджати пацієнтів. Про те, що процес трансформації рубцевої тканини в дермоподобную відбувається повільно і оптимальний результат такого лікування можна очікувати не раніше ніж через 10-14 місяців. Відразу після відторгнення пов'язок, шліфовані поверхні мають виражену полихромность, тим яскравіше, чим глибше проводилася шліфування. Найменші пошкодження шкіри відзначаються при шліфуванні нормотрофіческій рубців ербіевим лазером. Колір рубців і навколишньої шкіри відновлювався в терміни від 3 до 8 тижнів. Незважаючи на такі запобіжні заходи, іноді виникає післяопераційна гіперпігментація, яка може самостійно пройти протягом декількох місяців.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]