Один флакон, дві мішені: портативна діагностика туберкульозу на основі CRISPR зі 100% чутливістю

У журналі Science Advances було опубліковано статтю про портативний тест на туберкульоз, який можна проводити безпосередньо з мокротиння без складного обладнання. Ізотермічна ампліфікація ДНК та зчитування CRISPR поєднуються в одній пробірці; дві консервативні вставки M. tuberculosis (IS6110 та IS1081) тестуються одночасно, а також людський ген як внутрішній контрольний зразок. У невеликому «сліпому» тесті на клінічних зразках тест показав 100% чутливість (6/6) та 100% специфічність (7/7) порівняно з культурою; межа виявлення становить ~69–81 КУО/мл у симульованому мокротинні. Результат можна побачити на паперовій тестовій смужці, а реагенти ліофілізовані (зберігання без «холодового ланцюга»).

Передісторія

За даними ВООЗ, у 2023 році туберкульоз забере життя близько 1,25 мільйона людей; туберкульоз знову став провідною інфекційною причиною смерті, маючи приблизно 10,8 мільйона випадків захворювання. Це робить доступну та швидку діагностику критично важливою, особливо в умовах обмежених ресурсів.

• Сучасні тести є компромісом між точністю, швидкістю та ціною. «Золотий стандарт» культури дуже точний, але повільний; мікроскопія швидка, але нечутлива; ПЛР-платформи, такі як Xpert MTB/RIF Ultra, значно чутливіші (LOD ≈ 15,6 КУО/мл), але вимагають дорогого обладнання та картриджів, що обмежує охоплення.
• Чому ізотермічний метод та CRISPR. Ізотермічна ампліфікація RPA працює при 37–42 °C і не потребує термоциклерів — зручно «в польових умовах». Зчитування CRISPR (Cas12/13) додає видової специфічності та дозволяє візуально спостерігати латеральний потік («смужку») без складної оптики. Загалом, це шлях до портативних та дешевих PVR-тестів.
• Чому дві мішені MBT одночасно (IS6110 + IS1081). IS6110 — це багатокопійна вставка комплексу M. tuberculosis, але деякі лінії мають мало копій, і тести лише на IS6110 можуть «помилуватися». Додавання другої вставки IS1081 знижує ризик хибнонегативних результатів.
• Чому внутрішній контроль з боку людини. Зразки дихання можуть містити інгібітори та «погані» зразки. Ендогенний контроль з боку людини (наприклад, РНКаза P/геномна ДНК) підтверджує, що матеріал є адекватним, і реакція не пригнічена – інакше результат не можна вважати негативним.
• Однофазний формат сам по собі важливий. Він скорочує кількість кроків, знижує ризик зараження та полегшує роботу поза лабораторією. Такі підходи до лікування туберкульозу вже продемонстрували життєздатність; нова робота розширює ідею до формату з двома мішенями та внутрішнім контролем, а також демонструє ліофілізацію реагентів та рідер стріп-стріпів.
• У чому цінність цієї статті? Автори продемонстрували виявлення безпосередньо з мокротиння після максимально спрощеної підготовки зразка, межу виявлення ~70–80 КУО/мл у симульованому мокротинні та 100% чутливість/специфічність на невеликому сліпому наборі клінічних зразків — гарна «технологічна демонстрація» для подальших багатоцентрових валідацій.

Як це працює

• Вчені поєднали RPA (швидку ізотермічну ампліфікацію генетичного матеріалу при 37 °C) з «ріжучими» ферментами Cas13a/Cas12a. Вибравши направляючі РНК, вони налаштували систему для одночасного впливу на дві мішені MBT та паралельно з ДНК людини (перевіряючи, чи взагалі є матеріал у зразку, і чи реакція не «зупинилась»).
• Вся хімія поміщається в одну пробірку; після інкубації результат зчитується або флуориметром, або на тест-смужці латерального потоку – по суті, як експрес-тест.
• Обробку мокротиння спростили до нагрівання та короткочасного центрифугування — без екстракторів нуклеїнових кислот. Для найскладніших умов автори навіть обговорюють ручні альтернативи центрифузі.

Що показали тести

• Межа виявлення: 69,0 КУО/мл (штам H37Rv) та 80,5 КУО/мл (БЦЖ) у «спайковому» мокротинні. Перехресної реактивності з іншими бактеріями/грибками не виявлено.
• Клінічні умови (сліпі зразки): на 13 зразках з реальної практики – 100% чутливість (6/6) та 100% специфічність (7/7) відносно посіву. Для порівняння, на тому ж наборі GeneXpert Ultra показав 100%/86% відповідно.
• Технічні нюанси: з двох варіантів зчитування Cas13a працював краще (для формату "однопотоковий" він чутливіший, ніж Cas12a). Плюс, паралельне тестування двох мішеней Mtb знижує ризик отримання хибних результатів.

Чому це необхідно?

Сучасні тести є компромісом між точністю, швидкістю та доступністю: посіви дуже точні, але повільні; мазки швидкі, але неточні; ПЛР-системи, такі як GeneXpert, є точними та швидкими, але вимагають дорогих інструментів та картриджів. Новий підхід CRISPR має на меті заповнити цей прогалину: польова діагностика, яка працює при температурі 37°C, зі зчитуванням паперових смужок та можливістю зберігання реагентів без охолодження.

Обмеження та що далі

Це рання демонстрація на невеликому клінічному наборі – потрібні великі, багатоцентрові тести (включаючи коінфекцію ВІЛ, у дітей, з пауцибациллярними формами та різними лініями МБТ). Автори окремо зазначають, що в самій «польовій» версії настільну центрифугу доведеться замінити повністю ручним рішенням. Але сама архітектура – «дві мішені + внутрішній контроль» в одній пробірці – вже довела свою працездатність і забезпечує чіткий шлях до вдосконалення для масового використання.

Джерело: Александра Г. Белл та ін. Спрощений тест на основі CRISPR для виявлення туберкульозу безпосередньо з мокротиння, Science Advances, онлайн, 6 серпня 2025 р. (Том 11, Випуск 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206