Експериментальні моделі остеоартрозу

Хрящ - високоспеціалізована тканина, яка містить тільки один тип клітин (хондроцити), що характеризується відсутністю кровоносних і лімфатичних судин. Харчування хряща головним чином здійснюється шляхом всмоктування із синовіальної рідини. Метаболізм хондро-цитов регулюється низкою розчинних факторів, що виробляються локально хондроцітамі і навколишніми тканинами. Функція хондроцитов також залежить від складу позаклітинного середовища (напруга кисню, концентрація іонів, рН та ін.), Складу ВКМ, взаємодії клітин і матриксу, фізичних сигналів. Головним завданням експериментального моделювання є створення культур в позаклітинному середовищі без зміни фенотипу зрілих клітин. Друге завдання - створення культур для вивчення передчасного, відстроченого, короткого чи тривалого відповіді хондроцитов на хімічні і / або фізичні сигнали. Дослідження in vitro також дають можливість вивчати поведінку хондроцитов при остеоартрозі. Третім завданням є розвиток кокультуральних систем, що дозволяють вивчати взаємодії різних тканин в суглобі. Четверте завдання - підготовка хрящових імплантатів до подальшої трансплантації. І, нарешті, п'ята задача - дослідження факторів зростання, цитокінів або терапевтичних агентів, які здатні стимулювати репарацію і / або пригнічувати його резорбцію хряща.

За останні десятиліття створені різні моделі культур клітин суглобового хряща, серед них - моношарова культури, зважені культури, культури хондронов, експлантати, кокультури, культури безсмертних клітин. Кожна культура має свої переваги і недоліки і кожна підходить для дослідження одного певного аспекту метаболізму хондроцитів. Так, хрящові експлантати - прекрасна модель для вивчення обороту елементів матриксу, для чого потрібні справжні рецептори клітинної поверхні і нормальні взаємодії клітина-матрикс і матрикс-клітина. У той же час дослідження відкладень в матриксі або механізмів регуляції метаболізму хондроцитів рекомендують проводити на культурі ізольованих клітин. Монослойная культура низької щільності необхідна для вивчення процесу диференціювання клітин. Культури, зважені в природному або синтетичному матриксе, - модель для аналізу адаптаційного відповіді хондроцитов на механічний стрес.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Культури хондроцитов

При виборі хрящової тканини для досліджень in vitro необхідно враховувати кілька важливих моментів. Склад матриксу і метаболічна активність хондроцитів варіюють в різних суглобах, а остання також залежить від глибини розташування хондроцитів в тканини. Ці дані були отримані в ході декількох експериментів, в яких вивчалися ізольовані субпопуляції хондроцитов з зон хряща різної глибини. Виявлено ряд морфологічних і біохімічних відмінностей між культивованими хондроцітамі, розташованими в поверхневих і глибоких шарах суглобового хряща. Поверхневі клітини синтезують рідкісний, збіднений протеогликанами фібрилярний матрикс, тоді як більш глибокі клітини виробляють матрикс, що буяє фибриллами і протеогликанами. Більш того, поверхневі клітини виробляють відносно більше дрібних неагрегірованних протеогліканів і гіалуронову кислоту і відносно менше аггрекана і кератан сульфату, ніж більш глибоко розташовані хондроцити. Іншою важливою відмітною рисою метаболізму хондроцитів, ізольованих із зон хряща різної глибини, є відповідь на екзогенний стимул. За даними М. Aydelotte і співавторів, хондроцити бика з поверхневою зони хряща були більш чутливі до ІЛ-1, ніж клітини глибокої зони.

Поведінка клітин також залежить від локалізації тканини. Хондроцити хрящів ребер і вух, взяті від одного і того ж тварини, по-різному реагують на фактори росту, такі, як фактор росту фібробластів (ФРФ) і ТФР-бета. ФРФ збільшував включення тимідину, проліну і лейцину в культуру хондроцитов ребра, але не вуха. ТФР-Р збільшував включення тимідину в хондроцити хряща ребра і вуха, але не впливав на включення тимідину і проліну в хондроцити вуха. Хрящові клітини, отримані з зон, які несуть найбільше навантаження, відрізняються від таких з ділянок з низьким навантаженням на хрящ. Так, хондроцити зрілого хряща колінного суглоба вівці з центральної області суглобової поверхні болипеберцовой кістки, не покритій меніском, яка переносить найбільше навантаження in vivo, менше синтезують аггрекан, але більше декорін, ніж клітини з зон, покритих меніском. Автори також наголошують на важливості використання хряща з ідентичних зон суглобів при дослідженні синтетичної функції суглобів.

Метаболізм хондроцитов і їх відповідь на регуляторні фактори також істотно залежить від віку донора, розвитку його скелета і стану суглобів, з яких беруть клітини. У хондроцитов людини спостерігається значне зниження з віком проліферативної відповіді. Найбільше зниження відзначається у донорів у віці 40-50 років і старше 60 років. Більш того, вираженість проліферативної відповіді на фактори росту (наприклад, ФРФ і ТФР-бета) знижується в процесі старіння. Крім кількісних змін проліферації хондроцитів існують ще й якісні зміни. Клітини молодих донорів (10-20 років) краще реагують на фактор росту, отриманий з тромбоцитів (ФРПТ), ніж на ТФР-бета, тоді як протилежне спостерігається в клітинах дорослих донорів. Для пояснення віково-залежних змін синтетичної функції хондроцитів і їх відповіді на дію чинників зростання використовують кілька механізмів. Серед них зменшення кількості і афінності поверхневих клітинних рецепторів, зміна синтезу і біоактивності чинників зростання і цитокінів, модифікація пострецепторних сигналів.

Патологічний стан суглобів також змінює морфологію і метаболічну активність хондроцитів. Так, J. Kouri і співавтори (1996) ідентифікували три субпопуляції хондроцитов в хрящі при остеоартрозі. Хондроцити з поверхневою і верхньої частини середини хряща утворюють скупчення і синтезують більшу кількість протеогліканів і колагену. ТФР-бета і інсуліноподібний фактор росту (ІФР) здатні стимулювати синтез протеогліканів хондроцитами і частково нівелювати ефекти ІЛ-1 і ФНП-а. Експлантати хряща, ураженого остеоартрозом, і хондроцити, ізольовані з хряща хворого на остеоартроз, більш чутливі до стимуляції ТФР-бета, ніж хондроцити здорового хряща. Ці відмінності, найімовірніше, пов'язані з фенотипическими змінами хондроцитів в верхніх шарах суглобового хряща.

Ізоляція окремих хондроцитов досягається послідовною обробкою протеолітичнимиферментами ВКМ. Після їх вивільнення з ВКМ ізольовані клітини ідеально підходять для дослідження синтезу компонентів матриксу de novo. Деякі автори використовують тільки коллагеназу клостридий, інші - попередньо інкубують хрящ з трипсином, проназа, ДНКаза і / або гиалурона-дазой. Кількість ізольованих клітин залежить від використовуваних ферментів. Так, при обробці однієї колагеназою з 1 г тканини можна отримати 1,4Т0 ⁶ хондроцитов, тоді як при використанні пронази, гіалуронідази і колагенази - 4,3-10 ⁶. При обробці колагеназою в культурі клітин залишаються аггрекан, білки, ІЛ-6, ІЛ-8 в значно більшій кількості, ніж при послідовній обробці різними ферментами. Існує кілька пояснень цих відмінностей між двома клітинними культурами:

• Клітинні рецептори пошкоджені або пригнічені під дією ферментів, ТФР-бета пригнічує ДНК і синтез протеогліканів в тільки що ізольованих хондроцитах (1-й день), тоді як ДНК і синтез протеогліканів хондроцитов, культивованих в монослое (7 днів), стимулюється ТФР-бета. Однак для реекспрессія цих компонентів мембрани необхідний адекватний період перед початком експерименту.
• Екзогенні протеази можуть розірвати взаємодію клітин і матриксу, опосредуемое інтегринами. Сімейство интегринов сприяє закріпленню хондроцитов до молекул ВКМ (Shakibaei M. Et al., 1997) .Цей розрив може вплинути на експресію матричних генів.
• Залишки компонентів матриксу можуть регулювати синтетичну функцію хондроцитов. Інтегріни здатні розпізнавати продукти деградації ВКМ, тим самим відіграючи важливу роль у репарації тканини після впливу протеолітичних ферментів. Т. Larsson і співавтори (1989) повідомили про те, що додавання інтактних або фрагментованих протеогліканів до культури клітин стимулює синтез білків і протеогліканів. Однак високий рівень гіалуронової кислоти викликає значне зниження включення сульфатів у синтез протеогліканів хондроцитами ембріона курчати, зрілими хондроцитами свині і клітинами хондросаркоми щури. Більш того, гіалуронова кислота - інгібітор вивільнення протеогліканів з клітин навіть у присутності ІЛ-lb, ФНП-а, ФРФ, що свідчить про протидію першої біологічної активності факторів росту і цитокінів. Точний механізм, що лежить в основі дії гіалуронової кислоти, залишається неясним; відомо, що хондроцити містять рецептор до гіалуронової кислоти, пов'язаний з Актинові філаменти цитозоля. Зв'язування гіалуронової кислоти з її рецептором стимулює фосфорилювання білків. Таким чином, ці дані демонструють модулювання метаболічної функції хондроцитів фрагментованими або нативними молекулами матриксних білків шляхом активації мембранних рецепторів клітин.
• Швидка стимуляції ферментами синтезу матриксних протеїнів хондроцітамі може бути наслідком зміни форми хондроцитов і / або реорганізації цитоскелету.
• Деякі цитокіни (наприклад, ІЛ-8) і фактори росту (наприклад, ІФР-1, ТФР-Р) фіксуються в ВКМ. Найбільш відомим прикладом є зв'язування ТФР-бета декоріном, що призводить до зниження здатності першого індукувати клітинний ріст в клітинах яєчника у китайських хом'ячків. Дані про те, що зміст декоріна в хрящі підвищується з віком, свідчать про зниження біодоступності ТФР-бета при старінні. Фактори зростання і цитокіни можуть вивільнятися із залишків матриксу під час культивування і потім модулювати функції хондроцитів.

[8], [9], [10], [11],

Монослойная культура хондроцитов

Диференційований фенотип хондроцитів перш за все характеризується синтезом колагену II типу і тканеспецифических протеогліканів, а також низьким рівнем мітотичної активності. Є дані про те, що при тривалому культивуванні клітин в монослое, а також після декількох повторних пасажів клітин хондроцити втрачають свої сферичні обриси, набувають подовжену, фібробластоподібних форму. При такій фібробластний метаплазії також модифікується синтетична функція клітин, що характеризується прогресуючим зниженням синтезу колагену II, IX і XI типів і підвищенням синтезу колагену I, III і Утіпов. Малі неагрегірованние протеоглікани синтезуються за рахунок функціонального аггрекана. Сінтезкатепсіна В і L надзвичайно низький в диференційованих клітинах, але в процесі втрати диференційованості підвищується. Коллагеназа-1 експресується в диференційованих хондроцитах, при тривалій культивації її експресія знижується, тоді як підвищується продукція тканинних інгібіторів металопротеаз (ТІМП).

Диференційовані хондроцити реекспрессіруют колаген диференційованого фенотипу при перенесенні їх з монослойной культури у зважену. Процес диференціювання, ймовірно, пов'язаний з формою клітин. Це властивість регулярно використовується дослідниками, які вивчають дефектні трансплантати з аутологічних хондроцітамі. Невелика кількість клітин, отриманих з матеріалу біопсії, можна розмножити в монослойной культурі і потім знову помістити в тривимірний матрикс перед трансплантацією. Реекспрессія специфічного фенотипу дедіфференцірованнимі хондроцітамі, перенесеними в агарозному культуру, можна стимулювати ТФР-р, осеїн-гідроксіапатітним комплексом і аскорбінової кислотою.

У відповідь на дію чинників зростання і цитокінів хондроцити модифікуються під час процесу диференціювання. Клітинний відповідь на цитокіни та фактори росту розрізняються між недиференційованими і диференційованими хондроцітамі. ІЛ-1 стимулює проліферацію фібробластів, тоді як зростання недиференційованих хондроцитов пригнічується ІЛ-1. Синтез ДНК стимулюється ІФР-1 в подовжених, але не сплощених хондроцитах. У диференційованих хондроцитах стимулюючі ефекти ІЛ-1бета і ФНО-а на продукцію проколлагенази більш виражені, ніж в недиференційованих.

Культивування хондроцитов

Культивування хондроцитов у суспензії в рідкому середовищі або в природному або синтетичному тривимірному матриксе стабілізує фенотип хондроцитів. Клітини зберігають свою сферичну форму, синтезують тканеспеціфіческіе білки. Виважену культуру хондроцитов зазвичай рекомендують для дослідження утворення нового перицелюлярний матриксу. Культури хондроцитов в синтетичних або природних абсорбуючих полімери використовують для імплантації клітин в дефекти хряща для стимуляції регенерації хрящової тканини суглоба. Синтетична або природне середовище для імплантуються клітин повинна задовольняти ряду вимог:

• імплантати повинні мати пористу структуру для адгезії і зростання клітин,
• ні сам полімер, ні продукти його деградації не повинні викликати запалення або токсичні реакції при імплантації in vivo,
• носій трансплантата повинен мати здатність зв'язуватися з прилеглим хрящем або субхондральній кісткою,
• природний або синтетичний матрикс повинен мати здатність до абсорбції, його деградація повинна врівноважуватися регенерацією тканини,
• для полегшення репарації хряща хімічна структура і архітектура пір матриксу повинні сприяти підтримці поміщеними в нього хондроцітамі клітинного фенотипу і синтезу тканеспецифических білків,
• під час імплантації in vivo необхідно вивчити механічні властивості синтетичного або природного матриксу.

[12], [13], [14], [15], [16]

Суспензія хондроцитов в рідкій фазі

Прикріплення клітин до пластикових судинах, в яких здійснюється культивування хондроцитов, можна запобігти покриттям їх стінок розчином метилцелюлози, агарози, гідрогелю (полі-2-гідроксиетилметакрилату) або сумішшю колаген-агароза. У цих умовах хондроцити формують скупчення і синтезують головним чином аггрекан і тканеспеціфіческіе колаген (II, IX, XI типи). Зазвичай виявляють два типи клітин. Розташовані в центрі клітини зберігають сферичну форму, оточені добре розвиненим ВКМ, що підтверджується даними гістохімічного і ультраструктурного досліджень. На периферії хондроцити мають дискоїдні обриси, оточені рідкісним ВКМ; про функціональні особливості таких клітин відомо мало.

Можлива культивація хондроцитов на мікроносіях, підтримуваних у суспензії; як микроносителей використовують декстрановій намистини (цітодекс), покриті колагеном декстрановій намистини (цітодекс III), беспоровие мікросфери колагену I типу (целлаген). У цих умовах культивування хондроцити прикріплюються до поверхні мікроносіях, зберігають свою сферичну форму і виробляють матріксноподобний матеріал. Більш того, використання целлагена сприяє проліферації хондроцитів і реекспрессія нормального фенотипу. Тому культивування хондроцитов на мікросфер целлагена можна використовувати для відновлення фенотипу клітин перед трансплантацією.

Ще одним методом культивування суспензії хондроцитов в рідкому середовищі є їх культивування у вигляді щільних кульок, що складаються з клітин (0,5-1 * 10 ^б ), отриманих шляхом центрифугування. Такі хондроцити здатні продукувати матрикс, який містить велику кількість протеогліканів, колагену II типу, але не колагену I типу, що підтверджено гістологічними, імуногістохімічними і кількісними методами.

Суспензія хондроцитов в природному ВКМ

Хондроцити можна культивувати у суспензії в тривимірному матриксе (м'який агар, агароза, колла-генів гель або губка, гіалуронова кислота, фібриновий клей, намистини алгіната).

Культивовані в агарозе хондроцити зберігають свій нормальний фенотип і синтезують колаген II типу і тканеспеціфіческіе аггрека-нові агрегати. При культивуванні в агарозе синтезовані кліткою протеоглікани виділяються в середу протягом 50 днів. Для порівняння - в монослойной культурі клітинна фаза переповнюється глікозаміногліканами вже в перші 5-6 днів культивування; при культивуванні в середовищі після посилення синтезу і вивільнення гликозаминогликанов в перші 8-10 днів настає времязавісімое їх зменшення. Проте, поведінка хондроцитов при їх культивуванні в агарозе відрізняється від такого в умовах in vivo. У агарозе велика кількість синтезованих агрегатів аггрекана містить більш дрібні і в меншій кількості молекули, ніж in vivo. ТФР-Р стимулює синтез протеогліканів в експлантати, проте знижує синтез аггрекана в агарозе.

Алгінат - лінійний полісахарид, отриманий з коричневої морської водорості. У присутності двовалентних катіонів, таких, як іони Са ²⁺, цей полімер стає гелем. Кожен хондроцит, що потрапив в алгінат, оточений матриксом з негативно заряджених полісахаридів, пори якого співмірні з такими в гиалиновом хрящі. Матрикс, який формують хондроцити в бусинах алгіната, складається з двох відділів - тонкого шару клітинно-асоційованого матриксу, відповідного перицелюлярний і територіальному матриксу, суглобового хряща і більш віддаленого матриксу, еквівалентного міжтериторіального в нативної тканини. На 30-й день культивування відносний і абсолютний обсяг, яку він обіймав клітинами, і кожен з двох відділів в намистині алгіната майже повністю ідентичні таким в нативному хрящі. Протягом майже 30 днів хондроцити зберігають свою сферичну форму і виробляють аггрекан, гідродинамічні властивості якого схожі з такими молекул аггрекана в матриксі суглобового хряща, а також колагенові молекули II, IX і ХI типів. У той же час, подібно до інших культур-суспензіям, на поверхні намистин алгіната присутні сплощені клітини, які виробляють невелику кількість молекул колагену I типу, безпосередньо вивільняються в середу і не інкорпорує в ВКМ. У бусинах алгіната спостерігається помірна проліферація хондроцитів. Після 8 міс культивування в гелі алгіната зрілі хондроцити втрачають метаболічну активність і продовжують синтезувати тканеспеціфіческіе колаген II типу і аггрекан.

Н. Tanaka і співавтори (1984) досліджували дифузійні властивості різних природних молекул в алгінат і виявили, що молекули масою понад 70 кД НЕ дифундують через алгінат. Таким чином, культивування клітин в алгінат підходить для дослідження регуляції біосинтезу матриксу та організації ВКМ. Доступність клітин, культивованих в алгінат, дозволяє досліджувати дію пептидних регуляторних факторів і фармакологічних агентів на транскрипционном, посттранскрипційна і трансляційному рівнях.

Хондроцити також культивують в матриксі з колагенових волокон I і II типів. S. Nehrer і співавтори (1997) порівнювали функціонування хондроцитов собаки в порізно колагенової-протеогліканових полімерних матриксу, що містять колаген різного типу. Вони виявили важливі відмінності в морфології биосинтетической функції хондроцитів, що культивуються в колагенових матриксу, що містять колаген I і II типів. Клітини в матриксі з колагену II типу сохрянялі свою сферичну форму, в той час як в коллагене I типу мали фібробластоподібних морфологію. Більш того, в матриксі з колагену II типу хондроцити виробляли більшу кількість глікозаміногліканів. J. Van Susante і співавтори (1995) порівнювали властивості хондроцитов, культивованих в алгінат і коллагеновом (I тип) гелі. Автори виявили значне збільшення кількості клітин в коллагеновом гелі, проте з 6-го дня культивації клітини втратили характерний фенотип, перетворившись в фібробластоподібних клітини. У гелі алгіната спостерігали зменшення кількості клітин, однак хондроцити зберігали свій нормальний фенотип. У коллагеновом гелі кількість протеогліканів, що припадають на одну клітку, було значно вище, ніж в алгінат, проте в гелі спостерігали зниження синтезу елементів матриксу, починаючи з 6-го дня культивування, тоді як в алгінат синтез продовжував зростати.

Твердий тривимірний фібриновий матрикс є природна речовина, яке підтримує зважені в ньому хондроцити в диференційованому фенотипе. Тривимірний фібриновий матрикс також може використовуватися в якості носія при трансплантації хондроцитов. Перевагами фібрину є відсутність цитотоксичності, здатність заповнювати простір, адгезивна здатність. Шляхом гістологічних та біохімічних досліджень, Ауторо-діографіі, електронної мікроскопії виявлено, що хондроцити в фібриновими гелі зберігають свою морфологію, розмножуються і виробляють матрикс навіть після 2 тижнів культивування. Однак G. Homminga і співавтори (1993) повідомили, що вже після 3 днів культивування починається дезінтеграція фібрину, прогресує дедифференцировка хондроцитов.

Суспензія хондроцитов в штучному (синтетичному) ВКМ

Імплантати хряща для реконструктивної або ортопедичної хірургії можуть бути отримані шляхом вирощування ізольованих хондроцитов in vitro в синтетичному біосумісним матриксе.

Культивовані в полігликолевою кислоті хондроцити пролиферируют і підтримують нормальну морфологію і фенотип протягом 8 тижнів. Комплекс хондроцити-полігліколевий кислота складається з клітин, глікозаміногліканів, коллагнов, має зовнішню колагенову капсулу. Однак в таких імплантатах присутні два типи колагенових молекул - I і II. Імплантати з дедіфференцірованних серією пасажів хондроцитов мають більшу кількість глікозаміногліканів і колагену, ніж в імплантатах з первинно недиференційованих хондроцитов.

L. Freed і співавтори (1 993b) порівняли поведінку культур хондроцитов людини і бика в волокнистої полігликолевою кислоті (ВПГК) і по-ворожнечі полілактіловой кислоті (ППЛК). Через 6-8 тижнів культивації хондроцитов бика в ВПГК або ППЛК автори спостерігали проліферацію клітин і регенерацію хрящового матриксу. У ВПГК хондроцити мали сферичну форму, розташовувалися в лакунах, оточених хрящовим матриксом. Після 8 тижнів культивування in vitro регенерована тканину містила до 50% сухої речовини (4% клітинної маси, 15% гликозаминогликанов і 31% колагену). У ППЛК клітини мали веретеноподібну форму, невелику кількість глікозаміногліканів і колагену. У ВПГК ріст клітин був в 2 рази інтенсивніше, ніж в ППЛК. В умовах in vivo хондроцити, вирощені в ВПГК і ППЛК, протягом 1 -6 міс виробляли тканину, гістологічно схожу на хрящ. Імплантати містили глікозаміноглікани, колаген I і II типу.

Фетальні хондроцити бика культивували в порізно високої щільності гідрофобному і гідрофільній поліетилені. Після 7 днів інкубації в обох субстратах клітини зберігали сферичну форму, містили головним чином колаген II типу. Після 21 дня культивації виявилося, що гідрофільний матрикс містить більшу кількість колагену II типу, ніж гідрофобний.

Хрящову тканину також можна отримати шляхом культивування в монослое на фільтрах Millicell-CM. Попереднє покриття фільтрів колагеном необхідно для прикріплення хондроіітов. Гістологічне дослідження культури демонструє акумуляцію хондроцитов в ВКМ, що містить протеоглікани і колаген II типу. Колаген I типу в такій культурі не виявлено. Хондроцити в отриманої хрящової тканини мають сферичну форму, проте на поверхні тканини вони кілька сплощені. Товщина новоствореної тканини збільшувалася з часом і залежало від початкової щільності моношару клітин. В оптимальних умовах культивування товщина хрящової тканини досягала 110 мкм, організація її клітин і колагену в поверхневий і глибокий шари аналогічна такій у суглобового хряща. ВКМ містить приблизно в 3 рази більшу кількість колагену і протеогліканів. Після 2 тижнів культивації відзначена акумуляція матрік-са, яка давала можливість отримати тканину з фільтра і використовувати її для трансплантації.

З Sims і співавтори (1996) досліджували культивування хондроцитов в поліетиленоксид-гелі - Інкапсульована полімерному матриксе, що дозволяє переносити велику кількість клітин шляхом ін'єкції. Через 6 тижнів після ін'єкції в підшкірну клітковину у бестімусних мишей був утворений новий хрящ, який морфологічно характеризувався білим опалесцірованіем подібно гіалінових хрящем. Дані гістологічного та біохімічного досліджень свідчили про наявність активно проліферуючих хондроцитів, що виробляють ВКМ.

Експлантація

Експлантація хрящової тканини використовується для дослідження процесів ана- і катаболізму в ній, підтримки гомеоста через, розробці і репарації. Хондроцити в експлантати хрящової тканини підтримують нормальний фенотип і склад ВКМ, подібні до таких в суглобовому хрящі in vivo. Після 5 днів культивування в присутності сироватки досягається постійний рівень процесів синтезу і природної деградації. Резорбцію тканини можна прискорити в основний культурі і культурі з додаванням сироватки за допомогою ряду агентів, наприклад, ІЛ-IB, ФНП-а, бактеріальнихліпополісахарідов, дериватів ретіноівой кислоти або активних кисневих радикалів. Для вивчення репарації хряща його пошкодження індукують розчинними медіаторами запалення (Н ₂ О ₂, ІЛ-1, ФНП-а) або фізичним розривом матриксу.

Метод органотіпних культур - модель для дослідження in vitro ефектів ізольованих зовнішніх факторів на хондроцити та навколишній їх матрикс. В умовах in vivo хондроцити рідко розташовані в ВКМ і не контактують один з одним. Культура експлантати суглобового хряща зберігає цю структурну організацію, а також особливі взаємодії між хондроцитами і навколишнього їх позаклітинної середовищем. Таку модель також використовують для вивчення впливу механічного стресу, фармакологічних агентів, факторів росту, цитокінів, гормонів на метаболізм хряща.

Ще однією перевагою експлантаціі хрящової тканини є відсутність пошкодження хондроцитів під дією протеолітичних ферментів або механічного фактору, що неминуче при ізоляції клітин. Рецептори і інші мембранні білки і глікопротеїни захищені від факторів.

[17], [18], [19], [20], [21]

Культура хондронов

Хондрон - структурна, функціональна і метаболічна одиниця суглобового хряща, що складається з хондроцитів, його перицелюлярний матриксу і компактної філаментная капсули і відповідає за гомеостаз матриксу. Хондрони механічним шляхом екстрагують з хряща і збирають за допомогою декількох послідовних низькошвидкісних гомогенізації. Ізольовані з зон різної глибини хряща хондрони можна розділити на чотири категорії: одиничний хондрон, спарені хондрони, множинні (три або більше) лінійно розташовані хондрони (колонки хондронов), скупчення хондронов.

Поодинокі хондрони зазвичай виявляють у середніх шарах интактного хряща, спарені - на кордоні середніх і глибоких шарів, лінійно розташовані множинні хондрони типові для глибоких шарів интактного хряща. Нарешті, скупчення хондронов складаються з випадково організованих груп одиничних і спарених хондронов, які зберігають агреговане стан після гомогенізації. Скупчення хондронов представляють собою великі фрагменти хряща, зазвичай містять кілька хондронов і радіально розташовані колагенові фібрили, т. Е. Типова організація, характерна для глибоких шарів матриксу. Хондрони иммобилизируют в прозорій агарозе, що дозволяє проводити дослідження їх структури, молекулярного складу і метаболічної активності. Систему хондрон - агароза розглядають як мікромодель хряща, яка відрізняється від традиційної системи хондроцит - агароза тим, що зберігається природне мікрооточення, немає необхідності здійснювати його синтез і складання. Культура хондронов - модель для вивчення взаємодій клітин і матриксу в суглобовому хрящі в нормі і при патологічних станах.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Культура безсмертних хондроцитов

Для створення перманентних ліній клітин використовують рекомбінантний ДНК або онкогенсодержащіе віруси, здатні зробити клітку «безсмертної». Безсмертні хондроцити мають здатність до нескінченної проліферації, зберігаючи стабільний фенотип. F. Mallein-Gerin і співавтори (1995) показали, що SV40T-онкоген індукує проліферацію хондроцитів миші, які при цьому продовжують стабільно експресувати колаген II, IX і XI типів, а також суглобової аггрекан і сполучний білок. Однак така лінія клітин набуває здатність синтезувати колаген I типу при культивуванні її в монослойной культурі або в агарозному гелі.

W. Horton і співавтори (1988) описали лінію безсмертних клітин з низьким рівнем експресії мРНК колагену II типу. Ці клітини були отримані шляхом їх трансформації ретровирусом миші, що містить I-myc- і у-ra-онкогени. Цей тип клітин представляє собою унікальну модель для вивчення взаємодій суглобового матриксу за відсутності колагену II типу, а також регуляцію синтезу колагену II типу.

Культура хондропітов з мутованими, або віддаленими генами - зручна модель для дослідження їх фізіологічної функції. Ця модель особливо підходить для вивчення ролі специфічних молекул в організації хрящового матриксу або дослідження ефектів різних регуляторних факторів на метаболізм хряща. Хондроцити з віддаленим геном колагену IX типу синтезують колагенові фібрили ширше, ніж нормальні, що свідчить про те, що колаген IX типу регулює діаметр фібрил. Як зазначалося в розділі 1, недавно виявлена мутація гена COLAI, що кодує колаген II типу в сім'ях з первинним генералізований остеоартроз. Для дослідження впливу мутантного колагену II типу на суглобовий матрикс R. Dharmrvaram і співавтори (1997) виконали трансфекцію ( «зараження» чужий нуклеїнової кислотою) дефектного COL ₂ AI (аргінін в положенні 519 замінений на цистеїн) в фетальні хондроцити людини in vitro.

Система кокультур. В суглобі хрящ взаємодіє з клітинами інших типів, що містяться в синовіальній мембрані, синовіальної рідини, зв'язках, субхондральної кістки. На метаболізм хондроцитів можуть впливати різні розчинні фактори, що синтезуються перерахованими клітинами. Так, при артритах суглобовий хрящ руйнується протеолітичними ферментами і вільними радикалами, які виробляються синовіальними клітинами. Тому були розроблені моделі для вивчення складних взаємодій між хрящем і навколишніми тканинами, які отримали назву кокультури.

S. Lacombe-Gleise і співавтори (1995) культивували хондроцити кролика і остеобласти в системі кокультур (COSTAR), в якій клітини були відділені мікропористої мембраною (0,4 мкм), що дозволяла обмін між клітинами двох типів без будь-яких прямих контактів. Це дослідження продемонструвало здатність остеобластів стимулювати зростання хондроцитів за допомогою розчинних медіаторів.

А.М. Malfait і співавтори (1994) досліджували взаємини моноцитів периферичної крові і хондроцитов. Дана модель зручна для вивчення процесів, опосередкованих цитокінами, при запальних артропатиях (ревматоїдний артрит, серонегативні спондилоартрити і ін.). Автори моделі поділяли клітини протеінсвязивающей мембраною з порами діаметром 0,4 мкм. Дослідження показало, що стимульовані ліпополісахаридом моноцити виробляли ІЛ-1 іФНО-а, які гнобили синтез хондроцітамі аггрекана і сприяли деградації вже синтезованих агрегатів аггрекана.

К. Tada і співавтори (1994) створили модель кокультури, в якій ендотеліальні клітини в коллагеновом (I типу) гелі були поміщені у внутрішню камеру, ізольовану від зовнішньої камери з поміщеними в неї хондроцітамі фільтром з розміром пір 0,4 мкм. У стані повної ізоляції від зовнішнього камери ендотеліальні клітини людини утворювали трубки в коллагеновом гелі в присутності ЕФР або ТФР-а. При одночасному культивуванні обох типів клітин ТФР-а залежне утворення трубок ендотеліальними клітинами гнітилося. Пригнічення хондроцітамі цього процесу частково усувалося анти-ТФР-бета антитілами. Можна припустити, що ТФР-бета, що виробляється хондроцітамі, пригнічує васкуляризацию самого хряща.

С. Groot і співавтори (1994) одночасно культивували хондроцити з гіпертрофічною і проліферативної зон кістки 16-денного плода миші з шматочками мозкової тканини. Після 4 днів культивування спостерігали трансдіфференцірованіе хондроцитов в остеобласти і початок формування остеоіда. Через 11 днів культивування частина хряща була заміщена кістковою тканиною і кістковий матрикс був частково кальцифікованими. Деякі нейропептиди і нейротрансмітери, що виробляються тканиною головного мозку, впливають на метаболізм остеобластів або мають рецептори на них. Серед них можна виділити норадреналін, вазоактивний інтестинального пептид, пептид, пов'язаний з геном кальцитоніну, субстанцію P і соматостатин. Культивовані спільно з хондроцітамі шматочки тканини головного мозку можуть виробляти деякі з перерахованих факторів, здатних індукувати процес трансдіфференціровка хондроцитов в остеобласти.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Вплив зовнішніх факторів на культуру хондроцитов

Вплив напруги кисню на метаболізм хондроцитів

У більшості випадків культури хондроцитов розвиваються в умовах атмосферного напруги кисню. Проте добре відомо, що in vivo хондроцити існують в умовах гіпоксії і напруга кисню варіює при різних патологічних станах. Під час процесу дозрівання спостерігають значні зміни кровопостачання епіфізів. Так як васкуляризация варіює в різних зонах пластинки росту, варіює також і напруга кисню в них. С. Brighton і R. Heppenstall (1971) продемонстрували, що в платівці великогомілкової кістки у кроликів напруга кисню в гіпертрофічною зоні менше, ніж в навколишньому її хрящі. Вимірювання деяких параметрів метаболізму показало, що хондроцити здатні швидко реагувати на локальні зміни концентрації кисню. Перш за все, при низькій напрузі кисню знижується його споживання хондроцітамі. При зниженні напруги кисню від 21 до 0,04% збільшується утилізація глюкози, підвищуються активність ферментів гліколізу і синтез молочної кислоти. Навіть при низькій напрузі кисню абсолютна кількість АТФ, АДФ і АМФ залишається стабільним. Ці дані свідчать про спрямованість метаболізму хондроцитів на максимальне збереження енергії. Проте, синтетична активність, а значить, процеси репарації змінюються в умовах гіпоксії.

Висока напруга кисню також впливає на метаболізм хондроцитів, викликаючи зменшення синтезу протеогліканів і ДНК, деградацію матриксу хряща. Ці ефекти, як правило, супроводжуються продукцією вільних кисневих радикалів.

Вплив концентрації іонів і осмотичного тиску навколишнього середовища на функцію хондроцитов

У нативному хрящі концентрація іонів значно відрізняється від такої в інших тканинах: вміст натрію в позаклітинній середовищі становить 250 - 350 ммоль, а її осмолярність - 350-450 мосмоль. При ізолювання хондроцитов з ВКМ і інкубації їх у стандартних середовищах (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium - мінімальна есенціальна середу Дульбекко) осмолярність - 250-280,7 мосмоль) різко змінюється навколишнє клітини середу. Крім того, концентрація кальцію і калію в стандартних середовищах значно нижче, ніж в нативної тканини, а концентрація аніонів - значно вище.

Додавання в середу сахарози призводить до підвищення її осмолярності та індукує минуще внутрішньоклітинний підвищення концентрації Н ⁺ і аніонів кальцію в цитозолі. Подібні внутрішньоклітинні зміни можуть впливати на процеси диференціювання хондроцитів і їх метаболічну активність. J. Urban і співавтори (1993) виявили, що включення ³⁵ 8-сульфату і ³ Н-проліну ізольованими хондроцітамі, інкубіруемой в стандартному середовищі DMEM протягом 2-4 ч, склало лише 10% від такого в нативної тканини. Інтенсивність синтезу досягла максимуму при осмолярності позаклітинного середовища 350-400 мосмоль як в тільки що ізольованих хондроцитах, так і в експлантати хрящової тканини. Більш того, обсяг хондроцитов збільшився на 30-40% після приміщення ізольованих клітин в стандартну середу DMEM зазначеної осмолярності. Однак при культивуванні хондроцитов в умовах нефізіологічна осмолярності протягом 12-16 год клітини адаптуються до нових умов, зменшуючи інтенсивність біосинтезу пропорційно зсуву осмолярності позаклітинного середовища.

P. Borgetti і співавтори (1995) досліджували вплив осмолярності позаклітинного середовища на ріст, морфологію та біосинтез хондроцитов свині. Автори продемонстрували схожі біохімічні та морфологічні особливості хондроцитов, культивованих в середовищах з осмолярністю 0,28 і 0,38 мосмоль. При осмолярності середовища 0,48 мосмоль протягом перших 4-6 год культивування спостерігали зниження проліферації клітин і синтезу білків, однак в подальшому відбувалося відновлення цих параметрів, які врешті-решт досягли контрольних величин. При культивуванні хондроцитов в середовищі з осмолярністю 0,58 мосмоль клітини втрачають здатність підтримувати фізіологічну інтенсивність проліферативних процесів і через 6 днів значно зменшується кількість хондроцитів. При осмолярності середовища 0,58 мосмоль спостерігають глибоке пригнічення синтезу білків. Крім того, при культивуванні в середовищах з осмолярністю 0,28-0,38 мосмоль хондроцити зберігають фізіологічний фенотип, при більш високій осмолярності (0,48-0,58 мосмоль) відбуваються значні зміни морфології клітин, що проявляється втратою характерного фенотипу, перетворенням хондроцитов в фібробластоподібних клітини, а також втратою клітинами здатності до складання матриксних протеогліканів. Результати даного дослідження свідчать про здатність хондроцитів реагувати на обмежені коливання осмолярності позаклітинного середовища.

Зміна концентрації інших іонів також може впливати на процеси біосинтезу в хондроцитах. Так, ступінь включення ³⁵ S (сульфату) збільшується на половину при підвищенні концентрації іонів калію від 5 ммоль (концентрація в стандартному середовищі DM ЕМ) до 10 ммоль (концентрація в ВКМ in vivo). Концентрація кальцію нижче 0,5 ммоль сприяла продукції колагену зрілими хондроцитами бика, тоді як концентрація 1-2 ммоль (відповідає концентрації в стандартному середовищі DM ЕМ) викликала значне зниження синтезу колагену. Помірне збільшення біосинтезу спостерігали при високих рівнях кальцію (2-10 ммоль). Різні катіони беруть участь в прикріпленні хондроцитов до білків ВКМ. Так, іони магнію і марганцю забезпечують прикріплення до фібронектину і колагену II типу, тоді як іони кальцію не беруть участі в прикріпленні хондроцитов до білків. Таким чином, результати описаних досліджень свідчать про вплив змін позаклітинних іонів калію, натрію, кальцію і осмолярності середовища на біосинтетичну функцію хондроцитов, інкубованих в стандартних середовищах.

Вплив механічного стресу на метаболізм хондроцитів

Іммобілізація суглоба викликає оборотну атрофію хряща, що свідчить про необхідність механічних стимулів для нормального протікання метаболічних процесів в ВКМ. У більшості випадків використовуються моделі культур клітин існують в умовах нормального атмосферного тиску. М. Wright і співавтори (1996) показали, що механічне оточення впливає на метаболізм хондроцитів, реакція клітин залежить від інтенсивності і частоти компресійної навантаження. Експерименти з навантаженням на експлантати интактного суглобового хряща in vitro продемонстрували зниження синтезу білків і протеогліканів під дією статичного навантаження, тоді як динамічне навантаження стимулює ці процеси. Точні механізми реалізації впливу механічного навантаження на хрящ складні і, ймовірно, пов'язані з деформацією клітин, гідростатичним тиском, осмотичним тиском, електричним потенціалом і поверхневими клітинними рецепторами до молекул матриксу. Для вивчення впливу кожного з перерахованих параметрів необхідно створити систему, в якій можна незалежно варіювати один параметр. Наприклад, культура експлантати не підходить для дослідження деформації клітин, однак її можна використовувати для вивчення загального впливу тиску на метаболічну активність хондроцитів. Компресія хряща призводить до деформації клітин, а також супроводжується виникненням градієнта гідростатичного тиску, електричного потенціалу, струму рідини і зміною таких фізико-хімічних показників, як вміст води в матриксі, щільність електричного заряду, рівень осмотичного тиску. Деформацію клітин можна вивчити за допомогою ізольованих хондроцитов, занурених в агарозному або колагеновий гель.

Для дослідження впливу механічної стимуляції на культуру хондроцитов розроблені кілька систем. Деякі дослідники використовують для цього системи, в яких тиск додається до культури клітин через газоподібну фазу. Так, JP Veldhuijzen і співавтори (1979), використовуючи тиск вище атмосферного на 13 кПа з низькою частотою (0,3 Гц) протягом 15 хв, спостерігали збільшення синтезу цАМФ і протеогліканів і зниження синтезу ДНК. R. Smith і співавтори (1996) показали, що перемежовується експозиція культури первинних хондроцитів бика гідростатичного тиску (10 МПа) з частотою 1 Гц протягом 4 ч викликала підвищення синтезу аггрекана і колагену II типу, тоді як постійний тиск не впливало на ці процеси. Використовуючи аналогічну систему, М. Wright і співавтори (1996) повідомили, що циклічне тиск на культуру клітин асоціюється з гиперполяризацией клітинної мембрани хондроцитов і активацією Са ²⁺ -залежних калієвих каналів. Таким чином, ефекти циклічного тиску опосредуются іонними каналами, що активуються розтягуванням, в мембрані хондроцитів. Відповідь хондроцитов на гідростатичний тиск залежить від умов культивування клітин і частоти прикладеної навантаження. Так, циклічне гідростатичний тиск (5 МПа) знижує включення сульфату в моношар хондроцитов при частоті 0,05, 0,25 і 0,5 Гц, тоді як при частоті більше 0,5 Гц включення сульфату в експлантати хряща збільшується.

М. Bushmann і співавтори (1992) повідомили, що хондроцити в агарозу-ном гелі змінюють біосинтез у відповідь на статичну і динамічну механічну навантаження так само, як і культивований інтактний орган. Автори виявили, що механічне навантаження генерує гіперосмотичної стимул з подальшим зниженням рН в хондроцитах.

Ефект механічного розтягування можна досліджувати на культурі клітин, занурених в гель. Силу розтягування можна створити за допомогою контрольованого комп'ютером вакууму. Коли система перебуває у вакуумі певною мірою, дно чашки Петрі з культурою клітин подовжується на відому величину, деформація максимальна по краях дна чашки і мінімальна в центрі. Розтягування передається і культивуються в чашці Петрі хондроцитам. За допомогою цього методу К. Holm-vall і співавтори (1995) показали, що в культивованих в коллагеновом (II тип) гелі клітинах хондросаркоми збільшена експресія мРНК а ₂ -інтегріна. А ₂ р _г интегрин здатний зв'язуватися з колагеном II типу. Його розглядають як Механорецептори, оскільки він взаємодіє з актінсвязивающімі протеїнами, таким чином поєднуючи ВКМ і цитоскелет.

Вплив рН на метаболізм хондроцитів

РН інтерстиціальної рідини ВКМ хрящової тканини більш кислий, ніж в інших тканинах. A. Maroudas (1980) визначив рНматрікса суглобового хряща на рівні 6,9. В. Diamant і співавтори (1966) виявили рН 5,5 в патологічних умовах. Відомо, що хондроцити живуть при низькому РО2, що свідчить про найважливішу роль гліколізу (95% всього метаболізму глюкози) в метаболізмі цих клітин; гліколіз супроводжується продукцією великої кількості молочної кислоти.

Крім закислення середовища продуктами гліколізу важливе значення мають самі компоненти матриксу. Велика кількість фіксованого негативного заряду на протеогликанами модифікує позаклітинний іонний склад: відзначаються висока концентрація вільних катіонів (наприклад, Н ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) і низька концентрація аніонів (наприклад, О2, НСОЗ). Крім того, під дією механічного навантаження відбувається вигнання води з ВКМ, що призводить до підвищення концентрації фіксованих негативних зарядів і залученню більшої кількості катіонів в матрикс. Це супроводжується зниженням рН позаклітинного середовища, яке впливає на внутрішньоклітинний рН, модифікуючи тим самим метаболізм хондроцитів. R. Wilkin і A. Hall (1995) вивчили вплив рН позаклітинної і внутрішньоклітинної середовища на біосинтез матриксу ізольованими хондроцітамі бика. Вони спостерігали подвійну модифікацію синтезу матриксу при зниженні рН. Невелике зниження рН (7,4 <рН <7,1) на50% збільшувало включення ³⁵ S0 ₄ і ³ Н-проліну в хондроцити, тоді як більш глибоке закислення середовища (рН <7,1) гнітило синтез на 75% в порівнянні з контролем. Створення ж низького рН (6,65) за допомогою іонів амонію викликало зниження синтезу матриксу тільки на 20%. Отримані результати свідчать про те, що модифікацію рН позаклітинного середовища синтезу матриксу не можна пояснити тільки змінами рН внутрішньоклітинного середовища. Більш того, хондроцити мають здатність регулювати внутрішньоклітинний рН за допомогою Na ⁺, Н ⁺ -обменніка, Ка ⁺ залежного С1 ^_ -НСОЗ -транспортер і Н ⁺ / АТФазой.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Вплив складу середовища для культивування на метаболізм хондроцитів

Середовище для культивування хондроцитов повинна відповідати умовам експерименту. В останні роки для оптимізації умов культивування використовують телячу сироватку. Однак при використанні сироватки необхідно враховувати ряд важливих моментів:

• зовнішній ріст клітин від периферії тканини в культурах органу,
• варіабельність складу сироваток різних серій,
• наявність в них невідомих компонентів,
• підвищений ризик виникнення перешкод, артефактів при дослідженні впливу різних біологічних факторів на метаболічну активність клітин.

Прикладом останнього може служити дослідження впливу ЕФР на хондроцити хряща у щурів. ЕФР стимулював включення ³ Н-тимідину і підвищення вмісту ДНК в культурі. Цей ефект був більш виражений при низьких концентраціях сироватки (<1%), проте при високій концентрації (> 7,5%) ефект зникав.

Добре відомо, що рівні синтезу і деградації в DMEM, збагаченої телячої сироваткою, значно підвищені в порівнянні з умовами in vivo. Відмінності між метаболізмом in vivo і in vitro можуть бути викликані відмінностями між синовіальною рідиною і середовищем, в якій культивуються клітини. D. Lee і співавтори (1997) культивували хондроцити молодих биків в агарозе з використанням живильного середовища, що містить DMEM, збагачену 20% телячої сироваткою і великою кількістю нормальної аллогенной синовіальної рідини. Наявність синовіальної рідини в середовищі индуцировало збільшення кількості протеогліканів, до 80% від загальної кількості синовіальної рідини. Отримані результати свідчать про те, що синовіальна рідина в культурі індукує рівень метаболізму, аналогічний такому in vivo, з високим рівнем синтезу глікозаміногліканів і низьким рівнем поділу клітин.

G. Verbruggen і співавтори (1995) показали, що синтез ³⁵ S-arrpeKaHa хондроцітамі людини, культивованими в агарозе в DMEM без сироватки, склав 20-30% від рівня синтезу, що спостерігається в DMEM, збагаченої 10% телячої сироваткою. Автори визнач ступінь, при якій ІФР-1, ІФР-2, ТФР-Р або інсулін відновлюють продукцію аггрекана в середовищі без сироватки. Автори зробили висновок, що 100 нг / мл інсуліну, ІФР-1 або ІФР-2 частково відновлюють синтез аггрекана до 39-53% від контрольного рівня. При комбінації перерахованих факторів явищ синергізму або кумуляції не виявлено. У той же час 10 нг / мл ТФР-Р при наявності 100 нг / мл інсуліну стимулювали синтез аггрекана до 90% і більше від референтного рівня. І нарешті, трансферин сироватки людини, один або в комбінації з інсуліном, не впливав на синтез аггрекана. При заміні телячої сироватки бичачим сироватковим альбуміном зміст агрегатів аггрекана значно знизилося. Збагачення середовища для культивування інсуліном, ІФР або ТФР-Р частково відновлювало здатність клітин продукувати агрегати аггрекана. При цьому ІФР-1 і інсулін здатні підтримувати гомеостаз в культурах клітин. Після 40 днів культивування в середовищі, збагаченої 10-20 нг / мл ІФР-1, синтез протеогліканів підтримувався на тому ж рівні або навіть на більш високому в порівнянні з середою, що містить 20% телячої сироватки. Катаболические процеси протікали повільніше в середовищі, збагаченої ІФР-1, ніж в середовищі, збагаченої 0,1% розчином альбуміну, але трохи швидше в середовищі, збагаченої 20% сироваткою. У довгостроково живуть культурах 20 нг / мл ІФР-1 підтримує стабільний стан клітин.

D. Lee і співавтори (1993) порівняли вплив складу середовища для культивування (DMEM, DMEM + 20% теляча сироватка, DMEM + 20 нг / мл ІФР-1) на синтез ДНК в культурі експлантати хрящової тканини, монослойной культурі і в суспензії в агарозе . При культивуванні в агарозе в присутності сироватки автори спостерігали тенденцію до групування хондроцитов в великі скупчення. Клітини, які культивуються без сироватки або з ІФР-1, зберігали в агарозе круглу форму, збиралися в невеликі групи, але не формували великі агрегати. У монослое синтез ДНК був значно вище в середовищі, що містить сироватку, ніж в середовищі, збагаченої ІФР-1; синтез ДНК в останній був значно вище, ніж в незбагачений середовищі. При культивуванні хондроцитов у суспензії в агарозе в незбагачений середовищі і в середовищі з ІФР-1 не виявлено відмінностей в синтезі ДНК. У той же час культивування суспензії хондроцитов в агарозе в середовищі, збагаченої сироваткою, супроводжувалося підвищеним включенням радіонуклеотіда ³ Н-тимідину в порівнянні з іншими середовищами.

Вітамін С необхідний для активації ферментів, що беруть участь у формуванні стабільної спіральної структури колагенових фібрил. Хондроцити, дефіцитні щодо аскорбінової кислоти, синтезують недогідроксілірованние неспіральние попередники колагену, які повільно секретируются. Введення аскорбінової кислоти (50 мкг / мл) викликає гідроксилювання колагену II та IX типів і їх секретірованіе в нормальних кількостях. Додавання вітаміну С не впливало на рівень синтезу протеогліканів. Отже, секреція колагену регулюється незалежно від секреції протеогліканів.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]