Гемопоетичні стовбурові клітини жовткового мішка

Очевидно, що різні проліферативні та диференціаційні потенціали гемопоетичних стовбурових клітин визначаються особливостями їх онтогенетичного розвитку, оскільки навіть локалізація основних зон кровотворення змінюється у людини під час онтогенезу. Гемопоетичні клітини-попередники жовткового мішка плода комітуються на формування виключно еритропоетичної клітинної лінії. Після міграції первинних ГСК до печінки та селезінки спектр ліній комітації розширюється в мікрооточенні цих органів. Зокрема, гемопоетичні стовбурові клітини набувають здатності генерувати клітини лімфоїдного ряду. У пренатальному періоді гемопоетичні клітини-попередники досягають зони остаточної локалізації та заселяють кістковий мозок. Під час внутрішньоутробного розвитку кров плода містить значну кількість гемопоетичних стовбурових клітин. Наприклад, на 13-му тижні вагітності рівень ГСК досягає 18% від загальної кількості мононуклеарних клітин крові. Згодом спостерігається прогресуюче зниження їх вмісту, але навіть до народження кількість ГСК у пуповинній крові мало відрізняється від їх кількості в кістковому мозку.

Згідно з класичними уявленнями, природна зміна локалізації кровотворення під час ембріонального розвитку ссавців здійснюється шляхом міграції та впровадження в нове мікросередовище плюрипотентних гемопоетичних стовбурових клітин – з жовткового мішка до печінки, селезінки та кісткового мозку. Оскільки на ранніх стадіях ембріонального розвитку кровотворна тканина містить велику кількість стовбурових клітин, яка зменшується в міру дозрівання плода, найперспективнішою для отримання гемопоетичних стовбурових клітин вважається кровотворна тканина ембріональної печінки, виділена з абортованого матеріалу на 5-8 тижні вагітності.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Питання щодо походження гемопоетичних стовбурових клітин

Немає сумнівів, що ембріональне формування еритроцитів бере свій початок у кров'яних острівцях жовткового мішка. Однак потенціал диференціації in vitro гемопоетичних клітин жовткового мішка дуже обмежений (вони диференціюються переважно в еритроцити). Слід зазначити, що трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка не здатна тривалий час відновлювати кровотворення. Виявилося, що ці клітини не є попередниками дорослих ГСК. Справжні ГСК з'являються раніше, на 3-5-му тижні внутрішньоутробного розвитку, в зоні формування тканини шлунка та ендотелію кровоносних судин (парааортальна спланхноплевра, П-СП), а також на місці аорти, гонад та первинних нирок - у мезонефросі або так званій області АГМ. Було показано, що клітини області АГМ є джерелом не тільки ГСК, але й ендотеліальних клітин кровоносних судин, а також остеокластів, що беруть участь у процесах формування кісткової тканини. На 6-му тижні вагітності ранні гемопоетичні клітини-попередники з області AGM переміщуються до печінки, яка залишається основним гемопоетичним органом плода до народження.

Оскільки цей момент є надзвичайно важливим з точки зору клітинної трансплантації, проблема походження ГСК у процесі ембріогенезу людини заслуговує на більш детальний виклад. Класичні уявлення про те, що гемопоетичні стовбурові клітини ссавців і птахів походять з позаембріонального джерела, базуються на дослідженнях Меткалфа та Мура, які першими застосували методи клонування ГСК та їх нащадків, виділених з жовткового мішка. Результати їхньої роботи послужили основою для теорії міграції, згідно з якою ГСК, вперше з'явившись у жовтковому мішку, послідовно заселяють транзиторні та дефінітивні кровотворні органи в міру формування в них відповідного мікрооточення. Так була встановлена точка зору, що генерація ГСК, спочатку локалізованих у жовтковому мішку, служить клітинною основою дефінітивного кровотворення.

Гемопоетичні клітини-попередники жовткового мішка належать до категорії найдавніших гемопоетичних клітин-попередників. Їхній фенотип описується формулою AA4.1+CD34+c-kit+. На відміну від зрілих ГСК кісткового мозку, вони не експресують антигени Sca-1 та молекули MHC. Здавалося б, поява маркерних антигенів на поверхневих мембранах ГСК жовткового мішка під час культивування відповідає їх диференціації під час ембріонального розвитку з формуванням комітованих гемопоетичних ліній: рівень експресії антигенів CD34 та Thy-1 знижується, експресія CD38 та CD45RA зростає, а також з'являються молекули HLA-DR. З подальшою спеціалізацією in vitro, індукованою цитокінами та факторами росту, починається експресія антигенів, специфічних для гемопоетичних клітин-попередників певної клітинної лінії. Однак результати дослідження ембріонального гемопоезу у представників трьох класів хребетних (земноводних, птахів та ссавців) та, зокрема, аналіз походження ГСК, відповідальних за остаточне гемопоез у постнатальному онтогенезі, суперечать класичним уявленням. Встановлено, що у представників усіх розглянутих класів під час ембріогенезу формуються дві незалежні області, в яких виникають ГСК. Екстраембріональна «класична» область представлена жовтковим мішком або його аналогами, тоді як нещодавно виявлена внутрішньоембріональна зона локалізації ГСК включає парааортальную мезенхіму та область AGM. Сьогодні можна стверджувати, що у амфібій та птахів дефінітивні ГСК походять з внутрішньоембріональних джерел, тоді як у ссавців та людини участь ГСК жовткового мішка в дефінітивному кровотворенні ще не можна повністю виключити.

Ембріональний кровотворення в жовтковому мішку – це, власне, первинний еритропоез, який характеризується збереженням ядра на всіх стадіях дозрівання еритроцитів та синтезом гемоглобіну фетального типу. За останніми даними, хвиля первинного еритропоезу завершується в жовтковому мішку на 8-й день ембріонального розвитку. За ним настає період накопичення остаточних еритроїдних клітин-попередників – КУО-Е, які формуються виключно в жовтковому мішку та вперше з'являються на 9-й день гестації. На наступному етапі ембріогенезу вже сформовані остаточні еритроїдні клітини-попередники – КУО-Е, а також (!) тучні клітини та КУО-ГМ. Це є основою точки зору, що остаточні клітини-попередники виникають у жовтковому мішку, мігрують з кровотоком, осідають у печінці та швидко ініціюють першу фазу внутрішньоембріонального кровотворення. Згідно з цими концепціями, жовтковий мішок можна розглядати, з одного боку, як місце первинного еритропоезу, а з іншого, як перше джерело остаточних гемопоетичних клітин-попередників в ембріональному розвитку.

Було показано, що колонієутворюючі клітини з високим проліферативним потенціалом можуть бути виділені з жовткового мішка вже на 8-й день вагітності, тобто задовго до закриття судинної системи ембріона та жовткового мішка. Більше того, клітини з високим проліферативним потенціалом, отримані з жовткового мішка in vitro, утворюють колонії, розмір та клітинний склад яких не відрізняються від відповідних параметрів культурального росту стовбурових клітин кісткового мозку. Водночас, при ретрансплантації колонієутворюючих клітин жовткового мішка з високим проліферативним потенціалом утворюється значно більше дочірніх колонієутворюючих клітин та мультипотентних клітин-попередників, ніж при використанні клітин-попередників кровотворення кісткового мозку.

Остаточний висновок щодо ролі гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка в остаточному гемопоезі можуть бути надані результатами роботи, в якій автори отримали лінію ендотеліальних клітин жовткового мішка (G166), яка ефективно підтримувала проліферацію своїх клітин з фенотиповими та функціональними характеристиками ГСК (AA4.1+WGA+, низька щільність та слабкі адгезивні властивості). Вміст останніх збільшувався більш ніж у 100 разів при культивуванні на живильному шарі клітин C166 протягом 8 днів. У змішаних колоніях, вирощених на підшарі клітин C166, були ідентифіковані макрофаги, гранулоцити, мегакаріоцити, бластні клітини та моноцити, а також клітини-попередники B- та T-лімфоцитів. Клітини жовткового мішка, що ростуть на підшарі ендотеліальних клітин, мали здатність до самовідтворення та витримували до трьох пасажувань в експериментах авторів. Відновлення кровотворення з їхньою допомогою у статевозрілих мишей з тяжким комбінованим імунодефіцитом (ТКІД) супроводжувалося формуванням усіх типів лейкоцитів, а також Т- та В-лімфоцитів. Однак автори у своїх дослідженнях використовували клітини жовткового мішка 10-денного ембріона, у якого поза- та внутрішньоембріональна судинні системи вже закриті, що не дозволяє виключити наявність внутрішньоембріональних ГСК серед клітин жовткового мішка.

Водночас, аналіз диференціаційного потенціалу гемопоетичних клітин ранніх стадій розвитку, виділених до об'єднання судинних систем жовткового мішка та ембріона (8-8,5 днів гестації), виявив наявність попередників Т- та В-клітин у жовтковому мішку, але не в тілі ембріона. У системі in vitro, методом двостадійного культивування на моношарі епітеліальних та субепітеліальних клітин тимуса, мононуклеарні клітини жовткового мішка диференціювалися на пре-Т- та зрілі Т-лімфоцити. За тих самих умов культивування, але на моношарі стромальних клітин печінки та кісткового мозку, мононуклеарні клітини жовткового мішка диференціювалися на пре-В-клітини та зрілі IglVT-В-лімфоцити.

Результати цих досліджень вказують на можливість розвитку клітин імунної системи з позаембріональної тканини жовткового мішка, а формування первинних Т- та В-клітинних ліній залежить від факторів стромального мікрооточення ембріональних гемопоетичних органів.

Інші автори також показали, що жовтковий мішок містить клітини з потенціалом для лімфоїдної диференціації, а отримані лімфоцити не відрізняються за антигенними характеристиками від таких у статевозрілих тварин. Встановлено, що клітини жовткового мішка 8-9-денного ембріона здатні відновлювати лімфопоез в атимоцитному тимусі з появою зрілих CD3+CD4+- та CD3+CD8+-лімфоцитів, що володіють сформованим репертуаром Т-клітинних рецепторів. Таким чином, тимус може бути заселений клітинами позаембріонального походження, але не можна виключити ймовірну міграцію ранніх клітин-попередників Т-лімфоцитів з внутрішньоембріональних джерел лімфопоезу в тимус.

Водночас, трансплантація гемопоетичних клітин жовткового мішка дорослим опроміненим реципієнтам не завжди призводить до тривалої репопуляції зон локалізації виснаженої гемопоетичної тканини, а клітини жовткового мішка in vitro утворюють значно менше колоній селезінки, ніж клітини області AGM. У деяких випадках, використовуючи клітини жовткового мішка 9-денного ембріона, все ще можливо досягти тривалої (до 6 місяців) репопуляції гемопоетичної тканини у опромінених реципієнтів. Автори вважають, що клітини жовткового мішка з фенотипом CD34+c-kit+ не тільки не відрізняються від клітин з області AGM за здатністю репопулювати виснажені гемопоетичні органи, але й ефективніше відновлюють гемопоез, оскільки жовтковий мішок містить їх майже в 37 разів більше.

Слід зазначити, що в експериментах використовували гемопоетичні клітини жовткового мішка з маркерними антигенами гемопоетичних стовбурових клітин (c-kit+ та/або CD34+ та CD38+), які вводили безпосередньо в печінку або черевну вену потомства самок мишей, які отримали ін'єкцію бусульфану на 18-й день вагітності. У таких новонароджених тварин власний мієлопоез був різко пригнічений через елімінацію гемопоетичних стовбурових клітин, спричинену бусульфаном. Після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка у периферичній крові реципієнтів протягом 11 місяців виявлялися формені елементи, що містять донорський маркер - гліцерофосфатдегідрогеназу. Було виявлено, що ГСК жовткового мішка відновлюють вміст клітин лімфоїдного, мієлоїдного та еритроїдного ряду в крові, тимусі, селезінці та кістковому мозку, причому рівень химеризму був вищим у випадку внутрішньопечінкового, а не внутрішньовенного введення клітин жовткового мішка. Автори вважають, що ГСК жовткового мішка ембріонів на ранніх стадіях (до 10 днів) потребують попередньої взаємодії з гемопоетичним мікрооточенням печінки для успішного заселення гемопоетичних органів дорослих реципієнтів. Можливо, що існує унікальна стадія розвитку в ембріогенезі, коли клітини жовткового мішка, спочатку мігруючи до печінки, потім набувають здатності заселяти строму гемопоетичних органів зрілих реципієнтів.

У зв'язку з цим слід зазначити, що химеризм клітин імунної системи досить часто спостерігається після трансплантації клітин кісткового мозку опроміненим зрілим реципієнтам - у крові останніх клітини донорського фенотипу виявляються у досить великій кількості серед В-, Т-лімфоцитів та гранулоцитів реципієнта, що триває щонайменше 6 місяців.

Гемопоетичні клітини у ссавців вперше виявляються морфологічними методами на 7-й день ембріонального розвитку та представлені гемопоетичними острівцями всередині судин жовткового мішка. Однак природна гемопоетична диференціація в жовтковому мішку обмежується первинними еритроцитами, які зберігають ядра та синтезують фетальний гемоглобін. Тим не менш, традиційно вважалося, що жовтковий мішок служить єдиним джерелом ГСК, що мігрують до кровотворних органів ембріона, що розвивається, та забезпечують остаточне кровотворення у дорослих тварин, оскільки поява ГСК в тілі ембріона збігається із закриттям судинних систем жовткового мішка та ембріона. Цю точку зору підтверджують дані про те, що клітини жовткового мішка при клонуванні in vitro дають початок гранулоцитам та макрофагам, а in vivo – селезінковим колоніям. Потім, у ході трансплантаційних експериментів, було встановлено, що гемопоетичні клітини жовткового мішка, які в самому жовтковому мішку здатні диференціюватися лише в первинні еритроцити, в мікросередовищі печінки новонароджених та дорослих мишей SCID, виснаженого тимуса або стромальної годівниці набувають здатності до репопуляції гемопоетичних органів з відновленням усіх гемопоетичних ліній навіть у дорослих тварин-реципієнтів. В принципі, це дозволяє класифікувати їх як справжні ГСК - як клітини, що функціонують у постнатальному періоді. Передбачається, що жовтковий мішок, разом з областю AGM, служить джерелом ГСК для остаточного гемопоезу у ссавців, але їх внесок у розвиток гемопоетичної системи досі незрозумілий. Біологічний сенс існування двох гемопоетичних органів зі схожими функціями на ранніх стадіях ембріогенезу ссавців також незрозумілий.

Пошуки відповідей на ці питання тривають. In vivo вдалося довести наявність у жовтковому мішку 8-8,5-денних ембріонів клітин, що відновлюють лімфопоез, у сублетально опромінених мишей SCID з вираженим дефіцитом Т- та В-лімфоцитів. Гемопоетичні клітини жовткового мішка вводили як внутрішньочеревно, так і безпосередньо в тканину селезінки та печінки. Через 16 тижнів у реципієнтів були виявлені TCR/CD34 CD4+ та CD8+ Т-лімфоцити та B-220+IgM+ В-лімфоцити, мічені донорськими антргенами MHC. Водночас автори не виявили стовбурових клітин, здатних до такого відновлення імунної системи, в організмі 8-8,5-денних ембріонів.

Гемопоетичні клітини жовткового мішка мають високий проліферативний потенціал і здатні до тривалого самовідтворення in vitro. Деякі автори ідентифікують ці клітини як ГСК на основі тривалої (майже 7 місяців) генерації еритроїдних клітин-попередників, які відрізняються від клітин-попередників кісткового мозку еритроїдного ряду довшим періодом пасажування, більшими розмірами колоній, підвищеною чутливістю до факторів росту та довшою проліферацією. Крім того, за відповідних умов культивування клітин жовткового мішка in vitro утворюються також лімфоїдні клітини-попередники.

Наведені дані загалом дозволяють розглядати жовтковий мішок як джерело ГСК, менш коммітованих і тому володіючих більшим проліферативним потенціалом, ніж стовбурові клітини кісткового мозку. Однак, незважаючи на те, що жовтковий мішок містить плюрипотентні гемопоетичні клітини-попередники, які тривалий час підтримують різні лінії гемопоетичної диференціації in vitro, єдиним критерієм повноти ГСК є їхня здатність до тривалої репопуляції гемопоетичних органів реципієнта, гемопоетичні клітини якого зруйновані або генетично дефектні. Таким чином, ключовим питанням є те, чи можуть плюрипотентні гемопоетичні клітини жовткового мішка мігрувати та заселяти гемопоетичні органи, і чи доцільно переглянути відомі роботи, які демонструють їхню здатність до репопуляції гемопоетичних органів зрілих тварин з формуванням основних гемопоетичних ліній. Внутрішньоембріональні джерела остаточних ГСК були виявлені в ембріонах птахів ще в 1970-х роках, що вже тоді ставило під сумнів усталені уявлення про позаембріональне походження ГСК, у тому числі у представників інших класів хребетних. В останні кілька років з'явилися публікації про наявність подібних внутрішньоембріональних ділянок, що містять ГСК, у ссавців та людини.

Слід ще раз зазначити, що фундаментальні знання в цій галузі є надзвичайно важливими для практичної клітинної трансплантології, оскільки вони допоможуть не лише визначити переважне джерело ГСК, але й встановити особливості взаємодії первинних гемопоетичних клітин з генетично чужорідним організмом. Відомо, що введення гемопоетичних стовбурових клітин печінки плода людини в ембріон вівці на стадії органогенезу призводить до народження химерних тварин, у крові та кістковому мозку яких стабільно визначається від 3 до 5% гемопоетичних клітин людини. При цьому ГСК людини не змінюють свій каріотип, зберігаючи високу швидкість проліферації та здатність до диференціації. Крім того, трансплантовані ксеногенні ГСК не конфліктують з імунною системою та фагоцитами організму-хазяїна та не трансформуються в пухлинні клітини, що лягло в основу інтенсивної розробки методів внутрішньоутробної корекції спадкової генетичної патології з використанням ГСК або ЕСК, трансфікованих дефіцитними генами.

Але на якому етапі ембріогенезу доцільніше проводити таку корекцію? Вперше клітини, визначені для кровотворення, з'являються у ссавців одразу після імплантації (6-й день вагітності), коли морфологічні ознаки кровотворної диференціації та передбачувані кровотворні органи ще відсутні. На цьому етапі дисперговані клітини ембріона миші здатні до репопуляції кровотворних органів опромінених реципієнтів з утворенням еритроцитів та лімфоцитів, що відрізняються від клітин хазяїна відповідно типом гемоглобіну або гліцерофосфатізомерази, а також додатковим хромосомним маркером (Tb) клітин донора. У ссавців, як і у птахів, одночасно з жовтковим мішком, до закриття загального судинного русла, кровотворні клітини з'являються безпосередньо в тілі ембріона в парааортальній спланхноплеврі. Гемопоетичні клітини фенотипу AA4.1+ були виділені з області AGM та охарактеризовані як мультипотентні гемопоетичні клітини, що утворюють Т- та В-лімфоцити, гранулоцити, мегакаріоцити та макрофаги. Фенотипово ці мультипотентні клітини-попередники дуже близькі до ГСК кісткового мозку дорослих тварин (CD34+c-kit+). Кількість мультипотентних клітин AA4.1+ серед усіх клітин області AGM невелика – вони складають не більше 1/12 її частини.

У ембріоні людини також виявлено внутрішньоембріональну область, що містить ГСК, гомологічні області AGM тварин. Більше того, у людини понад 80% мультипотентних клітин з високим проліферативним потенціалом містяться в тілі ембріона, хоча такі клітини також присутні в жовтковому мішку. Детальний аналіз їх локалізації показав, що сотні таких клітин зібрані в компактні групи, які розташовані в безпосередній близькості до ендотелію вентральної стінки дорсальної аорти. Фенотипно це клітини CD34CD45+Lin. Навпаки, у жовтковому мішку, як і в інших кровотворних органах ембріона (печінка, кістковий мозок), такі клітини поодинокі.

Отже, у людському ембріоні область AGM містить кластери гемопоетичних клітин, тісно пов'язаних з вентральним ендотелієм дорсальної аорти. Цей контакт також простежується на імунохімічному рівні – як клітини гемопоетичних кластерів, так і ендотеліальні клітини експресують фактор росту судинного ендотелію, ліганд Flt-3, їх рецептори FLK-1 та STK-1, а також фактор транскрипції лейкемічних стовбурових клітин. В області AGM мезенхімальні похідні представлені щільним тяжем округлих клітин, розташованих уздовж усієї дорсальної аорти та експресують тенасцин С – глікопротеїн основної речовини, який активно бере участь у процесах міжклітинної взаємодії та міграції.

Мультипотентні стовбурові клітини AGM-регіону після трансплантації швидко відновлюють кровотворення у зрілих опромінених мишей та забезпечують ефективне кровотворення протягом тривалого часу (до 8 місяців). Автори не виявили клітин з такими властивостями в жовтковому мішку. Результати цього дослідження підтверджуються даними іншої роботи, яка показала, що в ембріонах ранніх стадій розвитку (10,5 днів) AGM-регіон є єдиним джерелом клітин, що відповідають визначенню HSC, відновлюючи мієлоїдний та лімфоїдний кровотворення у зрілих опромінених реципієнтів.

З області AGM було виділено стромальну лінію AGM-S3, клітини якої підтримують генерацію комітованих клітин-попередників CFU-GM, BFU-E, CFU-E та колонієутворюючих одиниць змішаного типу в культурі. Вміст останніх під час культивування на фідерному підшарі клітин лінії AGM-S3 збільшується від 10 до 80 разів. Таким чином, мікрооточення області AGM містить стромальні клітини основи, які ефективно підтримують кровотворення, тому сама область AGM цілком може виступати в ролі ембріонального кровотворного органу – джерела дефінітивних ГСК, тобто ГСК, що формують кровотворну тканину дорослої тварини.

Розширене імунофенотипування клітинного складу області AGM показало, що вона містить не лише мультипотентні гемопоетичні клітини, а й клітини, комітовані до мієлоїдної та лімфоїдної (Т- та В-лімфоцити) диференціації. Однак молекулярний аналіз окремих CD34+c-kit+ клітин з області AGM за допомогою полімеразної ланцюгової реакції виявив активацію лише генів бета-глобіну та мієлопероксидази, але не лімфоїдних генів, що кодують синтез CD34, Thy-1 та 15. Часткова активація генів, специфічних для лінії, характерна для ранніх онтогенетичних стадій генерації ГСК та клітин-попередників. Враховуючи, що кількість комітованих клітин-попередників в області AGM 10-денного ембріона на 2-3 порядки менша, ніж у печінці, можна стверджувати, що на 10-й день ембріогенезу гемопоез в області AGM тільки починається, тоді як в головному гемопоетичному органі плода в цей період гемопоетичні лінії вже розвинулися.

Дійсно, на відміну від попередніх (9-11 днів) гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка та області AGM, які репопулюють гемопоетичне мікрооточення новонародженого, але не дорослого організму, гемопоетичні клітини-попередники печінки 12-17-денного ембріона вже не потребують раннього постнатального мікрооточення та заселяють гемопоетичні органи дорослої тварини не гірше, ніж новонародженого. Після трансплантації ембріональних ГСК печінки гемопоез у опромінених дорослих мишей-реципієнтів мав поліклональний характер. Крім того, за допомогою мічених колоній було показано, що функціонування прищеплених клонів повністю підпорядковується клональній сукцесії, виявленій у дорослому кістковому мозку. Отже, ембріональні ГСК печінки, мічені в максимально щадних умовах, без попередньої стимуляції екзогенними цитокінами, вже володіють основними ознаками дорослих ГСК: вони не потребують раннього постембріонального мікрооточення, після трансплантації переходять у стан глибокого спокою та послідовно мобілізуються в клональне формування відповідно до моделі клональної сукцесії.

Очевидно, що необхідно детальніше зупинитися на явищі клональної сукцесії. Еритропоез здійснюється гемопоетичними стовбуровими клітинами, які мають високий проліферативний потенціал і здатність диференціюватися у всі лінії комітованих клітин-попередників клітин крові. За нормальної інтенсивності гемопоезу більшість гемопоетичних стовбурових клітин перебувають у стані спокою та мобілізуються для проліферації та диференціації, послідовно утворюючи клони, що замінюють один одного. Цей процес називається клональною сукцесією. Експериментальні докази клональної сукцесії в гемопоетичній системі були отримані в дослідженнях з ГСК, позначеними ретровірусним переносом генів. У дорослих тварин гемопоез підтримується багатьма одночасно функціонуючими гемопоетичними клонами, похідними ГСК. На основі явища клональної сукцесії розроблено репопуляційний підхід до ідентифікації ГСК. Згідно з цим принципом, розрізняють довготривалі гемопоетичні стовбурові клітини (ДГСК), які здатні відновлювати кровотворну систему протягом усього життя, та короткотривалі ГСК, які виконують цю функцію протягом обмеженого періоду часу.

Якщо розглядати гемопоетичні стовбурові клітини з точки зору репопуляційного підходу, то особливістю гемопоетичних клітин ембріональної печінки є їхня здатність створювати колонії, що значно більші за розміром, ніж ті, що знаходяться при зростанні ГСК пуповинної крові або кісткового мозку, і це стосується всіх типів колоній. Сам цей факт свідчить про вищий проліферативний потенціал гемопоетичних клітин ембріональної печінки. Унікальною властивістю гемопоетичних клітин-попередників ембріональної печінки є коротший клітинний цикл порівняно з іншими джерелами, що має велике значення з точки зору ефективності репопуляції гемопоетичних органів під час трансплантації. Аналіз клітинного складу гемопоетичної суспензії, отриманої з джерел зрілого організму, свідчить про те, що на всіх етапах онтогенезу ядерні клітини переважно представлені остаточно диференційованими клітинами, кількість та фенотип яких залежать від онтогенетичного віку донора гемопоетичної тканини. Зокрема, суспензії мононуклеарних клітин кісткового мозку та пуповинної крові складаються з понад 50% зрілих клітин лімфоїдного ряду, тоді як кровотворна тканина ембріональної печінки містить менше 10% лімфоцитів. Крім того, клітини мієлоїдного ряду в ембріональній та фетальній печінці представлені переважно еритроїдним рядом, тоді як у пуповинній крові та кістковому мозку переважають гранулоцитарно-макрофагальні елементи.

Важливо також, що ембріональна печінка містить повний набір найперших гемопоетичних попередників. Серед останніх слід відзначити еритроїдні, гранулопоетичні, мегакаріопоетичні та багатолінійні колонієутворюючі клітини. Їхні більш примітивні попередники – LTC-IC – здатні до проліферації та диференціації in vitro протягом 5 тижнів і більше, а також зберігають функціональну активність після приживлення в організмі реципієнта під час алогенної та навіть ксеногенної трансплантації імунодефіцитним тваринам.

Біологічна доцільність переважання еритроїдних клітин у ембріональній печінці (до 90% від загальної кількості гемопоетичних елементів) зумовлена необхідністю забезпечення еритроцитарною масою швидко зростаючого об'єму крові плода, що розвивається. В ембріональній печінці еритропоез представлений ядерними еритроїдними попередниками різного ступеня зрілості, що містять фетальний гемоглобін (a2u7), який завдяки вищій спорідненості до кисню забезпечує ефективне засвоєння останнього з материнської крові. Інтенсифікація еритропоезу в ембріональній печінці пов'язана з локальним збільшенням синтезу еритропоетину (ЕРО). Примітно, що для реалізації гемопоетичного потенціалу гемопоетичних клітин в ембріональній печінці достатньої присутності еритропоетину, тоді як для залучення ГСК кісткового мозку та пуповинної крові до еритропоезу необхідна комбінація цитокінів та факторів росту, що складається з ЕРО, SCF, GM-CSF та IL-3. Водночас, ранні гемопоетичні клітини-попередники, виділені з ембріональної печінки, які не мають рецепторів до ЕПО, не реагують на екзогенний еритропоетин. Для індукції еритропоезу в суспензії мононуклеарних клітин ембріональної печінки необхідна наявність більш розвинених еритропоетин-чутливих клітин з фенотипом CD34+CD38+, які експресують рецептор ЕПО.

У літературі досі немає єдиної думки щодо розвитку кровотворення в ембріональному періоді. Функціональне значення існування поза- та внутрішньоембріональних джерел гемопоетичних клітин-попередників не встановлено. Однак немає сумнівів, що в ембріогенезі людини печінка є центральним органом кровотворення і в 6-12 тижні вагітності служить основним джерелом гемопоетичних стовбурових клітин, що заселяють селезінку, тимус і кістковий мозок. ГДР забезпечують виконання відповідних функцій у пре- та постнатальний періоди розвитку.

Слід ще раз зазначити, що ембріональна печінка, порівняно з іншими джерелами, характеризується найвищим вмістом ГСК. Приблизно 30% клітин CD344 ембріональної печінки мають фенотип CD38. Водночас кількість лімфоїдних клітин-попередників (CD45+) на ранніх стадіях кровотворення в печінці становить не більше 4%. Встановлено, що в міру розвитку плода, з 7 по 17 тиждень вагітності, кількість В-лімфоцитів прогресивно збільшується з щомісячним «кроком» 1,1%, тоді як рівень ГСК постійно знижується.

Функціональна активність гемопоетичних стовбурових клітин також залежить від періоду ембріонального розвитку їх джерела. Вивчення колонієутворюючої активності клітин печінки ембріонів людини на 6-8 та 9-12 тижнях вагітності під час культивування в напіврідкому середовищі в присутності SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 та EPO показало, що загальна кількість колоній у 1,5 раза вища при висіві ГСК ембріональної печінки на ранніх стадіях розвитку. Водночас кількість мієлопоетичних клітин-попередників, таких як CFU-GEMM, у печінці на 6-8 тижні ембріогенезу більш ніж утричі перевищує їх кількість на 9-12 тижнях вагітності. Загалом, колонієутворююча активність гемопоетичних клітин печінки ембріонів у першому триместрі вагітності була значно вищою, ніж у клітин печінки плода у другому триместрі вагітності.

Наведені вище дані свідчать про те, що ембріональна печінка на початку ембріогенезу відрізняється не лише підвищеним вмістом ранніх гемопоетичних клітин-попередників, але й її гемопоетичні клітини характеризуються ширшим спектром диференціації в різні клітинні лінії. Ці особливості функціональної активності гемопоетичних стовбурових клітин ембріональної печінки можуть мати певне клінічне значення, оскільки їх якісні характеристики дозволяють очікувати вираженого терапевтичного ефекту при трансплантації навіть невеликої кількості клітин, отриманих на ранніх термінах гестації.

Тим не менш, проблема кількості гемопоетичних стовбурових клітин, необхідних для ефективної трансплантації, залишається відкритою та актуальною. Робляться спроби її вирішення, використовуючи високий потенціал самовідтворення гемопоетичних клітин ембріональної печінки in vitro при стимуляції цитокінами та факторами росту. При постійній перфузії ранніх ембріональних ГСК печінки в біореакторі, вже через 2-3 дні можна отримати кількість гемопоетичних стовбурових клітин на виході, що в 15 разів перевищує їх початковий рівень. Для порівняння, слід зазначити, що для досягнення 20-кратного збільшення виходу ГСК пуповинної крові людини за тих самих умов потрібно щонайменше два тижні.

Таким чином, ембріональна печінка відрізняється від інших джерел гемопоетичних стовбурових клітин вищим вмістом як комітованих, так і ранніх гемопоетичних клітин-попередників. У культурі з факторами росту ембріональні клітини печінки з фенотипом CD34+CD45Ra1 CD71l0W утворюють у 30 разів більше колоній, ніж аналогічні клітини пуповинної крові, та у 90 разів більше, ніж ГСК кісткового мозку. Найбільш виражені відмінності у зазначених джерелах полягають у вмісті ранніх гемопоетичних клітин-попередників, які утворюють змішані колонії – кількість КУО-ГЕММ в ембріональній печінці перевищує таку в пуповинній крові та кістковому мозку у 60 та 250 разів відповідно.

Важливо також, що до 18-го тижня ембріонального розвитку (період початку кровотворення в кістковому мозку) понад 60% клітин печінки беруть участь у реалізації кровотворної функції. Оскільки людський плід не має тимуса і, відповідно, тимоцитів до 13-го тижня розвитку, трансплантація гемопоетичних клітин з ембріональної печінки 6-12 тижнів вагітності значно знижує ризик розвитку реакції «трансплантат проти господаря» та не вимагає підбору гістосумісного донора, оскільки дозволяє відносно легко досягти гемопоетичного химеризму.