Гемопоетичні стовбурові клітини

Гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК), як і мезенхімальні клітини-попередники, характеризуються мультипотентні і дають початок клітинним лініях, кінцеві елементи яких утворюють формені елементи крові, а також ряд спеціалізованих тканинних клітин імунної системи.

Гіпотеза про наявність загального попередника всіх клітин крові, як і сам термін "стовбурова клітина", належить А. Максимову (1909). Потенціал утворення клітинної маси у ГСК величезний - стовбурові клітини кісткового мозку щодня продукують 10й клітин, складових формені елементи периферичної крові. Сам факт існування гемопоетичних стовбурових клітин був встановлений в 1961 році в експериментах по відновленню гемопоезу у мишей, які отримали смертельну дозу радіоактивного опромінення, що руйнує стовбурові клітини кісткового мозку. Сел е трансплантації клітин сінгенного кісткового мозку таким летально опроміненим тваринам в селезінці реципієнтів були виявлені дискретні осередки кровотворення, джерело яких - поодинокі клоногенних клітини-попередники.

Потім була доведена здатність гемопоетичних стовбурових клітин до самопідтримки, що забезпечує функцію кровотворення в процесі онтогенезу. У процесі ембріонального розвитку ГСК відрізняються високим міграційним активністю, необхідної для їх переміщення в зони закладки кровотворних органів. Це властивість ГСК зберігають і в онтогенезі - за рахунок їх постійної міграції відбувається перманентне оновлення пулу імунокомпетентних клітин. Здатність ГСК до міграції, проникненню крізь гістогематичні бар'єри, імплантації в тканинах і клоногенних зростання послужила основою для трансплантації клітин кісткового мозку при цілому ряді захворювань, пов'язаних з патологією системи кровотворення.

Як і всі стовбурові клітинні ресурси, гемопоетичні стовбурові клітини присутні у своїй ніші (кістковому мозку) в дуже незначних кількостях, що обумовлює певні труднощі при їх виділенні. Імунофенотипових ГСК людини характеризуються як СD34 + NК-клітини, здатні мігрувати в кровоносне русло і заселяти органи імунної системи або ж репопуліровать строму кісткового мозку. Потрібно чітко уявляти, що ГСК не є найбільш незрілими клітинами кісткового мозку, а походять від попередників, до яких відносять дормантние фібробластоподібних СБ34-негативні клітини. Встановлено, що клітини з фенотипом СD34 здатні до виходу в загальний кровотік, де змінюють свій фенотип на СD34 +, але при зворотної міграції в кістковий мозок під впливом мікрооточення знову стають СD34-негативними стовбуровими клітинними елементами. У стані спокою СD34 ~ -клітини не реагують на паракрінние регуляторні сигнали строми (фактори росту, цитокіни). Однак в ситуаціях, що вимагають посилення інтенсивності кровотворення, стовбурові клітини з фенотипом СD34 відповідають на диференціювальні сигнали утворенням як гемопоетичних, так і мезенхімальних клітин-попередників. Кровотворення здійснюється при безпосередньому контакті ГСК з клітинними елементами строми кісткового мозку, представленої складною мережею макрофагів, ретикулярних ендотеліальних клітин, остеобластів, стромальних фібробластів і позаклітинним матриксом. Стромальна основа кісткового мозку - не тільки лише матриця або "скелет" для гемопоетичних тканини, вона здійснює тонку регуляцію гемопоезу за рахунок паракрінних регуляторних сигналів чинників зростання, цитокінів і хемокінів, а також забезпечує адгезивні взаємодії, необхідні для утворення клітин крові.

Таким чином, в основі постійно оновлюється системи гемопоезу лежить поліпотентні (з точки зору кровотворення) гемопоетичних стовбурових клітина, здатна до тривалого самопідтримки. В процесі коммитирование ГСК піддаються первинної диференціювання і утворюють клони клітин, що відрізняються по цитоморфологічне і імунофенотипових характеристикам. Послідовне формування примітивних і коммітірованних клітин-попередників завершується утворенням морфологічно ідентифікованих клітин-родоначальниць різних гемопоетичних ліній. Результатом подальших етапів складного багатостадійного процесу кровотворення є дозрівання клітин і вихід в периферичну кров зрілих формених елементів - еритроцитів, лейкоцитів, лімфоцитів і тромбоцитів.

[1], [2], [3],

Джерела гемопоетичних стовбурових клітин

Гемопоетичні стовбурові клітини вважаються найбільш вивченим стовбуровим джерелом, що багато в чому пов'язано з їх використанням в клініці при трансплантації кісткового мозку. На перший погляд, про ці клітинах відомо досить багато. В якійсь мірі це відповідає дійсності, оскільки проміжні і зрілі нащадки ГСК - найбільш доступні клітинні елементи, кожен з яких (еритроцити, лейкоцити, лімфоцити, моноцити / макрофаги і тромбоцити) ретельно вивчався на всіх рівнях - від світловий до електронної мікроскопії, від біохімічних і імунофенотипових характеристик до ідентифікації методами ПЛР-аналізу. Однак проведений моніторинг морфологічних, ультраструктурних, біохімічних, імунофенотипових, біофізичних і геномних параметрів ГСК так і не дозволив отримати відповіді на багато проблемних питань, вирішення яких необхідне для розвитку клітинної трансплантології. До сих пір не встановлені механізми стабілізації ГСК в дормантном стані, їх активації, виходу на етап симетричного або асиметричного розподілу, а головне - коммитирование до утворення настільки функціонально різних формених елементів крові, як еритроцити, лейкоцити, лімфоцити і тромбоцити.

Наявність в кістковому мозку клітин з фенотипом СD34, які є родоначальниками як мезенхімальних, так і гемопоетичних стовбурових клітин, поставило питання про існування найбільш ранніх, наближених до СD34-негативним клітинам попередників клітинної диференціювання в стромальних і гемопоетичних лінії. Методом тривалого культивування була отримана так звана довгострокова культура "ініціюють '' клітин (long-term culture-initiating cell - LTC-IC). Час життя таких клітин-попередників з колонієутворюючих активністю на стромальной основі кісткового мозку при певному поєднанні чинників зростання перевищує 5 тижнів, тоді як життєздатність коммітірованних колонієутворюючих одиниць (КУО) в культурі становить всього 3 тижні. В даний час вважається, що LTC-IC - функціональний аналог ГСК, оскільки при високому репопуляціонном потенціал близько 20% LTC-IC характеризуються фенотипом CD34 + CD38- і проявляють високу здатність до самовідновлення. Такі клітини зустрічаються в кістковому мозку людини з частотою 1:50 000. Однак найбільш близькими до ГСК слід визнати міелоідо-лімфоідоініціірующіе клітини, які отримують в умовах довгострокового (15 тижнів) культивування. Такі клітини, позначені як LTC, серед клітин кісткового мозку людини зустрічаються в 10 разів рідше, ніж LTC-IC, і формують клітинні лінії як мієлоїдного, так і лімфоїдного паростків кровотворення.

Хоча маркування гемопоетичних стовбурових клітин за допомогою моноклональних антитіл з подальшою імунофенотипових ідентифікацією є основним методом пізнання і виборчої сортування кровотворних клітин зі стовбурових потенціалом, клінічне застосування виділених таким чином ГСК обмежена. Блокування антитілами рецептора CD34 або інших маркерних антигенів в процесі іммунопозітівного сортінг неминуче втрачає нормальний стан клітини, виділеної з його допомогою. Більш кращим вважається іммунонегатівное виділення ГСК на магнітних колонках. Однак і в цьому випадку для сортування, як правило, використовуються моноклональні антитіла, фіксовані на металевому носії. Крім того, що важливо, обидва методи виділення ГСК засновані на фенотипических, а не на функціональних характеристиках. Тому багато дослідників вважають за краще використовувати аналіз клоногенних параметрів ГСК, що дозволяє за розміром і складом колоній визначити ступінь зрілості і напрямок диференціювання клітин-попередників. Відомо, що в процесі коммитирование кількість клітин і число їх типів в колонії зменшується. Гемопоетичних стовбурових клітина і її рання дочірня клітина, що отримала назву "гранулоцито-еритроцитів-моноцити-мегакаріоцітоколоніеобразующая одиниця" (СFU-GЕММ), створюють в культурі великі мультилинейной колонії, що містять, відповідно, гранулоцити, еритроцити, моноцити і мегакаріоцити. Що знаходиться нижче по лінії коммитирование гранулоцито-моноцітоколоніеобразующая одиниця (СFU-GМ) формує колонії гранулоцитів і макрофагів, а гранулоцитарних колонієутворюючих одиниць (СFU-G) - тільки дрібну колонію зрілих гранулоцитів. Ранній еритроцитарний попередник - бурстообразующая одиниця еритроцитів (СFU-Е) - є джерелом великих, а більш зріла колонієутворюючих одиниць еритроцитів (СFU-Е) - дрібних еритроцитарних колоній. У загальній сукупності, при зростанні клітин на напівтвердих середовищах можна ідентифікувати клітини, що утворюють шість типів мієлоїдних колоній: СFU-GЕММ, СFU-GМ, СFU-G, СFU-М, ВFU-Е і СFU-Е).

Однак крім похідних гемопоезу будь-який вихідний матеріал для виділення ГСК містить значну кількість супутніх клітин. У зв'язку з цим необхідна попередня очистка трансплантата, в першу чергу, від активних клітин імунної системи донора. Зазвичай для цього застосовують іммуноселекцію, засновану на експресії лімфоцитами специфічних антигенів, що дає можливість їх виділяти і видаляти за допомогою моноклональних антитіл. Крім того, розроблена іммунорозеточная методика Т-лімфоцитарного виснаження трансплантата кісткового мозку, яка базується на утворенні комплексів СD4 + -лімфоцитів і специфічних моноклональних антитіл, ефективно видаляються за допомогою аферезу. Дана методика забезпечує отримання очищеного клітинного матеріалу з 40-60% вмістом гемопоетичних стовбурових клітин.

Збільшення числа клітин-попередників за рахунок видалення зрілих формених елементів крові з продукту лейкаферезу досягається шляхом противоточного центрифугування з подальшою фільтрацією (в присутності хелатора - тринатрію цитрату) через колонки, які містять нейлонові волокна, покриті імуноглобуліном людини. Послідовне застосування цих двох методик забезпечує повне очищення трансплантата від тромбоцитів, на 89% - від еритроцитів і на 91% - від лейкоцитів. Завдяки значному зниженню втрат ГСК рівень СD34 + -клітин в загальній клітинної масі вдається підвищити до 50%.

Для функціональної характеристики виділених гемопоетичних стовбурових клітин використовують їх здатність створювати колонії зрілих формених елементів крові в культурі. Аналіз сформованих колоній дозволяє ідентифікувати і кількісно оцінити типи клітин-попередників, ступінь їх коммитирование, а також встановити напрямок їх диференціювання. Клоногенних активність визначається в напівтвердих середовищах на метилцелюлозі, агарі, плазмовому або фібриновими гелі, що знижують міграційну активність клітин, що запобігає їх прикріплення до поверхні скла або пластику. В оптимальних умовах культивування клони з одиночної клітини розвиваються за 7-18 днів. При наявності в клоні менше 50 клітин він ідентифікується як одиночний кластер, якщо число клітин перевищує 50 - як колонія. Враховується кількість клітин, здатних утворити колонію (колонієутворюючих одиниць - КУО або колониеобразующие клітини - КОК). Слід зауважити, що параметри КУО і КОК не відповідають кількості ГСК в клітинній суспензії, хоча і корелює з ним, що ще раз підкреслює необхідність визначення функціональної (колонієутворюючих) активності ГСК in vitro.

Серед клітин кісткового мозку гемопоетичні стовбурові клітини мають найбільш високим проліферативним потенціалом, за рахунок чого формують в культурі найбільші за розміром колонії. За кількістю таких колоній пропонується побічно визначати кількість стовбурових клітин. Після утворення in vitro колоній, що перевищують в діаметрі 0,5 мм і з чисельністю клітин понад 1000, автори провели тестування таких клітин на стійкість до сублетальні дозам 5-фторурацилу і вивчили їх здатність до репопуляціі кісткового мозку смертельно опромінених тварин. За вказаними параметрами виділені клітини майже не відрізнялися від ГСК і отримали абревіатурні символ HPP-CFC - колониеобразующие клітини з високим проліферативним потенціалом.

Пошук можливостей більш якісного виділення гемопоетичних стовбурових клітин триває. Однак стовбурові кровотворні клітини морфологічно подібні лімфоцитів і являють собою відносно однорідну сукупність клітин з майже круглими ядрами, дрібнодисперсним хроматином і невеликою кількістю слабобазофільне цитоплазми. Точна їхня кількість визначити теж складно. Допускається, що ГСК в кістковому мозку людини зустрічаються з частотою 1 на 106 ядерні клітин.

Ідентифікація гемопоетичних стовбурових клітин

Для поліпшення якості ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин проводиться послідовне або одночасне (на багатоканальному сор- тере) дослідження спектру мембранозв антигенів, причому в ГСК фенотип CD34 + CD38 повинен поєднуватися з відсутністю маркерів лінійної диференціювання, особливо антигенів імунокомпетентних клітин, таких як CD4, поверхневі імуноглобуліни і гликофорин.

Практично всі схеми фенотипування гемопоетичних стовбурових клітин включають визначення антигену CD34. Цей глікопротеїдів з молекулярною масою близько 110 кДа, що несе кілька сайтів глікозилювання, експресується на плазматичної клітинній мембрані після активації відповідного гена, локалізованого на 1-й хромосомі. Функція молекули CD34 пов'язана з L-селектінопосредованним взаємодією ранніх клітин-попередників кровотворення зі стромальной основою кісткового мозку. Однак слід пам'ятати, що наявність антигену CD34 на поверхні клітини дозволяє зробити тільки попередню оцінку змісту ГСК в клітинній суспензії, оскільки він експресується і іншими клітинами-попередниками гемопоезу, а також стромальних клітинами кісткового мозку і ендотеліальними клітинами.

В процесі диференціювання гемопоетичних клітин-попередників експресія CD34 перманентно знижується. Еритроцитарні, гранулоцитарні і моноцитарні коммітірованние клітини-попередники або слабо експресують антиген CD34, або він на їх поверхні взагалі відсутній (фенотип CD34). На поверхневій мембрані диференційованих клітин кісткового мозку і зрілих формених елементів крові антиген CD34 не виявляється.

Треба зауважити, що в динаміці диференціювання кровотворних клітин-попередників не тільки знижується рівень експресії CD34, а й паралельно прогресивно підвищується експресія антигену CD38 - інтегрального мембранного гликопротеида з молекулярної масою 46 кДа, що володіє NAD-глікогідролазной і ADP-рібозілціклазной активністю, що передбачає його участь в транспорті і синтезі ADP-рибози. Таким чином, з'являється можливість подвійного контролю ступеня коммитирование кровотворних клітин-попередників. Популяція клітин з фенотипом CD34 + CD38 +, складова від 90 до 99% СD34-позитивних клітин кісткового мозку, містить клітини-попередники з обмеженим проліферативним і дифференцировочного потенціалом, тоді як клітини з фенотипом CD34 + CD38 можуть претендувати на роль ГСК.

Дійсно, популяція клітин кісткового мозку, описувана формулою CD34 + CD38-, містить відносно велику кількість примітивних стовбурових клітин, здатних диференціюватися в мієлоїдному і лимфоидном напрямках. В умовах тривалого культивування клітин з фенотипом CD34 + CD38- вдається отримати все зрілі формені елементи крові: нейтрофіли, еозинофіли, базофіли, моноцити, мегакаріоцити, еритроцити і лімфоцити.

Відносно недавно встановлено, що СD34-позитивні клітини експресують ще два маркера - АС133 і CD90 (Thy-1), які також використовуються для ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин. Антиген Thy-1 коекспрессіруется з рецептором CD117 (c-kit) на СD34 + -клітинах кісткового мозку, пуповинної і периферичної крові. Це поверхневий фосфатіділінозітолсвязивающій глікопротеїн з молекулярною масою 25-35 кДа, який бере участь в процесах клітинної адгезії. Деякі автори вважають, що антиген Thy-1 є маркером найбільш незрілих СD34-позитивних клітин. Самовоспроизводящиеся клітини з фенотипом CD34 + Thy-1 + дають початок тривало культивуються лініях з утворенням дочірніх клітин. Передбачається, що антиген Thy-1 блокує регуляторні сигнали, що викликають зупинку клітинного ділення. Незважаючи на те що СD34 + ТЬу1 +-клітини здатні до самовідтворення і створення тривало культивованих ліній, їх фенотип ніяк не може відноситися тільки до ДСК, оскільки зміст Thy-1 + в загальній масі СD34-позитивних клітинних елементів складає близько 50%, що значно перевищує кількість гемопоетичних клітин.

Більш перспективним для ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин слід визнати АС133 - антигенний маркер клітин-попередників гемопоезу, експресія якого вперше виявлено на клітинах ембріональної печінки. АС133 - трансмембранний гликопротеид, який з'являється на поверхні клітинної мембрани на самих ранніх етапах дозрівання ГСК - не виключено, що навіть раніше, ніж антиген CD34. У дослідженнях А. Петренко, В. Грищенко (2003) встановлено, що АС133 експресують до 30% СD34-позитивних клітин ембріональної печінки.

Таким чином, ідеальний фенотипический профіль гемопоетичних стовбурових клітин, за сьогоднішніми уявленнями, складається з клітинного абрису, в контурах якого повинні бути присутніми конфігурації антигенів CD34, АС133 і Thy-1, але немає місця для молекулярних проекцій CD38, HLA-DR і маркерів лінійної диференціювання GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Варіацією фенотипічного портрета ГСК може бути комбінація CD34 + CD45RalowCD71low, оскільки властивості клітин, описуваних цією формулою, не відрізняються від функціональних параметрів клітин з фенотипом CD34 + CD38. Крім того, ГСК людини можна впізнати по фенотипическим прикметами CD34 + Thy-l + CD38Iow / 'c-kit / low - всього 30 таких клітин повністю відновлюють кровотворення у смертельно опромінених мишей.

З аналізу загальних фенотипічних характеристик клітин кісткового мозку власне і почався 40-літній період інтенсивного дослідження ГСК, одночасно здатних як до самовідтворення, так і до диференціювання в інші клітинні елементи, що дозволило обгрунтувати застосування трансплантації кісткового мозку з метою лікування різної патології системи кровотворення. Відкриті пізніше нові типи стовбурових клітин поки ще широкого застосування в клінічній практиці не отримали. Разом з тим, стовбурові клітини пуповинної (кордової) крові і ембріональної печінки здатні значно розширити масштаби клітинної трансплантації не тільки в гематології, але і в інших областях медицини, оскільки відрізняються від ГСК кісткового мозку як кількісними характеристиками, так і якісними ознаками.

Обсяг стовбурової гемопоетичної клітинної маси, необхідний для трансплантації, зазвичай отримують з кісткового мозку, периферичної та кордової крові, а також з ембріональної печінки. Крім того, клітини-попередники гемопоезу можна отримати in vitro шляхом розмноження ЕСК з подальшою їх спрямованої диференціюванням в кровотворні клітинні елементи. А. Петренко, В. Грищенко (2003) справедливо відзначають істотні відмінності імунологічних властивостей і здатності до відновлення кровотворення ГСК різного походження, що обумовлено неоднаковим співвідношенням містяться в їх джерелах ранніх поліпотентних і пізніх коммітірованних клітин-попередників. Крім того, гемопоетичних стовбурових клітин, отриманих з різних стовбурових джерел, притаманні кількісно і якісно зовсім інші асоціації негемопоетіческіх клітин.

Вже традиційним джерелом гемопоетичних стовбурових клітин є кістковий мозок. Суспензію клітин кісткового мозку отримують з повздошной кістки або грудини методом вимивання під місцевою анестезією. Отримана таким чином суспензія гетерогенна і містить суміш ГСК, стромальних клітинних елементів, коммітірованних клітин-попередників мієлоїдній і лімфоїдної ліній, а також зрілі формені елементи крові. Кількість клітин з фенотипами CD34 + і CD34 + CD38 серед мононуклеарів кісткового мозку становить відповідно 0,5-3,6 і 0-0,5%. Периферична кров після G-CSF-індукованої мобілізації ГСК містить 0,4-1,6% CD34 + і 0-0,4% CD34 + CD38.

Більш високий відсоток клітин з імунофенотипу CD34 + CD38 і CD34 + в пуповинної крові - 0-0,6 і ОД-2,6%, а їх максимальна кількість виявляється серед гемопоетичних клітин ембріональної печінки - 0,2-12,5 і 2,3 -35,8%, відповідно.

Однак якість трансплантованого матеріалу залежить не тільки від кількості містяться в ньому СD34 + -клітин, а й від їх функціональної активності, яку можна оцінити по рівню колоніеобразованія in vivo (репопуляціі кісткового мозку у смертельно опромінених тварин) і in vitro - по зростанню колоній на напіврідких середовищах . Виявилося, що колонієутворюючих і проліферативна активність гемопоетичних клітин-попередників з фенотипом CD34 + CD38 HLA-DR, виділених з ембріональної печінки, фетального кісткового мозку і кордової крові, значно перевищує проліферативний і колонієутворюючих потенціал кровотворних клітин кісткового мозку і периферичної крові дорослої людини. Кількісний та якісний аналіз ГСК різного походження виявив значні відмінності як їх відносного змісту в клітинній суспензії, так і функціональних можливостей. Максимальна кількість СD34 + -клітин (24,6%) виявлено в трансплантаційному матеріалі, отриманому з фетального кісткового мозку. Кістковий мозок дорослої людини містить 2,1% СD34-позитивних клітинних елементів. Серед мононуклеарних клітин периферичної крові дорослої людини всього 0,5% мають фенотип CD34 +, тоді як в кордової крові їх кількість досягає 2%. При цьому колонієутворюючих здатність СD34 + -клітин фетального кісткового мозку в 2,7 рази перевищує можливості клонального зростання кістковомозкових гемопоетичних клітин дорослої людини, а клітини пуповинної крові формують значно більше колоній, ніж кровотворні елементи, виділені з периферичної крові дорослих людей: 65,5 і 40 , 8 колоній / 105 клітин, відповідно.

Відмінності проліферативної активності і колонієутворюючих здібності гемопоетичних стовбурових клітин пов'язані не тільки з різним ступенем їх зрілості, а й з їх природним мікрооточенням. Відомо, що інтенсивність проліферації і швидкість диференціювання стовбурових клітин визначається інтегральним регуляторним впливом багатокомпонентної системи чинників зростання і цитокінів, які продукуються як самими стовбуровими клітинами, так і клітинними елементами їх матриксного-стромального мікрооточення. Використання очищених клітинних популяцій і бессивороточной середовищ з метою культивування клітин дозволило охарактеризувати ростові фактори, які надають стимулюючий і гальмуючий вплив на стовбурові клітини різного рівня, клітини-попередники і клітини, коммітірованние в тому чи іншому лінійному напрямку. Результати проведених досліджень переконливо свідчать про те, що ГСК, отримані з джерел з різним рівнем онтогенетичного розвитку, відрізняються як фенотипически, так і функціонально. Для ГСК, які перебувають на більш ранніх етапах онтогенезу, характерний високий потенціал самовідтворення і висока проліферативна активність. Такі клітини відрізняються більшою довжиною теломер і піддаються коммитирование з утворенням всіх клітинних ліній гемопоезу. Реакція імунної системи на ГСК ембріонального походження відстрочена, так як такі клітини слабо експресують молекули НLА. Існує чітка градація відносного змісту ГСК, їх здатності до самооновлення і кількості утворених ними типів ліній коммитирование: СD34 + -клітини ембріональної печінки> СD34 + -клітини кордової крові> СD34 + -клітини кісткового мозку. Важливо, що такі відмінності притаманні не тільки інтра-, нео- і раннього постанатальному періодів розвитку людини, але і всьому онтогенезу - проліферативна і колонієутворюючих активність ГСК, отриманих з кісткового мозку або периферичної крові дорослої людини, оберненопропорційна віком донора.