Гемопоетичні стовбурові клітини

Гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК), як і мезенхімальні клітини-попередники, характеризуються мультипотентністю та дають початок клітинним лініям, кінцеві елементи яких утворюють формені елементи крові, а також низку спеціалізованих тканинних клітин імунної системи.

Гіпотеза про існування спільного попередника всіх клітин крові, як і сам термін «стовбурова клітина», належить А. Максимову (1909). Потенціал для формування клітинної маси в ГСК величезний – стовбурові клітини кісткового мозку щодня продукують 10 клітин, що складають формені елементи периферичної крові. Сам факт існування гемопоетичних стовбурових клітин був встановлений у 1961 році в експериментах з відновлення кровотворення у мишей, які отримали летальну дозу радіоактивного опромінення, що руйнує стовбурові клітини кісткового мозку. Після трансплантації сингенних клітин кісткового мозку таким летально опроміненим тваринам у селезінці реципієнтів були виявлені дискретні вогнища кровотворення, джерелом яких були поодинокі клоногенні клітини-попередники.

Тоді було доведено здатність гемопоетичних стовбурових клітин до самопідтримки, забезпечуючи функцію кровотворення в процесі онтогенезу. У процесі ембріонального розвитку ГСК відрізняються високою міграційною активністю, необхідною для їх переміщення до зон формування кровотворних органів. Ця властивість ГСК зберігається і в онтогенезі – завдяки їхній постійній міграції відбувається постійне оновлення пулу імунокомпетентних клітин. Здатність ГСК до міграції, проникнення через гістогематичні бар'єри, імплантації в тканини та клоногенного росту послужила основою для трансплантації клітин кісткового мозку при низці захворювань, пов'язаних з патологією кровотворної системи.

Як і всі ресурси стовбурових клітин, гемопоетичні стовбурові клітини присутні у своїй ніші (кістковому мозку) у дуже малих кількостях, що викликає певні труднощі в їх виділенні. Імунофенотипово ГСК людини характеризуються як CD34+NK-клітини, здатні мігрувати в кровотік і заселяти органи імунної системи або репопулювати строму кісткового мозку. Слід чітко розуміти, що ГСК не є найнезрілішими клітинами кісткового мозку, а походять від попередників, до яких належать сплячі фібробластоподібні CD34-негативні клітини. Встановлено, що клітини з фенотипом CD34 здатні потрапляти в загальний кровотік, де змінюють свій фенотип на CD34+, але при зворотній міграції в кістковий мозок, під впливом мікрооточення, знову стають CD34-негативними елементами стовбурових клітин. У стані спокою CD34~-клітини не реагують на паракринні регуляторні сигнали строми (фактори росту, цитокіни). Однак, у ситуаціях, що потребують підвищеної інтенсивності гемопоезу, стовбурові клітини з фенотипом CD34 реагують на сигнали диференціації, утворюючи як гемопоетичні, так і мезенхімальні клітини-попередники. Гемопоез відбувається шляхом безпосереднього контакту ГСК з клітинними елементами строми кісткового мозку, представленими складною мережею макрофагів, ретикулярних ендотеліальних клітин, остеобластів, стромальних фібробластів та позаклітинного матриксу. Стромальна основа кісткового мозку є не просто матриксом або «скелетом» для гемопоетичної тканини; вона здійснює тонку регуляцію гемопоезу завдяки паракринним регуляторним сигналам факторів росту, цитокінів та хемокінів, а також забезпечує адгезивні взаємодії, необхідні для утворення клітин крові.

Таким чином, постійно оновлювана система кровотворення базується на поліпотентній (з точки зору кровотворення) гемопоетичній стовбуровій клітині, здатній до тривалого самопідтримки. У процесі комітіації ГСК зазнають первинної диференціації та утворюють клони клітин, що відрізняються цитоморфологічними та імунофенотипічними характеристиками. Послідовне формування примітивних та комітованих клітин-попередників завершується формуванням морфологічно ідентифікованих клітин-попередників різних гемопоетичних ліній. Результатом наступних етапів складного багатоетапного процесу кровотворення є дозрівання клітин та вивільнення зрілих формених елементів у периферичну кров – еритроцитів, лейкоцитів, лімфоцитів та тромбоцитів.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Джерела гемопоетичних стовбурових клітин

Гемопоетичні стовбурові клітини вважаються найбільш вивченим джерелом стовбурових клітин, що значною мірою пов'язано з їх клінічним використанням у трансплантації кісткового мозку. На перший погляд, про ці клітини відомо досить багато. Певною мірою це правда, оскільки проміжні та зрілі нащадки ГСК є найбільш доступними клітинними елементами, кожен з яких (еритроцити, лейкоцити, лімфоцити, моноцити/макрофаги та тромбоцити) був ретельно вивчений на всіх рівнях - від світлової до електронної мікроскопії, від біохімічних та імунофенотипових характеристик до ідентифікації методами ПЛР-аналізу. Однак моніторинг морфологічних, ультраструктурних, біохімічних, імунофенотипових, біофізичних та геномних параметрів ГСК не дав відповідей на багато проблемних питань, вирішення яких необхідне для розвитку клітинної трансплантології. Механізми стабілізації гемопоетичних стовбурових клітин у стані спокою, їх активації, вступу в стадію симетричного або асиметричного поділу, а головне, прихильності до формування таких функціонально різних формених елементів крові, як еритроцити, лейкоцити, лімфоцити та тромбоцити, досі не встановлені.

Наявність у кістковому мозку клітин із фенотипом CD34, які є попередниками як мезенхімальних, так і гемопоетичних стовбурових клітин, порушила питання про існування найдавніших попередників клітинної диференціації в стромальні та гемопоетичні лінії, близьких до CD34-негативних клітин. За допомогою методу тривалого культивування було отримано так звані довгострокові клітини, що ініціюють культивування (LTC-IC). Тривалість життя таких клітин-попередників з колонієутворюючою активністю на стромальній основі кісткового мозку з певною комбінацією факторів росту перевищує 5 тижнів, тоді як життєздатність комітованих колонієутворюючих одиниць (КУО) у культурі становить лише 3 тижні. Наразі LTC-IC вважається функціональним аналогом ГСК, оскільки з високим потенціалом репопуляції близько 20% LTC-IC характеризуються фенотипом CD34+CD38- та демонструють високу здатність до самооновлення. Такі клітини зустрічаються в кістковому мозку людини з частотою 1:50 000. Однак, найближчими до ГСК слід визнати мієлоїд-лімфоїд-ініціаторні клітини, отримані за тривалих (15 тижнів) умов культивування. Такі клітини, позначені як LTC, належать до клітин кісткового мозку людини, зустрічаються в 10 разів рідше, ніж LTC-IC, та утворюють клітинні лінії як мієлоїдного, так і лімфоїдного гемопоетичних ліній.

Хоча мічення гемопоетичних стовбурових клітин моноклональними антитілами з подальшою імунофенотиповою ідентифікацією є основним методом розпізнавання та селективного сортування гемопоетичних клітин зі стовбуровим потенціалом, клінічне застосування виділених таким чином ГСК обмежене. Блокування рецептора CD34 або інших маркерних антигенів антитілами під час імунопозитивного сортування неминуче змінює властивості клітини, виділеної з його допомогою. Імунонегативна ізоляція ГСК на магнітних колонках вважається більш кращою. Однак у цьому випадку для сортування зазвичай використовуються моноклональні антитіла, фіксовані на металевому носії. Крім того, що важливо, обидва методи ізоляції ГСК базуються на фенотипових, а не функціональних характеристиках. Тому багато дослідників віддають перевагу аналізу клоногенних параметрів ГСК, що дозволяє визначити ступінь зрілості та напрямок диференціації клітин-попередників за розміром та складом колоній. Відомо, що в процесі комітіації кількість клітин та їх типи в колонії зменшуються. Гемопоетична стовбурова клітина та її рання дочірня клітина, що називається «колонієутворювальною одиницею гранулоцитар-еритроцит-моноцитар-мегакаріоцитар» (КУО-ГЕММ), створюють у культурі великі багатолінійні колонії, що містять гранулоцити, еритроцити, моноцити та мегакаріоцити відповідно. Колонієутворювальна одиниця гранулоцитар-моноцитар (КУО-ГМ), розташована нижче за течією вздовж лінії зв'язування, утворює колонії гранулоцитів та макрофагів, а колонієутворювальна одиниця гранулоцитів (КУО-Г) утворює лише невелику колонію зрілих гранулоцитів. Ранній попередник еритроцитів, одиниця еритроцитів, що формується у вигляді розриву (КУО-Е), є джерелом великих колоній еритроцитів, а більш зріла колонієутворювальна одиниця еритроцитів (КУО-Е) є джерелом малих колоній еритроцитів. Загалом, коли клітини ростуть на напівтвердих середовищах, можна ідентифікувати клітини, які утворюють шість типів мієлоїдних колоній: КУО-ГЕММ, КУО-ГМ, КУО-Г, КУО-М, БКУ-Е та КУО-Е).

Однак, окрім гемопоетичних похідних, будь-який вихідний матеріал для виділення ГСК містить значну кількість супутніх клітин. У зв'язку з цим необхідне попереднє очищення трансплантата, перш за все, від активних клітин імунної системи донора. Зазвичай для цього використовується імуноселекції, заснованої на експресії специфічних антигенів лімфоцитами, що дає змогу виділити та видалити їх за допомогою моноклональних антитіл. Крім того, розроблено імунорозетковий метод виснаження Т-лімфоцитів трансплантата кісткового мозку, який базується на утворенні комплексів CD4+ лімфоцитів та специфічних моноклональних антитіл, ефективно видаляються за допомогою аферезу. Цей метод забезпечує отримання очищеного клітинного матеріалу з 40-60% вмістом гемопоетичних стовбурових клітин.

Збільшення кількості клітин-попередників за рахунок видалення зрілих формених елементів крові з продукту лейкаферезу досягається протитечійним центрифугуванням з подальшою фільтрацією (у присутності хелатора - тринатрійцитрату) через колонки, що містять нейлонові волокна, покриті людським імуноглобуліном. Послідовне використання цих двох методів забезпечує повне очищення трансплантата від тромбоцитів, на 89% від еритроцитів та на 91% від лейкоцитів. Завдяки значному зменшенню втрат ГСК рівень CD34+ клітин у загальній клітинній масі може бути підвищений до 50%.

Здатність ізольованих гемопоетичних стовбурових клітин утворювати колонії зрілих клітин крові в культурі використовується для функціональної характеристики клітин. Аналіз утворених колоній дозволяє ідентифікувати та кількісно визначити типи клітин-попередників, ступінь їхньої прихильності та встановити напрямок їхньої диференціації. Клоногенну активність визначають у напівтвердих середовищах на метилцелюлозі, агарі, плазмі або фібриновому гелі, які знижують міграційну активність клітин, запобігаючи їх прикріпленню до поверхні скла або пластику. За оптимальних умов культивування клони розвиваються з однієї клітини протягом 7-18 днів. Якщо клон містить менше 50 клітин, його ідентифікують як один кластер; якщо кількість клітин перевищує 50, його ідентифікують як колонію. Враховується кількість клітин, здатних утворювати колонію (колонієутворюючі одиниці - КУО або колонієутворюючі клітини - КОК). Слід зазначити, що параметри КУО та КОК не відповідають кількості ГСК у клітинній суспензії, хоча й корелюють з нею, що ще раз підкреслює необхідність визначення функціональної (колоніоутворюючої) активності ГСК in vitro.

Серед клітин кісткового мозку гемопоетичні стовбурові клітини мають найвищий проліферативний потенціал, завдяки чому вони утворюють найбільші колонії в культурі. Запропоновано за кількістю таких колоній опосередковано визначати кількість стовбурових клітин. Після утворення колоній in vitro, що перевищують 0,5 мм у діаметрі та мають кількість клітин понад 1000, автори протестували такі клітини на стійкість до сублетальних доз 5-фторурацилу та вивчили їх здатність репопулювати кістковий мозок летально опромінених тварин. За заданими параметрами виділені клітини майже не відрізнялися від ГСК та отримали абревіатуру HPP-CFC - колонієутворюючі клітини з високим проліферативним потенціалом.

Пошуки способів кращої якості виділення гемопоетичних стовбурових клітин тривають. Однак гемопоетичні стовбурові клітини морфологічно подібні до лімфоцитів і являють собою відносно однорідний набір клітин з майже круглими ядрами, дрібнодисперсним хроматином та невеликою кількістю слабобазофільної цитоплазми. Їх точну кількість також важко визначити. Вважається, що ГСК у кістковому мозку людини зустрічаються з частотою 1 на 106 ядерних клітин.

Ідентифікація гемопоетичних стовбурових клітин

Для покращення якості ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин проводиться послідовне або одночасне (на багатоканальному сортувальнику) дослідження спектру мембранозв'язаних антигенів, причому в ГСК фенотип CD34+CD38 повинен поєднуватися з відсутністю маркерів лінійної диференціації, особливо антигенів імунокомпетентних клітин, таких як CD4, поверхневі імуноглобуліни та глікофорин.

Майже всі схеми фенотипування гемопоетичних стовбурових клітин включають визначення антигену CD34. Цей глікопротеїн з молекулярною масою близько 110 кДа, що несе кілька сайтів глікозилювання, експресується на мембрані плазматичних клітин після активації відповідного гена, локалізованого на хромосомі 1. Функція молекули CD34 пов'язана з L-селектин-опосередкованою взаємодією ранніх гемопоетичних клітин-попередників зі стромальною основою кісткового мозку. Однак слід пам'ятати, що присутність антигену CD34 на поверхні клітин дозволяє лише попередню оцінку вмісту ГСК у клітинній суспензії, оскільки він також експресується іншими гемопоетичними клітинами-попередниками, а також стромальними клітинами кісткового мозку та ендотеліальними клітинами.

Під час диференціації гемопоетичних клітин-попередників експресія CD34 постійно знижується. Еритроцитарні, гранулоцитарні та моноцитарні комітовані клітини-попередники або слабо експресують антиген CD34, або взагалі не експресують його на своїй поверхні (фенотип CD34). Антиген CD34 не виявляється на поверхневій мембрані диференційованих клітин кісткового мозку та зрілих клітин крові.

Слід зазначити, що в динаміці диференціації гемопоетичних клітин-попередників не тільки знижується рівень експресії CD34, але й прогресивно зростає експресія антигену CD38 – інтегрального мембранного глікопротеїну з молекулярною масою 46 кДа, який має NAD-глікогідролазну та ADP-рибозилциклазну активність, що свідчить про його участь у транспорті та синтезі ADP-рибози. Таким чином, з'являється можливість подвійного контролю ступеня коммітації гемопоетичних клітин-попередників. Популяція клітин з фенотипом CD34+CD38+, яка становить від 90 до 99% CD34-позитивних клітин кісткового мозку, містить клітини-попередники з обмеженим проліферативним та диференціюючим потенціалом, тоді як клітини з фенотипом CD34+CD38 можуть претендувати на роль ГСК.

Дійсно, популяція клітин кісткового мозку, що описується формулою CD34+CD38-, містить відносно велику кількість примітивних стовбурових клітин, здатних диференціюватися в мієлоїдному та лімфоїдному напрямках. За умов тривалого культивування клітин з фенотипом CD34+CD38- можна отримати всі зрілі формені елементи крові: нейтрофіли, еозинофіли, базофіли, моноцити, мегакаріоцити, еритроцити та лімфоцити.

Відносно нещодавно було встановлено, що CD34-позитивні клітини експресують ще два маркери – AC133 та CD90 (Thy-1), які також використовуються для ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин. Антиген Thy-1 коекспресується з рецептором CD117 (c-kit) на CD34+ клітинах кісткового мозку, пуповини та периферичної крові. Це поверхневий фосфатидилінозитол-зв'язуючий глікопротеїн з молекулярною масою 25-35 кДа, який бере участь у процесах клітинної адгезії. Деякі автори вважають, що антиген Thy-1 є маркером найбільш незрілих CD34-позитивних клітин. Самовідтворювані клітини з фенотипом CD34+Thy-1+ дають початок довгостроково культивованим лініям з утворенням дочірніх клітин. Передбачається, що антиген Thy-1 блокує регуляторні сигнали, що викликають зупинку поділу клітин. Незважаючи на те, що CD34+Thy1+ клітини здатні до саморозмноження та створення довготривалих культивованих ліній, їхній фенотип не можна віднести виключно до ГСК, оскільки вміст Thy-1+ у загальній масі CD34-позитивних клітинних елементів становить близько 50%, що значно перевищує кількість гемопоетичних клітин.

Більш перспективним для ідентифікації гемопоетичних стовбурових клітин слід визнати AC133 – антигенний маркер гемопоетичних клітин-попередників, експресія якого вперше була виявлена на ембріональних клітинах печінки. AC133 – це трансмембранний глікопротеїн, що з'являється на поверхні клітинної мембрани на найдавніших стадіях дозрівання ГСК – можливо, що навіть раніше, ніж антиген CD34. У дослідженнях А. Петренка, В. Грищенка (2003) було встановлено, що AC133 експресується до 30% CD34-позитивних ембріональних клітин печінки.

Таким чином, ідеальний фенотипічний профіль гемопоетичних стовбурових клітин, згідно з сучасними уявленнями, складається з клітинного контуру, контури якого повинні включати конфігурації антигенів CD34, AC133 та Thy-1, але немає місця для молекулярних проекцій CD38, HLA-DR та маркерів лінійної диференціації GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Варіацією фенотипового портрета ГСК може бути комбінація CD34+CD45RalowCD71low, оскільки властивості клітин, описані цією формулою, не відрізняються від функціональних параметрів клітин з фенотипом CD34+CD38. Крім того, ГСК людини можна ідентифікувати за фенотиповими ознаками CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low - лише 30 таких клітин повністю відновлюють кровотворення у летально опромінених мишей.

40-річний період інтенсивних досліджень ГСК, здатних як до самовідтворення, так і до диференціації в інші клітинні елементи, розпочався з аналізу загальних фенотипових характеристик клітин кісткового мозку, що дозволило обґрунтувати використання трансплантації кісткового мозку для лікування різних патологій кровотворної системи. Нові типи стовбурових клітин, відкриті пізніше, ще не знайшли широкого застосування в клінічній практиці. Водночас стовбурові клітини пуповинної крові та ембріональної печінки здатні значно розширити масштаби клітинної трансплантації не лише в гематології, а й в інших галузях медицини, оскільки вони відрізняються від ГСК кісткового мозку як за кількісними характеристиками, так і за якісними ознаками.

Обсяг маси гемопоетичних стовбурових клітин, необхідний для трансплантації, зазвичай отримують з кісткового мозку, периферичної та пуповинної крові, а також ембріональної печінки. Крім того, гемопоетичні клітини-попередники можна отримати in vitro шляхом розмноження ембріональних стволових клітин (ЕСК) з їх подальшою спрямованою диференціацією в гемопоетичні клітинні елементи. А. Петренко, В. Грищенко (2003) справедливо відзначають суттєві відмінності в імунологічних властивостях та здатності відновлювати гемопоез ГСК різного походження, що зумовлено неоднаковим співвідношенням ранніх плюрипотентних та пізньокомітованих клітин-попередників, що містяться в їхніх джерелах. Крім того, гемопоетичні стовбурові клітини, отримані з різних стовбурових джерел, характеризуються кількісно та якісно абсолютно різними асоціаціями негемопоетичних клітин.

Кістковий мозок вже став традиційним джерелом гемопоетичних стовбурових клітин. Суспензію клітин кісткового мозку отримують з клубової кістки або грудини шляхом промивання під місцевою анестезією. Отримана таким чином суспензія є гетерогенною та містить суміш ГСК, елементів стромальних клітин, комітованих клітин-попередників мієлоїдного та лімфоїдного ліній, а також зрілих формених елементів крові. Кількість клітин з фенотипами CD34+ та CD34+CD38 серед мононуклеарних клітин кісткового мозку становить 0,5-3,6 та 0-0,5% відповідно. Периферична кров після мобілізації ГСК, індукованої G-CSF, містить 0,4-1,6% CD34+ та 0-0,4% CD34+CD38.

Відсоток клітин з імунофенотипами CD34+CD38 та CD34+ вищий у пуповинній крові – 0-0,6 та 1-2,6%, а максимальна їх кількість виявляється серед гемопоетичних клітин ембріональної печінки – 0,2-12,5 та 2,3-35,8% відповідно.

Однак, якість трансплантованого матеріалу залежить не лише від кількості CD34+ клітин, які він містить, але й від їхньої функціональної активності, яку можна оцінити за рівнем колоніоутворення in vivo (репопуляція кісткового мозку у летально опромінених тварин) та in vitro – за ростом колоній на напіврідких середовищах. Виявилося, що колонієутворююча та проліферативна активність гемопоетичних клітин-попередників з фенотипом CD34+CD38 HLA-DR, виділених з ембріональної печінки, фетального кісткового мозку та пуповинної крові, значно перевищує проліферативний та колонієутворюючий потенціал гемопоетичних клітин кісткового мозку та периферичної крові дорослої людини. Кількісний та якісний аналіз ГСК різного походження виявив суттєві відмінності як у їх відносному вмісті в клітинній суспензії, так і у функціональних можливостях. Максимальна кількість CD34+ клітин (24,6%) виявлена в трансплантованому матеріалі, отриманому з фетального кісткового мозку. Кістковий мозок дорослої людини містить 2,1% CD34-позитивних клітинних елементів. Серед мононуклеарних клітин периферичної крові дорослої людини лише 0,5% мають фенотип CD34+, тоді як у пуповинній крові їх кількість сягає 2%. Водночас, колонієутворювальна здатність CD34+ клітин кісткового мозку плода у 2,7 раза вища, ніж клональна ростова здатність гемопоетичних клітин кісткового мозку дорослої людини, а клітини пуповинної крові утворюють значно більше колоній, ніж гемопоетичні елементи, виділені з периферичної крові дорослих: 65,5 та 40,8 колоній/105 клітин відповідно.

Відмінності в проліферативній активності та колонієутворювальній здатності гемопоетичних стовбурових клітин пов'язані не лише з різним ступенем їхньої зрілості, але й з їхнім природним мікрооточенням. Відомо, що інтенсивність проліферації та швидкість диференціації стовбурових клітин визначаються інтегральним регуляторним ефектом багатокомпонентної системи факторів росту та цитокінів, які продукуються як самими стовбуровими клітинами, так і клітинними елементами їх матрикс-стромального мікрооточення. Використання очищених клітинних популяцій та безсироваткових середовищ для культивування клітин дозволило охарактеризувати фактори росту, що мають стимулюючий та інгібуючий вплив на стовбурові клітини різного рівня, клітини-попередники та клітини, що коммітовані в тому чи іншому лінійному напрямку. Результати досліджень переконливо свідчать про те, що ГСК, отримані з джерел з різним рівнем онтогенетичного розвитку, відрізняються як фенотипічно, так і функціонально. ГСК на ранніх стадіях онтогенезу характеризуються високим потенціалом самовідтворення та високою проліферативною активністю. Такі клітини вирізняються довшими теломерами та зазнають комімітації для формування всіх гемопоетичних клітинних ліній. Реакція імунної системи на ГСК ембріонального походження є затримкою, оскільки такі клітини слабо експресують молекули HLA. Спостерігається чітка градація відносного вмісту ГСК, їхньої здатності до самооновлення та кількості типів ліній коміті, які вони утворюють: CD34+ клітини ембріональної печінки > CD34+ клітини пуповинної крові > CD34+ клітини кісткового мозку. Важливо, що такі відмінності притаманні не лише інтра-, нео- та ранньому постнатальному періодам розвитку людини, а й усьому онтогенезу – проліферативна та колонієутворююча активність ГСК, отриманих з кісткового мозку або периферичної крові дорослої людини, обернено пропорційна віку донора.