Нейральні стовбурові клітини

Експериментальні докази можливості регенерації клітин ЦНС були отримані набагато раніше за відкриття ембріональних стовбурових клітин у дослідженнях, які показали наявність клітин у неокортексі, гіпокампі та нюхових цибулинах мозку дорослих щурів, що захоплюють 3H-тимідин, тобто здатні до синтезу білка та поділу. Ще в 60-х роках минулого століття передбачалося, що ці клітини є попередниками нейронів і безпосередньо беруть участь у процесах навчання та пам'яті. Трохи пізніше була виявлена наявність синапсів на нейронах, що утворюються de novo, і з'явилися перші роботи з використання ембріональних стовбурових клітин з метою індукції нейрогенезу in vitro. Наприкінці 20 століття експерименти зі спрямованою диференціацією ЕСК у нейронні клітини-попередники, дофамінергічні та серотонінергічні нейрони призвели до перегляду класичних уявлень про здатність нервових клітин ссавців до регенерації. Результати численних досліджень переконливо довели як реальність перебудови нейронних мереж, так і наявність нейрогенезу протягом усього періоду постнатального життя організму ссавців.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Джерела нейронних стовбурових клітин

Нейронні стовбурові клітини людини виділяють під час операцій на субшлуночковій ділянці бічних шлуночків та зубчастій звивині гіпокампу, клітини яких утворюють у культурі нейросфери (нейронні сфери), а після диспергування та преформування останніх - усі основні типи клітин центральної нервової системи або, у спеціальному середовищі, нові мікросфери. У суспензійних культурах дисоційованої тканини, виділеної з перивентрикулярних ділянок ембріонального мозку, також виникають нейросфери.

Маркери незрілих клітин мозку включають нестин, бета-тубулін III (маркер нейронної лінії), віментин, GFAP та NCAM, які ідентифікуються імуноцитохімічно за допомогою моноклональних антитіл. Нестин (проміжний білок нейрофіламенту типу IV) експресується мультипотентними нейроектодермальними клітинами. Цей білок використовується для ідентифікації та виділення мультипотентних нейроепітеліальних клітин-попередників із ЦНС за допомогою моноклональних антитіл Rat-401, які можуть виявляти до 95% клітин нервової трубки у ембріонів щурів на одинадцятий день вагітності. Нестин не експресується на диференційованих нащадках нервових стовбурових клітин, але присутній у ранніх нейронних клітинах-попередниках, постмітотичних нейронах та ранніх нейробластах. Цей маркер використовувався для ідентифікації нейроепітеліальних клітин-попередників та для доказу існування стовбурових клітин у ЦНС. Віментин (проміжний білок нейрофіламенту типу III) експресується нервовими та гліальними клітинами-попередниками, а також нейронами, фібробластами та клітинами гладких м'язів. Отже, обом імуноцитохімічним маркерам бракує специфічності, необхідної для окремої ідентифікації нервових стовбурових та прогениторних клітин. Бета-тубулін III встановлює нейрональний напрямок диференціації стовбурових клітин, тоді як астроцити I типу ідентифікуються за експресією GFAP, а олігодендроцити специфічно експресують галактоцереброзид (Ga!C).

FGF2 та EGF служать мітогенами для нейронних клітин-попередників, підтримуючи проліферацію недиференційованих клітин-попередників у культурі з утворенням нейросфер. Швидкість поділу нейронних стовбурових клітин значно зростає під впливом FGF2, а також при використанні комбінації FGF2 + EGF. Проліферативні ефекти FGF2 опосередковуються рецепторами FGF2-R1. Гепарин підвищує спорідненість зв'язування рецептора FGF2 та різко посилює його мітогенний вплив на нейроепітеліальні клітини. На ранніх стадіях ембріогенезу рецептори FGF2 експресуються в теленцефалоні щурів, тоді як на пізніх стадіях їх локалізація обмежується шлуночковою зоною. Пік експресії FGF2-R1 постмітотичними клітинами спостерігається після завершення раннього періоду нейрогенезу. Початковий період розвитку теленцефалону характеризується низьким рівнем експресії рецептора EGF, переважно в клітинах вентральної області. На пізніх стадіях ембріогенезу експресія EGF-R зростає в дорсальному напрямку. У мозку гризунів EGF має високу спорідненість до рецептора трансформуючого фактора росту бета (TGF-β-R), з яким він переважно зв'язується. Непрямими доказами функціональної ролі EGF-R є дані про кортикальну дисгенезію переднього мозку, що виникає в пізньому періоді ембріогенезу та постнатального онтогенезу, зниження функції переднього мозку, загибель клітин кори та ектопію гіпокампу у мишей з нокаутом гена рецептора EGF. Крім того, присутність TGF-α в живильному середовищі є абсолютно необхідною для формування нейросфер. Після видалення факторів росту з кондиціонованого середовища клітини припиняють ділитися та зазнають спонтанної диференціації з утворенням нейронів, астроцитів та олігодендробластів.

Беручи це до уваги, реагрегацію дисоційованих стовбурових клітин та культивування нейросфер проводять у поживних середовищах, що містять EGF та базовий FGF або FGF2, але без додавання сироватки. Було показано, що EGF індукує проліферацію стовбурових клітин субепендимальної зони бічних шлуночків, а базовий FGF сприяє проліферації стовбурових клітин стріатуму, гіпокампу, неокортексу та зорового нерва зрілого мозку. Поєднання EGF та базового FGF є абсолютно необхідним для активної проліферації стовбурових клітин, виділених з епендими третього та четвертого шлуночків переднього мозку, а також зі спинномозкового каналу грудного та поперекового відділів спинного мозку.

Після дисоціації суспензію нейронних стовбурових клітин культивують у пластикових чашках або багатолункових планшетах без адгезивного субстрату для збільшення розміру нових нейросфер, що утворюються, що зазвичай займає близько 3 тижнів. Метод багаторазового диспергування та розмноження нейросфер дозволяє отримати достатню кількість лінійних клонів мультипотентних стовбурових клітин для внутрішньомозкової трансплантації. Цей принцип також є основою для створення банку стовбурових клітин, виділених з ембріонального мозку людини. Їх тривале (протягом кількох років) клонування дає змогу отримати стабільні лінії нейронних стовбурових клітин, з яких під час індукованої диференціації утворюються катехоламінергічні нейрони.

Якщо нейросфери не диспергуються та не вирощуються на адгезивних субстратах у середовищах, що не містять факторів росту, проліферуючі стовбурові клітини починають спонтанно диференціюватися, утворюючи нейрональні та гліальні клітини-попередники, що експресують маркери всіх типів нервових клітин: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, бета-тубулін III (нейрони), GFAP (астроцити) та CalC, 04 (олігодендроцити). На відміну від клітин мишей та щурів, нейрони становлять понад 40% усіх диференційованих клітин у культурах нейронних стовбурових клітин людини (від 1 до 5% у гризунів), але олігодендроцитів утворюється значно менше, що дуже важливо з точки зору клітинної терапії демієлінізуючих захворювань. Проблема вирішується додаванням культурального середовища B104, яке стимулює утворення мієлінопродукуючих клітин.

При культивуванні нейронних клітин-попередників з мозку ембріонів людини в середовищі, що містить EGF, основний FGF та LIF, кількість клітин-попередників нейронної лінії збільшується в 10 мільйонів разів. Клітини, розмножені in vitro, зберігають здатність до міграції та диференціації в нейронні та гліальні елементи після трансплантації в мозок зрілих щурів. Однак in vivo кількість поділів мультипотентних клітин-попередників обмежена. Неодноразово зазначалося, що межа Хейфліка для «дорослої» нейронної стовбурової клітини (близько 50 мітозів) все ще недосяжна навіть в експерименті – клітини у вигляді нейросфер зберігають свої властивості лише 7 місяців і лише після 8 пасажувань. Вважається, що це пов'язано з особливостями методів їх диспергування під час пасажування (трипсинізація або механічна дія), що різко знижує проліферативну активність клітин через порушення міжклітинних контактів. Дійсно, якщо замість диспергування використовувати метод поділу нейросфер на 4 частини, життєздатність клітин під час пасажування значно зростає. Цей метод дозволяє культивувати нейронні стовбурові клітини людини протягом 300 днів. Однак після цього періоду клітини втрачають мітотичну активність і зазнають дегенерації або вступають у стадію спонтанної диференціації з утворенням нейронів та астроцитів. На цій підставі автор вважає, що 30 мітозів є максимальною кількістю поділів для культивованих нейронних стовбурових клітин.

При культивуванні людських нейронних стовбурових клітин in vitro утворюються переважно ГАМКергічні нейрони. Без спеціальних умов нейронні клітини-попередники дають початок дофамінергічним нейронам (необхідним для клітинної терапії хвороби Паркінсона) лише на перших пасажах, після чого всі нейрони в культурі складаються виключно з ГАМКергічних клітин. У гризунів IL-1 та IL-11, а також фрагменти мембран нервових клітин, LIF та GDNF, викликають індукцію дофамінергічних нейронів in vitro. Однак цей методичний підхід виявився невдалим у людей. Тим не менш, при внутрішньомозковій трансплантації ГАМКергічних нейронів in vivo під впливом факторів мікрооточення виникають нервові клітини з різними медіаторними фенотипами.

Пошук комбінацій нейротрофічних факторів показав, що FGF2 та IL-1 індукують утворення дофамінергічних нейробластів, які, однак, не здатні продукувати дофамінергічні нейрони. Диференціація стовбурових клітин гіпокампу в збуджувальні глутаматергічні та гальмівні ГАМК-ергічні нейрони відбувається під впливом нейротрофінів, а EGF та IGF1 індукують утворення глутаматергічних та ГАМК-ергічних нейронів з нейронних клітин-попередників ембріонів людини. Послідовне додавання ретиноєвої кислоти та нейротрофіну 3 (NT3) до культури значно збільшує диференціацію зрілих стовбурових клітин гіпокампу мозку в нейрони різної медіаторної природи, тоді як комбінація нейротрофічного фактора, похідного від мозку (BNDF), NT3 та GDNF може продукувати пірамідні нейрони в культурах гіпокампу та неокортикальних клітин.

Таким чином, результати численних досліджень свідчать про те, що, по-перше, стовбурові клітини різних структур мозку під впливом локальних специфічних тканинних факторів здатні диференціюватися in vivo в нейрональні фенотипи, властиві цим структурам. По-друге, цілеспрямована індукована диференціація нейронних стовбурових клітин in vitro з використанням клонування клітин-попередників дозволяє отримувати нервові та гліальні клітини із заданими фенотипічними характеристиками для внутрішньомозкової трансплантації при різних формах патології мозку.

Немає сумнівів, що плюрипотентні стовбурові клітини, виділені з ембріонів або дорослої ЦНС, можна розглядати як джерело нових нейронів та використовувати в клініці для лікування неврологічної патології. Однак основною перешкодою для розвитку практичної клітинної нейротрансплантації є той факт, що більшість нейронних стовбурових клітин не диференціюються в нейрони після імплантації в ненейрогенні зони зрілої ЦНС. Щоб обійти цю перешкоду, запропоновано дуже оригінальний інноваційний метод, який дозволяє in vitro отримувати чисту популяцію нейронів з людських фетальних нейронних стовбурових клітин після трансплантації в ЦНС зрілого щура. Автори доводять, що диференціація клітин, імплантованих цим методом, завершується формуванням нейронів холінергічного фенотипу, що зумовлено впливом факторів навколишнього мікрооточення. Запропонована технологія становить інтерес з точки зору розробки нових видів терапії на основі стовбурових клітин та заміщення нейронів, пошкоджених внаслідок травми або нейродегенеративних захворювань, оскільки холінергічні нейрони відіграють провідну роль у розвитку рухових, пам'яттєвих та навчальних функцій. Зокрема, холінергічні нейрони, виділені зі стовбурових клітин людини, можуть бути використані для заміни рухових нейронів, втрачених при бічному аміотрофічному склерозі або травмах спинного мозку. Наразі немає інформації про методи отримання значної кількості холінергічних нейронів з популяції стовбурових клітин, преформованих мітогеном. Автори пропонують досить простий, але ефективний метод стимуляції мітоген-преформованих первинних ембріональних нейронних стовбурових клітин людини до розвитку у практично чисті нейрони після імплантації як у ненейрогенні, так і в нейрогенні зони ЦНС зрілого щура. Найважливішим результатом їхньої роботи є перетворення достатньо великої кількості трансплантованих клітин на холінергічні нейрони при імплантації в середню оболонку та спинний мозок.

Крім того, для преформування нейронних стовбурових клітин з 8-тижневої кори головного мозку ембріонів людини в холінергічні нейрони in vitro пропонується використовувати різні комбінації наступних трофічних факторів та хімічних елементів: рекомбінантний основний FGF, EGF, LIF, мишачий аміно-кінцевий звуковий пептид (Shh-N), транс-ретиноєва кислота, NGF, BDNF, NT3, NT4, природний ламінін та мишачий гепарин. Вихідна лінія людських нейронних стовбурових клітин (K048) підтримувалася in vitro протягом двох років та витримала 85 пасажувань без змін проліферативних та диференціювальних властивостей, зберігаючи при цьому нормальний диплоїдний каріотип. Недисперсні нейросфери пасажувань 19–55 (тижні 38–52) висівали на полі-d-лізин та ламінін, а потім обробляли вищезгаданими факторами в різних концентраціях, комбінаціях та послідовностях. Комбінація основного FGF, гепарину та ламініну (скорочено FHL) дала унікальний ефект. Після одного дня культивування ембріональних нейронних стовбурових клітин у середовищі FHL з Shh-N (поєднання Shh-N + FHL у скороченні SFHL) або без нього спостерігалася швидка проліферація великих планарних клітин. Усі інші одноденні протоколи (такі як базовий FGF + ламінін), навпаки, призводили до обмеженого радіального поширення веретеноподібних клітин, і ці клітини не залишали ядра нейросфер. Після 6 днів активації та наступних 10 днів диференціації в середовищі, що містить B27, на краю сфер, активованих FHL, були виявлені великі мультиполярні нейроноподібні клітини. В інших групах протоколів більшість нейроноподібних клітин залишалися малими та біполярними або уніполярними. Імуноцитохімічний аналіз показав, що малі (< 20 мкм) біполярні або уніполярні клітини були або ГАМКергічними, або глутаматергічними, тоді як більшість великих мультиполярних клітин, локалізованих на краю нейросфер, активованих FHL, були холінергічними, експресуючи маркери, характерні для холінергічних нейронів (Islet-1 та ChAT). Деякі з цих нейронів одночасно експресували синапсин 1. В результаті п'яти серій незалежних експериментів автори виявили, що загальна популяція клітин в одношарових зонах диференціювалася в TuJ1+ нейрони на 45,5%, тоді як холінергічні (ChAT^) нейрони становили лише 27,8% клітин тієї ж популяції. Після 10 днів додаткової диференціації in vitro, крім холінергічних нейронів, у нейросферах, активованих FHL, було виявлено значну кількість дрібних нейронів - глутаматергічних (6,3%), ГАМК-ергічних (11,3%), а також астроцитів (35,2%) та нестин-позитивних клітин (18,9%). При використанні інших комбінацій факторів росту холінергічні нейрони були відсутні, а маргінальні клітини нейросфер утворювали або астроцити, або малі глутаматергічні та ГАМК-ергічні нейрони. Моніторинг резервних та активних потенціалів за допомогою методики клампування цілих клітин показав, що після семи днів активації FHL більшість великих поліполярних клітин мали потенціал спокою -29,0±2,0 мВ за відсутності потенціалу дії. Через 2 тижні потенціал спокою збільшився до -63.6±3,0 мВ, а потенціали дії спостерігалися в момент індукції деполяризуючих струмів та блокувалися 1 М тетродотоксином, що свідчить про функціональну активність холінергічних незрілих нейронів.

Автори також встановили, що активація FHL або SFHL in vitro сама по собі не призводить до утворення зрілих нейронів, і спробували встановити, чи здатні сформовані FHL або SFHL стовбурові клітини диференціюватися в холінергічні нейрони при трансплантації в ЦНС зрілих щурів. Для цього активовані клітини вводили в нейрогенну зону (гіпокамп) та в кілька ненейрогених зон, включаючи префронтальну кору, середню мембрану та спинний мозок дорослих щурів. Імплантовані клітини відстежували за допомогою вектора CAO-^^p. Відомо, що OCP мітить як клітинну ультраструктуру, так і клітинні процеси (молекулярний рівень) без витоку та може бути безпосередньо візуалізований. Крім того, мічені OCP нейронні стовбурові клітини підтримують профіль нейрональної та гліальної диференціації, ідентичний профілю нетрансформованих стовбурових клітин ембріонального мозку.

Через один-два тижні після імплантації 5 x 10⁴ ^{активованих} та мічених нейронних стовбурових клітин їх виявляли у спинному або головному мозку щурів, причому OCD+ клітини розташовувалися переважно поблизу місця ін'єкції. Процеси міграції та інтеграції спостерігалися вже через місяць після трансплантації. Межі міграції варіювалися залежно від місця ін'єкції: при ін'єкції в префронтальну кору OCD+ клітини розташовувалися на відстані 0,4-2 мм від місця ін'єкції, тоді як у випадку імплантації в середню мембрану, гіпокамп або спинний мозок клітини мігрували на значно більші відстані - до 1-2 см. Трансплантовані клітини локалізувалися у високоорганізованих структурах ЦНС, включаючи лобову кору, середню мембрану, гіпокамп та спинний мозок. OCD-мічені нейрональні елементи були видимі вже протягом першого тижня після трансплантації, причому їх кількість значно зростала через місяць після операції. Стереологічний аналіз показав вищий рівень виживання імплантованих клітин у різних структурах головного мозку порівняно зі спинним мозком.

Відомо, що в більшості тканин дорослого організму ссавців зберігається популяція регіональних стовбурових клітин, трансформація яких у зрілі клітини регулюється специфічними тканинними факторами. Проліферація стовбурових клітин, диференціація клітин-попередників та формування нейрональних фенотипів, специфічних для даної структури мозку in vivo, виражені в значно більшій мірі в ембріональному мозку, що визначається наявністю високих концентрацій морфогенетичних факторів локального мікрооточення – нейротрофінів BDNF, NGF, NT3, NT4/5 та факторів росту FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Де розташовані нервові стовбурові клітини?

Встановлено, що нервові стовбурові клітини експресують гліальний кислий фібрилярний білок, який серед зрілих клітин нервової лінії зберігається лише на астроцитах. Отже, астроцитарні клітини можуть бути резервом стовбурових клітин у зрілій ЦНС. Дійсно, нейрони, що походять від GFAP-позитивних попередників, були ідентифіковані в нюхових цибулинах та зубчастій звивині, що суперечить традиційним уявленням про прогениторну роль радіальної глії, яка не експресує GFAP у зубчастій звивині в дорослому віці. Можливо, що в ЦНС існують дві популяції стовбурових клітин.

Також залишається незрозумілим питання локалізації стовбурових клітин у субвентрикулярній зоні. На думку деяких авторів, епендимальні клітини утворюють у культурі сферичні клони, які не є справжніми нейросферами (як клони субепендимальних клітин), оскільки здатні диференціюватися лише в астроцити. З іншого боку, після флуоресцентного або вірусного мічення епендимальних клітин маркер виявляється в клітинах субепендимального шару та нюхових цибулин. Такі мічені клітини in vitro утворюють нейросфери та диференціюються в нейрони, астроцити та олігодендроцити. Крім того, було показано, що близько 5% клітин епендими експресують стовбурові маркери - нестин, Notch-1 та Mussashi-1. Передбачається, що механізм асиметричного мітозу пов'язаний з нерівномірним розподілом мембранного рецептора Notch-1, внаслідок чого останній залишається на мембрані дочірньої клітини, локалізованої в епендимальній зоні, тоді як материнська клітина, що мігрує до субепендимального шару, позбавлена цього рецептора. З цієї точки зору, субепендимальна зона може розглядатися як колектор прогениторних попередників нейронів та глії, що утворюються зі стовбурових клітин епендимального шару. За даними інших авторів, у каудальних частинах субшлуночкової зони утворюються лише гліальні клітини, а джерелом нейрогенезу є клітини рострально-латеральної частини. У третьому варіанті передній та задній частинам субшлуночкової зони бічних шлуночків надається еквівалентний нейрогенний потенціал.

Четвертий варіант організації стовбурового резерву в центральній нервовій системі видається кращим, згідно з яким у субшлуночковій зоні виділяють три основні типи нейронних клітин-попередників – А, В та С. А-клітини експресують ранні нейрональні маркери (PSA-NCAM, TuJl) та оточені В-клітинами, які ідентифікуються як астроцити за експресією антигенів. С-клітини, не маючи антигенних характеристик нейронів чи глії, мають високу проліферативну активність. Автор переконливо довів, що В-клітини є попередниками А-клітин та de novo нейронів нюхових цибулин. Під час міграції А-клітини оточені тяжами нейронних клітин-попередників, що суттєво відрізняється від механізму міграції постмітотичних нейробластів вздовж радіальної глії в ембріональному мозку. Міграція завершується в нюхових цибулинах мітотичним поділом як А, так і В-клітин, похідні яких включаються до шарів зернистих клітин та до клубочкового шару нюхової зони мозку.

Ембріональний мозок, що розвивається, не має диференційованих епендимальних клітин, а стінки шлуночків містять проліферуючі стовбурові клітини гермінальної та субшлуночкової зон шлуночків, куди мігрують первинні нейро- та гліобласти. Виходячи з цього, деякі автори вважають, що субепендимальна область зрілого мозку містить редуковану ембріональну гермінативну нервову тканину, що складається з астроцитів, нейробластів та неідентифікованих клітин. Справжні нервові стовбурові клітини становлять менше 1% клітин у гермінальній зоні латеральної стінки шлуночка. Частково з цієї причини, а також у зв'язку з даними про те, що астроцити субепендимальної зони є попередниками нервових стовбурових клітин, не виключається можливість трансдиференціації астроцитарних гліальних елементів з набуттям нейрональних фенотипових характеристик.

Основною перешкодою для остаточного вирішення проблеми локалізації нервових стовбурових клітин in vivo є відсутність специфічних маркерів для цих клітин. Тим не менш, з практичної точки зору дуже цікавими є повідомлення про те, що нервові стовбурові клітини були виділені з ділянок ЦНС, які не містять субепендимальних зон – третього та четвертого шлуночків переднього мозку, спинномозкового каналу грудного та поперекового відділів спинного мозку. Особливе значення має той факт, що пошкодження спинного мозку збільшує проліферацію епендимальних стовбурових клітин центрального каналу з утворенням клітин-попередників, що мігрують та диференціюються в астроцити гліомезодермального рубця. Крім того, у неушкодженому спинному мозку дорослих щурів також були виявлені клітини-попередники астро- та олігодендроцитів.

Таким чином, дані літератури переконливо демонструють наявність у ЦНС дорослих ссавців, включаючи людину, регіонального стовбурового резерву, регенеративно-пластична здатність якого, на жаль, здатна забезпечити лише процеси фізіологічної регенерації з формуванням нових нейронних мереж, але не задовольняє потреби репаративної регенерації. Це ставить завдання пошуку можливостей збільшення стовбурових ресурсів ЦНС екзогенними засобами, що є нерозв'язним без чіткого розуміння механізмів формування ЦНС в ембріональному періоді.

Сьогодні ми знаємо, що під час ембріонального розвитку стовбурові клітини нервової трубки є джерелом трьох типів клітин – нейронів, астроцитів та олігодендроцитів, тобто нейрони та нейроглія походять з однієї клітини-попередника. Диференціація ектодерми в кластери нейронних клітин-попередників починається під впливом продуктів пронейральних генів родини bHLH та блокується експресією рецепторних трансмембранних білкових похідних генів родини Notch, які обмежують детермінацію та ранню диференціацію нейронних клітин-попередників. У свою чергу, лігандами рецепторів Notch є трансмембранні дельта-білки сусідніх клітин, завдяки позаклітинному домену яких здійснюються прямі міжклітинні контакти з індуктивною взаємодією між стовбуровими клітинами.

Подальша реалізація програми ембріонального нейрогенезу є не менш складною і, здавалося б, має бути видоспецифічною. Однак результати досліджень нейроксенотрансплантації свідчать про те, що стовбурові клітини мають виражений еволюційний консерватизм, завдяки якому людські нейронні стовбурові клітини здатні мігрувати та розвиватися при пересадці в мозок щура.

Відомо, що ЦНС ссавців має надзвичайно низьку здатність до репаративної регенерації, яка характеризується відсутністю будь-яких ознак появи нових клітинних елементів у зрілому мозку для заміщення нейронів, що загинули внаслідок травми. Однак у випадку трансплантації нейробластів останні не тільки приживаються, проліферують та диференціюються, але й здатні інтегруватися в структури мозку та функціонально замінювати втрачені нейрони. При трансплантації комітованих нейрональних клітин-попередників терапевтичний ефект був значно слабшим. Показано, що такі клітини мають низьку здатність до міграції. Крім того, нейрональні клітини-попередники не відтворюють архітектуру нейронних мереж та функціонально не інтегровані в мозок реципієнта. У зв'язку з цим активно вивчаються питання репаративно-пластичної регенерації під час трансплантації не преформованих мультипотентних нейронних стовбурових клітин.

У дослідженні М. Александрової та ін. (2001) у першому варіанті експериментів реципієнтами були статевозрілі самки щурів, а донорами – 15-денні ембріони. У реципієнтів видаляли ділянку потиличної кори головного мозку, а в порожнину пересаджували механічно суспендовану тканину презумптивної ембріональної кори, що містить мультипотентні стовбурові клітини шлуночкової та субшлуночкової областей. У другому варіанті експериментів нейронні стовбурові клітини 9-тижневого ембріона людини пересаджували в мозок статевозрілих щурів. Автори виділяли шматочки тканини з перивентрикулярної області ембріонального мозку, поміщали їх у поживне середовище F-12, та шляхом багаторазового піпетування отримували клітинну суспензію, а потім культивували їх у спеціальному середовищі NPBM з додаванням факторів росту – FGF, EGF та NGF. Клітини вирощували в суспензійній культурі до утворення нейросфер, які диспергували та знову висаджували в культуру. Після 4 пасажувань із загальним періодом культивування 12-16 днів клітини використовували для трансплантації. Реципієнтами були десятиденні щурячата та статевозрілі двомісячні щури Вістар, яким без імуносупресії вводили 4 мкл суспензії людських нервових стовбурових клітин у бічний шлуночок мозку. Результати роботи показали, що дисоційовані клітини шлуночкової та субшлуночкової зони ембріонального зачатка кори головного мозку щурів продовжували свій розвиток під час алотрансплантації у зрілий мозок, тобто фактори мікрооточення диференційованого мозку реципієнта не блокували ріст та диференціацію нервових стовбурових клітин ембріона. На ранніх стадіях після трансплантації мультипотентні клітини продовжували мітотичний поділ та активно мігрували із зони трансплантації до тканини мозку реципієнта. Трансплантовані ембріональні клітини з величезним міграційним потенціалом були виявлені майже у всіх шарах кори головного мозку реципієнта вздовж трансплантаційного шляху та у білій речовині. Довжина міграційного шляху нервових клітин завжди була значно коротшою (до 680 мкм), ніж у гліальних елементів (до 3 мм). Кровоносні судини та волокнисті структури мозку служили структурними векторами для міграції астроцитів, що також було зазначено в інших дослідженнях.

Раніше вважалося, що накопичення мічених астроцитів у зоні пошкодження кори головного мозку реципієнта може бути пов'язане з формуванням гліального бар'єру між тканинами трансплантата та реципієнта. Однак дослідження структури компактно розташованих клітинних трансплантатів показало, що їхня цитоархітектура характеризується хаотичністю, без будь-якого шаруватого розподілу трансплантованих клітин. Ступінь впорядкованості трансплантованих нейронів наближався до нормальних клітин кори головного мозку лише за відсутності гліального бар'єру між тканинами донора та реципієнта. В іншому випадку структура клітин трансплантата була атиповою, а самі нейрони схильні до гіпертрофії. За допомогою нейроімунохімічного типування трансплантованих клітин у трансплантатах були виявлені гальмівні ГАМК-ергічні нейрони та виявлена експресія білків PARV, CALB та NPY. Отже, зрілий мозок зберігає фактори мікрооточення, здатні підтримувати проліферацію, міграцію та специфічну диференціацію нейронних мультипотентних клітин.

У культурі стовбурових клітин людини, виділених з перивентрикулярної області мозку 9-тижневих ембріонів, М. Александрова та ін. (2001) виявили велику кількість нестин-позитивних мультипотентних клітин у четвертому пасажі, деякі з яких вже пройшли диференціацію in vitro та розвивалися за нейрональним типом, що відповідало результатам досліджень інших авторів. Після трансплантації в мозок дорослих щурів культивовані стовбурові клітини людини мітотично ділилися та мігрували в тканину ксеногенного мозку реципієнта. У клітинних трансплантатах автори спостерігали дві популяції клітин – дрібні та більші. Останні мігрували як у паренхімі, так і вздовж волоконних структур мозку реципієнта на незначні відстані – у межах 300 мкм. Найбільша протяжність шляху міграції (до 3 мм) була характерна для дрібних клітин, деякі з яких диференціювалися в астроцити, що було встановлено за допомогою моноклональних антитіл до GFAP. Обидва типи клітин були виявлені в стінці бічного шлуночка, що свідчить про потрапляння трансплантованих клітин у ростральний міграційний тракт. Астроцитарні похідні нервових стовбурових клітин як людини, так і щурів мігрували переважно через кровоносні капіляри та волокнисті структури мозку реципієнта, що збігається з даними інших авторів.

Аналіз диференціації людських стовбурових клітин in vivo з використанням моноклональних антитіл до GFAP, CALB та VIM виявив утворення як астроцитів, так і нейронів. На відміну від клітин у трансплантатах щурів, багато людських стовбурових клітин були віментин-позитивними. Отже, деякі людські мультипотентні клітини не зазнали диференціації. Ті ж автори згодом показали, що людські нейронні стовбурові клітини, трансплантовані без імуносупресії, виживають у мозку щурів протягом 20 днів після трансплантації без ознак імунної агресії з боку гліальних елементів зрілого мозку.

Встановлено, що навіть нейронні стовбурові клітини дрозофіли приживаються та диференціюються в мозку такого далекого від комах таксона, як щур. Правильність експерименту авторів не викликає сумнівів: трансгенні лінії дрозофіли містили гени нейротрофічних факторів людини NGF, GDNF, BDNF, вставлені у вектор CaSper під промотором теплового шоку дрозофіли, так що температура тіла ссавців автоматично викликала їх експресію. Автори ідентифікували клітини дрозофіли за продуктом бактеріального гена галактозидази за допомогою гістохімічного фарбування X-Gal. Крім того, виявилося, що нейронні стовбурові клітини дрозофіли специфічно реагують на нейротрофічні фактори, кодовані генами людини: при ксенотрансплантації клітин трансгенної лінії дрозофіли, що містить ген gdnf, синтез тирозингідроксилази в її диференціюючих нейронних стовбурових клітинах різко зростав, а клітини з геном ngf активно продукували ацетилхолінестеразу. Ксенотрансплантат індукував подібні генозалежні реакції в алотрансплантаті ембріональної нервової тканини, пересадженої разом з ним.

Чи означає це, що специфічна диференціація нервових стовбурових клітин індукується видонеспецифічними нейротрофічними факторами? Згідно з результатами авторів, ксенотрансплантат, що продукує нейротрофічні фактори, мав специфічний вплив на долю алотрансплантатів, які в цьому випадку розвивалися інтенсивніше та були в 2-3 рази більшими за розміром, ніж алотрансплантати, введені в мозок без додавання ксенотрансплантатів. Отже, клітини ксенотрансплантата, що містять гени нейротрофінів, зокрема ген, що кодує нейротрофічний фактор, похідний від гліальних клітин людини (GDNF), мають видонеспецифічний вплив на розвиток алотрансплантата, подібний до дії відповідного нейротрофіну. Відомо, що GDNF збільшує виживання дофамінергічних нейронів у середньому мозку ембріона щура та посилює метаболізм дофаміну цими клітинами, а також індукує диференціацію тирозингідроксилазо-позитивних клітин, посилюючи ріст аксонів та збільшуючи розмір тіла нейронної клітини. Подібні ефекти також спостерігаються в культивованих дофамінергічних нейронах середнього мозку щура.

Активна міграція нейронних стовбурових клітин людини спостерігається після ксенотрансплантації в мозок статевозрілих щурів. Відомо, що процес міграції та диференціації нейронних стовбурових клітин контролюється набором спеціальних генів. Ініціюючий міграційний сигнал до клітини-попередника для початку диференціації дає білковий продукт протоонкогена c-ret разом з GDNF. Наступний сигнал надходить від гена mash-1, який контролює вибір шляху розвитку клітини. Крім того, специфічна реакція клітин, що диференціюються, також залежить від α-рецептора циліарного нейротрофічного фактора. Таким чином, враховуючи абсолютно різну генетичну конституцію ксеногенних нейронних стовбурових клітин людини та клітин мозку реципієнтного щура, необхідно визнати не лише видову неспецифічність нейротрофічних факторів, але й найвищий еволюційний консерватизм генів, відповідальних за специфічну диференціацію елементів нейронних стовбурових клітин.

Майбутнє покаже, чи буде можливою ксенотрансплантація ембріонального нейроматеріалу в нейрохірургічній практиці лікування нейродегенеративних патологічних процесів, спричинених порушенням синтезу мієліну олігодендроцитами. Тим часом найбільш інтенсивно розглядаються питання нейротрансплантації, пов'язані з отриманням алогенних нейронних стовбурових клітин з ембріонального або зрілого мозку в культурі з подальшою спрямованою диференціацією їх у нейробласти або спеціалізовані нейрони.

Трансплантація нервових стовбурових клітин

Для стимуляції проліферації та диференціації нервових стовбурових клітин дорослого організму можна трансплантувати ембріональну нервову тканину. Можливо, що стовбурові клітини ембріональної нервової тканини, завезені з алотрансплантатом, самі можуть зазнавати проліферації та диференціації. Відомо, що після травми хребта регенерація нервових провідників відбувається шляхом подовження пошкоджених аксонів та колатерального проростання аксонів непошкоджених відростків рухових нейронів. Основними факторами, що перешкоджають регенерації спинного мозку, є формування сполучнотканинного рубця в зоні пошкодження, дистрофічні та дегенеративні зміни центральних нейронів, дефіцит NGF та наявність продуктів розпаду мієліну в зоні пошкодження. Показано, що трансплантація різних типів клітин у пошкоджений спинний мозок - фрагментів сідничного нерва дорослих тварин, ембріональної потиличної кори, гіпокампу, спинного мозку, клітин Шванна, астроцитів, мікроглії, макрофагів, фібробластів - сприяє регенерації пошкоджених аксонів шляхом проростання та дозволяє новоутвореним аксонам проростати крізь зону пошкодження спинного мозку. Експериментально доведено, що трансплантація ембріональної нервової тканини в зону пошкодження спинного мозку, завдяки дії нейротрофічних факторів, прискорює ріст пошкоджених аксонів, запобігає утворенню гліального рубця та розвитку дистрофічних і дегенеративних процесів у центральних нейронах, тоді як клітини трансплантованої ембріональної нервової тканини виживають у спинному мозку, інтегруються з сусідніми тканинами та сприяють росту аксонів через зону пошкодження з формуванням дендритних синапсів на спинномозкових нейронах.

Цей напрямок регенеративно-пластичної медицини отримав найбільший розвиток в Україні завдяки роботам наукового колективу під керівництвом В.І. Цимбалюка. Перш за все, це експериментальні дослідження ефективності трансплантації ембріональної нервової тканини при травмах спинного мозку. Під час аутотрансплантації периферичного нерва автори спостерігали найбільш виражені деструктивні зміни в зоні дистального шва, де на 30-й день після операції вони поєднувалися з репаративними процесами. Під час алотрансплантації морфофункціональний стан імплантованого нерва на 30-й день характеризувався вираженою деструкцією з жировою дистрофією та амілоїдозом на тлі вогнищевої запальної лімфоїдно-клітинної інфільтрації з переважною атрофією шваннівських клітин. Трансплантація ембріональної нервової тканини сприяла відновленню провідності спинного мозку більшою мірою, особливо у тварин, які перенесли операцію протягом перших 24 годин після травми: на тлі зниження інтенсивності запальних та деструктивних процесів спостерігалася гіпертрофія та гіперплазія білоксинтезуючих та енергопродукуючих ультраструктурних елементів спинномозкових нейронів, гіпертрофія та гіперплазія олігодендроцитів, амплітуда потенціалу дії м'язів відновлювалася на 50%, а швидкість проведення імпульсу – на 90%. При оцінці ефективності трансплантації ембріональної нервової тканини залежно від зони трансплантації було виявлено, що найкращі результати спостерігалися при безпосередньому введенні трансплантата в зону пошкодження спинного мозку. При повному перерізі спинного мозку трансплантація ембріональної нервової тканини була неефективною. Динамічні дослідження показали, що оптимальним часом для проведення трансплантації ембріональної нервової тканини є перші 24 години після травми спинного мозку, тоді як проведення операції в період виражених вторинних ішемічно-запальних змін, що виникають на 2-9-й день після травми, слід вважати недоцільним.

Відомо, що тяжка черепно-мозкова травма провокує потужну та тривалу активацію перекисного окислення ліпідів на початковій та проміжній стадіях посттравматичного періоду як у пошкодженій тканині мозку, так і в організмі в цілому, а також порушує процеси енергетичного обміну в пошкодженому мозку. За цих умов трансплантація ембріональної нервової тканини в зону травматичного пошкодження сприяє стабілізації процесів перекисного окислення ліпідів та підвищує потенціал антиоксидантної системи мозку та організму в цілому, посилює його антирадикальний захист на 35-60-й день посттравматичного періоду. У цей же період після трансплантації ембріональної нервової тканини нормалізуються енергетичний обмін та процеси окисного фосфорилювання в мозку. Крім того, показано, що в першу добу після експериментальної черепно-мозкової травми імпеданс тканини пошкодженої півкулі знижується на 30-37%, контралатеральної - на 20%, що свідчить про розвиток генералізованого набряку мозку. У тварин, яким було проведено трансплантацію ембріональної нервової тканини, інволюція набряку відбувалася значно швидше – вже на сьому добу середнє значення імпедансу тканин пошкодженої півкулі досягло 97,8% від контрольного рівня. Причому повне відновлення значень імпедансу на 30-ту добу відзначалося лише у тварин, яким було проведено трансплантацію ембріональної нервової тканини.

Загибель деяких нейронів мозку після тяжкої черепно-мозкової травми є однією з основних причин посттравматичних ускладнень. Особливо чутливі до травми нейрони інтегруючої дофамінергічної та норадренергічної систем середнього та довгастого мозку. Зниження рівня дофаміну в стріопалідарному комплексі та корі головного мозку значно підвищує ризик розвитку рухових та психічних розладів, епілептиформних станів, а зниження продукції дофаміну в гіпоталамусі може бути причиною численних вегетативних та соматичних розладів, що спостерігаються в пізньому посттравматичному періоді. Результати досліджень, проведених при експериментальній черепно-мозковій травмі, свідчать про те, що трансплантація ембріональної нервової тканини сприяє відновленню рівня дофаміну в пошкодженій півкулі головного мозку, дофаміну та норадреналіну в гіпоталамусі, а також підвищенню рівня норадреналіну та дофаміну в середньому та довгастому мозку. Крім того, в результаті трансплантації ембріональної нервової тканини в пошкоджену півкулю мозку експериментальних тварин нормалізується відсоткове співвідношення фосфоліпідів та збільшується вміст жирних кислот (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Ці дані підтверджують стимуляцію регенеративно-пластичних процесів пересадженою ембріональною нервовою тканиною та свідчать про репаративно-трофічний вплив трансплантата на мозок реципієнта в цілому.

На особливу увагу заслуговує клінічний досвід співробітників Інституту нейрохірургії імені А. П. Ромоданова Академії медичних наук України з трансплантації ембріональної нервової тканини при ДЦП, надзвичайно складній патології з тяжкою руховою дисфункцією. Клінічні форми ДЦП залежать від рівня пошкодження інтегральних структур, що відповідають за регуляцію м'язового тонусу та формування рухових стереотипів. Наразі є достатньо доказів, які підтверджують той факт, що патологічні зміни в стріопаллідально-таламокортикальній системі моторного контролю відіграють важливу роль у порушеннях рухової функції та м'язового тонусу. Стріопаллідна ланка цієї системи здійснює контрольну функцію через нігростріатальне вироблення дофаміну. Прямий шлях реалізації таламокортикального контролю починається від нейронів путамена, опосередковується гамма-аміномасляною кислотою (ГАМК) та субстанцією Р і проектується безпосередньо в рухову зону внутрішнього сегмента блідого кулі та чорної субстанції. Непрямий шлях, ефект якого реалізується за участю ГАМК та енкефаліну, бере початок від нейронів путамену та впливає на ядра базальних гангліїв через послідовність зв'язків, що включають зовнішній сегмент блідої кулі та субталамічні ядра. Порушення провідності прямого шляху викликають гіпокінезію, тоді як зниження провідності структур непрямого шляху призводить до гіперкінезії з відповідними змінами м'язового тонусу. Цілісність ГАМКергічних шляхів провідності на різних рівнях системи рухового контролю та інтеграція дофамінергічних зв'язків на рівні путамену мають важливе значення для регуляції таламокортикальних взаємодій. Найпоширенішим проявом рухової патології при різних формах церебрального паралічу є порушення м'язового тонусу та тісно пов'язана з ним зміна рефлекторної м'язової активності.

Трансплантація ембріональної нервової тканини при ДЦП вимагає ретельного аналізу характеру пошкодження структур мозку. На основі визначення рівнів дофаміну та ГАМК у субарахноїдальній спинномозковій рідині автори деталізували рівень порушення інтеграції функціональних структур мозку, що дозволило об'єктивізувати результати хірургічного втручання та скоригувати повторні нейротрансплантації. Ембріональна нервова тканина (абортний матеріал 9-тижневого ембріона) була трансплантована в паренхіму кори прецентральних звивин півкуль великого мозку залежно від ступеня атрофічних змін. У післяопераційному періоді ускладнень або погіршення стану пацієнтів не спостерігалося. Позитивна динаміка відзначена у 63% пацієнтів зі спастичними формами, у 82% дітей з атонічно-естетичною формою та лише у 24% пацієнтів зі змішаною формою захворювання. Встановлено негативний вплив високого рівня нейросенсибілізації з наявністю аутоантитіл до нейроспецифічних білків на результати операції. Трансплантація ембріональної нервової тканини виявилася неефективною у пацієнтів віком 8-10 років і старше, а також у випадках тяжкого гіперкінетичного синдрому та епілепсії. Клінічно ефективність трансплантації ембріональної нервової тканини у пацієнтів зі спастичними формами церебрального паралічу проявлялася формуванням нових статомоторних навичок та довільних рухів з корекцією патологічного рухового стереотипу та зменшенням ступеня спастичності, патологічних поз та положень. Автори вважають, що позитивний ефект трансплантації ембріональної нервової тканини є результатом нормалізуючого впливу на функціональну активність супраспінальних структур, що беруть участь у регуляції постурального тонусу та довільних рухів. Водночас позитивні клінічні ефекти трансплантації ембріональної нервової тканини супроводжуються зниженням вмісту нейромедіаторів у субарахноїдальній спинномозковій рідині, що свідчить про відновлення інтегральних взаємодій уражених структур мозку.

Існує ще одна важка форма неврологічної патології – апалічний синдром, проблема лікування якого, на жаль, далеко не вирішена. Апалічний синдром – це поліетіологічний підгострий або хронічний стан, що виникає внаслідок тяжких органічних уражень центральної нервової системи (переважно кори головного мозку), і характеризується розвитком панапраксії та панагнозії з відносно збереженою функцією сегментарно-стовбурових відділів та утворень лімбіко-ретикулярного комплексу мозку. Катастрофічні дослідження (від 1 року до 3 років) показали, що апалічний синдром не є остаточним діагнозом стійкого ураження нервової системи у дітей, а трансформується або в органічну деменцію, або в хронічний вегетативний стан. У відділенні відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії імені А. П. Ромоданова Академії медичних наук України 21 пацієнту з наслідками апалічного синдрому було проведено трансплантацію ембріональної нервової тканини. Під загальним наркозом коронковим бором робили отвір для бормашини над ділянкою найбільш виражених атрофічних змін, виявлених за допомогою комп'ютерної томографії або магнітно-резонансної томографії, а за наявності дифузної атрофії сірої або білої речовини трансплантат вводили в прецентральну та центральну звивини головного мозку. Після розтину твердої мозкової оболонки шматочки тканини сенсомоторної кори 8-9-тижневих ембріонів імплантували внутрішньокірково за допомогою спеціального пристрою. Кількість імплантованих зразків тканини коливалася від 4 до 10, що визначалося розміром отвору для бормашини та розміром локальних змін у речовині мозку. На відміну від інших видів патології, при апалічному синдромі автори прагнули імплантувати якомога більше ембріональної тканини в найбільш доступні ділянки головного мозку. Тверду мозкову оболонку ушивали, проводили пластику дефекту черепа. Під час операції у всіх пацієнтів спостерігалися значні зміни як у корі (атрофія, відсутність звивин, зміна кольору та пульсації речовини мозку), так і в мозкових оболонках (потовщення твердої мозкової оболонки, значне потовщення павутинної оболонки з наявністю власних кровоносних судин, зрощення оболонок з підлеглою речовиною мозку). Ці зміни були більш виражені у пацієнтів із запальними ураженнями мозку в анамнезі. У пацієнтів, які перенесли гіпоксію ЦНС, переважали дифузні атрофічні зміни речовини мозку, особливо в корі, зі збільшенням підпавутинного простору, без суттєвих змін мозкових оболонок. У половини пацієнтів спостерігалася підвищена кровоточивість м'яких тканин, кісток та речовини мозку. Після операцій, протягом шести місяців-трьох років, стан покращився у 16 пацієнтів, а у п'яти залишився незмінним. Позитивна динаміка спостерігалася як у руховій, так і в психічній сферах. М'язовий тонус знизився у десяти пацієнтів, у 11 пацієнтів підвищилася рухова активність (зменшилися парези,(покращилася координація рухів), у п'яти дітей значно зросла маніпулятивна здатність верхніх кінцівок. У чотирьох пацієнтів зменшилися частота та тяжкість епілептичних нападів, а в однієї дитини напади взагалі були відсутні протягом усього періоду спостереження після операції. Агресія знизилася у двох дітей, у двох пацієнтів з тяжкими бульбарними розладами покращився акт ковтання, двоє дітей змогли самостійно жувати вже через 2 тижні після операції. Відзначено зниження тяжкості психічних розладів, дев'ять дітей стали спокійнішими після операції, у семи пацієнтів покращився сон та увага. Троє пацієнтів з наслідками апалічного синдрому почали впізнавати батьків, один - виконувати інструкції, двоє - вимовляти слова, у трьох зменшився ступінь дизартрії. Автори зазначають, що помітне покращення стану пацієнтів починається через 2 місяці після операції, досягає максимуму до 5-6 місяців, потім темпи покращення сповільнюються і до кінця року процес стабілізується у 50% пацієнтів. Позитивний ефект нейротрансплантації послужив підставою для повторної операції у шести пацієнтів з наслідками апалічного синдрому, але на іншій півкулі мозку. Техніка та методи другої трансплантації були ідентичними таким, що були при першій операції, але клінічний ефект другої операції був нижчим, хоча серйозних ускладнень ні після першого, ні після другого хірургічного втручання не виникло. На думку авторів, механізм терапевтичного ефекту нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофічним ефектом пересадженої ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів та пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Також можливий активуючий вплив на активність нервових клітин, які раніше були морфологічно збережені, але втратили свою функціональну активність через захворювання. Саме швидким нейротрофічним ефектом можна пояснити покращення бульбарних функцій у деяких дітей вже наприкінці першого-другого тижня після операції. Передбачається, що, крім цього, до третього-четвертого місяця встановлюються морфофункціональні зв'язки між трансплантатом і мозком господаря, за допомогою яких нейротрансплантат заміщує функції загиблих клітин мозку, що є субстратом для покращення як рухових, так і психічних функцій пацієнтів. Двоє дітей змогли самостійно жувати вже через 2 тижні після операції. Відзначено зменшення тяжкості психічних розладів, дев'ять дітей стали спокійнішими після операції, у семи пацієнтів покращився сон і увага. Троє пацієнтів з наслідками апалічного синдрому почали впізнавати батьків, один - виконувати інструкції, двоє - вимовляти слова.у трьох ступінь дизартрії зменшився. Автори зазначають, що помітне покращення стану пацієнтів починається через 2 місяці після операції, досягає максимуму до 5-6 місяців, потім темпи покращення сповільнюються і до кінця року процес стабілізується у 50% пацієнтів. Позитивний ефект нейротрансплантації послужив підставою для повторної операції у шести пацієнтів з наслідками апалічного синдрому, але на іншій півкулі мозку. Техніка та метод другої трансплантації були ідентичними таким, що були при першій операції, але клінічний ефект другої операції був нижчим, хоча серйозних ускладнень ні після першого, ні після другого хірургічного втручання не було. На думку авторів, механізм терапевтичного ефекту нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофічним ефектом пересадженої ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів та пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Також можливий активуючий вплив на активність нервових клітин, які раніше були морфологічно збережені, але втратили свою функціональну активність через захворювання. Саме швидким нейротрофічним ефектом можна пояснити покращення бульбарних функцій у деяких дітей вже наприкінці першого-другого тижня після операції. Передбачається, що разом з цим до третього-четвертого місяця встановлюються морфофункціональні зв'язки між трансплантатом і мозком господаря, за допомогою яких нейротрансплантат заміщує функції загиблих клітин мозку, що є субстратом для покращення як рухових, так і психічних функцій пацієнтів. Двоє дітей змогли самостійно жувати вже через 2 тижні після операції. Відзначено зменшення тяжкості психічних розладів, дев'ять дітей стали спокійнішими після операції, у семи пацієнтів покращився сон і увага. Троє пацієнтів з наслідками апалічного синдрому почали впізнавати батьків, один - виконувати інструкції, двоє - вимовляти слова, у трьох зменшився ступінь дизартрії. Автори зазначають, що помітне покращення стану пацієнтів починається через 2 місяці після операції, досягає максимуму до 5-6 місяців, потім темпи покращення сповільнюються і до кінця року процес стабілізується у 50% пацієнтів. Позитивний ефект нейротрансплантації послужив підставою для повторної операції у шести пацієнтів з наслідками апалічного синдрому, але на іншій півкулі мозку. Техніка та метод другої трансплантації були ідентичними таким, що були під час першої операції, але клінічний ефект другої операції був нижчим, хоча серйозних ускладнень ні після першого, ні після другого хірургічного втручання не було. За словами авторів,Механізм терапевтичного ефекту нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофічним ефектом пересадженої ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів та пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Можливий також активуючий вплив на активність нервових клітин, які раніше були морфологічно збережені, але втратили свою функціональну активність через захворювання. Саме швидким нейротрофічним ефектом можна пояснити покращення бульбарних функцій у деяких дітей вже наприкінці першого-другого тижня після операції. Передбачається, що поряд з цим до третього-четвертого місяця встановлюються морфофункціональні зв'язки між трансплантатом і мозком господаря, завдяки яким нейротрансплантат заміщує функції загиблих клітин мозку, що є субстратом для покращення як рухових, так і психічних функцій пацієнтів, хоча серйозних ускладнень ні після першого, ні після другого хірургічного втручання не виникло. На думку авторів, механізм терапевтичного ефекту нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофічним ефектом пересадженої ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів та пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Можливий також активуючий вплив на активність нервових клітин, які раніше були морфологічно збережені, але втратили свою функціональну активність через захворювання. Саме швидким нейротрофічним ефектом можна пояснити покращення бульбарних функцій у деяких дітей вже наприкінці першого-другого тижня після операції. Передбачається, що поряд з цим до третього-четвертого місяця встановлюються морфофункціональні зв'язки між трансплантатом та мозком господаря, завдяки яким нейротрансплантат заміщує функції загиблих клітин мозку, що є субстратом для покращення як рухових, так і психічних функцій пацієнтів, хоча серйозних ускладнень ні після першого, ні після другого хірургічного втручання не виникло. На думку авторів, механізм терапевтичного ефекту нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофічним ефектом пересадженої ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів та пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Також можливий активуючий вплив на активність нервових клітин, які раніше були морфологічно збережені, але втратили свою функціональну активність через захворювання.Саме швидким нейротрофічним ефектом можна пояснити покращення бульбарних функцій у деяких дітей вже наприкінці першого-другого тижня після операції. Передбачається, що разом із цим до третього-четвертого місяця встановлюються морфофункціональні зв'язки між трансплантатом і мозком господаря, за допомогою яких нейротрансплантат заміщує функції загиблих клітин мозку, що є субстратом для покращення як рухових, так і психічних функцій пацієнтів.

Експериментально досліджено вплив трансплантації ембріональної нервової тканини на реорганізацію міжнейронних взаємозв'язків. Автори досліджували закономірності відновлення міжмодульних аксональних зв'язків у зоні механічного пошкодження кори головного мозку у білих щурів з трансплантацією ембріональної нервової тканини та без неї за допомогою флуоресцентної ліпофільної мітки DIL (1,1-діоктадецил-3,3,33'-тетраметиліндокарбоціаніну перхлорат) та конфокального лазерного сканування. Було виявлено, що введення ембріональної нервової тканини в зону пошкодження забезпечує ріст аксонів, які після проходження через трансплантат з'єднуються з прилеглою тканиною мозку, тоді як без трансплантації ембріональної нервової тканини зона пошкодження є нездоланною перешкодою для росту аксонів. У цій роботі було проведено трансплантацію ембріонального (15-17-й день гестації) неокортексу. Отримані авторами результати є додатковим доказом активного впливу трансплантації ембріональної нервової тканини на посттравматичну реорганізацію міжнейронних взаємозв'язків сусідніх структурних та функціональних модулів кори головного мозку. Трансплантація ембріональної нервової тканини забезпечує часткове відновлення зв'язків між пошкодженими ділянками кори головного мозку шляхом створення сприятливих умов для росту аксонів у зоні дії нейротрофічних факторів трансплантата. Існування такого ефекту доведено експериментально та обговорюється в літературі як доказ високих пластичних можливостей пошкодженого мозку статевозрілих тварин. У зв'язку з цим трансплантація клітин наразі розглядається як оптимальна терапевтична стратегія відновлення функції пошкодженої ЦНС людини.

Отримані авторами дані щодо ефективності використання ембріональної нервової тканини головного мозку як екзогенного трансплантаційного середовища для росту аксонів підтверджують перспективи цілеспрямованого створення комунікаційних зв'язків між інтактними суміжними ділянками мозку. Актуальною видається робота з вивчення впливу трансплантації нервової тканини на динаміку функціональних параметрів центральної нервової системи. Завданням роботи було дослідити вплив трансплантації ембріонального блакитного місця (БТ) на морфофункціональні показники нейронів БТ та рухову активність реципієнтів. Реципієнтами були самки щурів Вістар, а донорами – 18-денні ембріони щурів тієї ж лінії. Трансплантацію ембріональних БТ проводили в порожнину третього шлуночка головного мозку. Гістологічно приживлення трансплантата виявлено у 75% тварин-реципієнтів. У випадках приживлення трансплантат прилягав до стінки шлуночка, заповнюючи 1/5-2/5 його просвіту, та був життєздатним. Через 1 та 6 місяців після операції трансплантована нервова тканина за своїми морфологічними характеристиками являла собою структури, які б виникли під час їхнього нормального онтогенетичного розвитку, тобто структури ЛК. Отримані авторами дані свідчать про те, що у тварин, яким було пересаджено ембріональний зачаток ЛК, змінюється динамічна активність та зростає матриксна активність хроматину ядер клітин ЛК. Отже, активність нейронів власної ЛК посилюється, але функціонально активним є і приживлений трансплантат. Відомо, що так звана локомоторна область середнього мозку практично збігається з локалізацією ЛК. Автори вважають, що основою зміни рухової активності щурів-реципієнтів є активація клітин ЛК, як власних, так і трансплантата, з вивільненням великої кількості норадреналіну, в тому числі в сегментах спинного мозку. Таким чином, передбачається, що підвищення рухової активності за умов трансплантації ЛК в інтактний мозок тварин зумовлене наявністю функціонально активного трансплантата, інтегрованого з мозком реципієнта та сприяючого активації рухової активності у щурів.

Крім того, було показано, що трансплантовані нейроепітеліальні клітини ембріональних зачатків неокортексу та спинного мозку виживають та диференціюються в нейробласти, молоді та зрілі нейрони протягом 1-2 місяців після їх пересадки в пошкоджений сідничний нерв зрілих щурів. При вивченні динаміки розвитку NADPH-позитивних нейронів ембріональних зачатків неокортексу та спинного мозку щурів у гетеротопічних алотрансплантатах (15-денний ембріон щура) на поздовжніх зрізах через сідничні нерви щурів-реципієнтів було виявлено приживлення від 70 до 80% нейротрансплантатів, що залежало від періоду спостереження. Уні- та біполярні нейробласти з округлими світлими ядрами та одним або двома ядерцями починали формуватися в трансплантатах через тиждень після операції, що супроводжувалося утворенням кластерів. Авторам не вдалося виявити серед нейробластів клітини, що містять NADPH-діафоразу (NADPH-d). Через 7 днів NADPH-позитивними були лише клітинні елементи кровоносних судин – капілярні ендотеліальні клітини в товщі трансплантата, а також ендотеліальні та гладком'язові клітини судин сідничного нерва реципієнта. Оскільки в гладком'язових клітинах судин індукція NO-синтази (NOS) відбувається під впливом IL-1, автори пов'язують появу NADPH-позитивних гладком'язових клітин у кровоносних судинах сідничного нерва з наявністю IL-1, що синтезується в пошкоджених нервових стовбурах. Відомо, що нейрогенез за умов трансплантації ембріональних зачатків мозку відбувається синхронно з розвитком нейронів in situ. Результати морфологічних досліджень свідчать про те, що диференціація деяких нейронних елементів трансплантатів через сім днів після трансплантації відповідає диференціації клітин в аналогічних ділянках мозку новонароджених щурів. Таким чином, за умов гетеротопічної трансплантації в периферичний нерв трансплантовані ембріональні нервові клітини проявляють здатність синтезувати NADPH-d. При цьому в трансплантатах спинного мозку виявляється більше нейронів, що містять NADPH-d, ніж у трансплантатах неокортексу, але синтез оксиду азоту починається в трансплантованих нейронах пізніше, ніж під час розвитку in situ. У ЦНС хребетних NOS-позитивні клітини з'являються вже у пренатальному періоді. Вважається, що NO сприяє формуванню синаптичних зв'язків у мозку, що розвивається, а наявність NOS-позитивних нервових аферентних волокон, що забезпечують синтез NO в нейробластах мозочка, стимулює міграцію та диференціацію нейронів, завдяки чому формується нормальна цитоархітектура мозку. У тектумі встановлено важливу роль NO в синапсогенезі - NOS-позитивними виявилися лише ті нейрони, які мали синаптичні зв'язки з клітинами сітківки.

Відомо, що оксид азоту є одним із регуляторів активності мозку, де він утворюється з аргініну під впливом NO-синтази, яка має діафоразну активність. У центральній нервовій системі NO синтезується в ендотеліальних клітинах кровоносних судин, мікроглії, астроцитах та нейронах різних відділів мозку. Після черепно-мозкової травми, а також під час гіпоксії та ішемії спостерігається збільшення кількості нейронів, що містять NO, який є одним із регуляторів мозкового кровотоку. Враховуючи здатність NO індукувати синапсогенез, особливий інтерес представляє вивчення формування NO-вмісних клітин в умовах нейротрансплантації на тлі травматичного пошкодження нервової тканини реципієнта.

Не менш важливим є вивчення впливу нейротрансплантації на умовнорефлекторний стереотип поведінки. В експериментах з вивчення впливу внутрішньомозкової та дистантної (між CII та CIII) трансплантації тканини ембріонального блакитного плями (17-19 день вагітності) на процеси пам'яті та вміст катехоламінів у щурів з руйнуванням лобно-скроневої неокортексу було показано, що електролітичне пошкодження лобно-скроневої кори головного мозку порушує стереотип умовнорефлекторної емоційної реакції уникнення (пам'яті), послаблює фізіологічну активність, знижує вміст норадреналіну в зоні згорнутої неокортексу, але підвищує його рівень у гіпоталамусі, де спостерігається зниження концентрації адреналіну, хоча його кількість у крові та надниркових залозах збільшується.

В результаті внутрішньомозкової трансплантації тканини ембріонального блакитного плями у 81,4% тварин відновлюється стереотип умовно-рефлекторної реакції емоційного уникнення, порушений електролітичним пошкодженням лобно-скроневих відділів кори головного мозку, нормалізується вміст адреналіну в ретикулярній формації середнього мозку, гіпоталамусі та неокортексі, а його рівень у гіпокампі навіть підвищується, що поєднується зі зниженням концентрації адреналіну в крові.

Дистанційна трансплантація тканини ембріонального блакитного місця не тільки відновлює порушений стереотип умовно-рефлекторної реакції емоційного уникнення у щурів з електролітичним пошкодженням лобно-скроневої кори, але й збільшує вміст норадреналіну та адреналіну, головним чином у гіпоталамусі, крові, надниркових залозах та серці. Передбачається, що це пов'язано з васкуляризацією трансплантата, проникненням нейромедіаторів у кров, їх проходженням через гематоенцефалічний бар'єр та активацією механізмів зворотного захоплення адреналіну та норадреналіну за типами захоплення 1, 2, 3. Автори вважають, що тривалу стабілізацію рівня норадреналіну за умов приживлення та функціонування трансплантата можна розглядати як феномен його прогресивного вивільнення в мінімальних дозах нейронами блакитного місця.

Позитивні клінічні ефекти трансплантації ембріональної нервової тканини можуть бути також зумовлені здатністю останньої впливати на процеси судинного новоутворення, в регуляції яких безпосередньо беруть участь фактори росту та цитокіни. Васкулогенез активується ангіогенними факторами росту - фактором росту судинного ендотелію (VEGF), FGF, PDGF та TGF, що синтезуються під час ішемії, що виступає ініціюючим моментом ангіогенезу. Доведено, що виснаження потенціалу росту судин відбувається в процесі старіння організму, що відіграє значну роль у патогенезі таких захворювань, як ішемічна хвороба серця та облітеруючий атеросклероз нижніх кінцівок. Ішемія тканин розвивається також при багатьох інших захворюваннях. Введення ангіогенних факторів в ішемічні зони (терапевтичний ангіогенез) стимулює ріст кровоносних судин в ішемізованих тканинах та покращує мікроциркуляцію завдяки розвитку колатерального кровообігу, що, у свою чергу, підвищує функціональну активність ураженого органу.

VEGF та FGF вважаються найбільш перспективними для клінічного застосування. Результати перших рандомізованих досліджень були обнадійливими, особливо за умови правильного вибору оптимальних доз та методів введення ангіогенних факторів. У зв'язку з цим була проведена експериментальна оцінка ангіогенної активності екстракту, виділеного з тканини мозку ембріонів людини. У роботі використовувався абортований матеріал, отриманий на двадцятому тижні вагітності та оброблений за методикою І. Мачіога та ін. (1979) у модифікації IC ANRF. Цей препарат є аналогом «Endothelial cell growth supplement» («Sigma») та являє собою природну суміш людських ангіогенних факторів, до складу якої входять VEGF та FGF. Експерименти проводилися на щурах з моделями ішемії тканин задніх кінцівок та міокарда. На основі вивчення активності лужної фосфатази у експериментальних тварин, яким вводили екстракт нервової тканини ембріонів, було виявлено збільшення кількості капілярів на одиницю площі міокарда - як у поздовжніх, так і в поперечних зрізах серця. Ангіогенна активність препарату проявлялася при безпосередньому введенні в ішемічну зону, а також у разі системного (внутрішньом'язового) введення, що призводило до зменшення середньої площі постінфарктного рубця.

У будь-якому варіанті трансплантації ембріональної нервової тканини вкрай важливо правильно вибрати гестаційний вік пересадженого ембріонального матеріалу. Порівняльний аналіз ефективності клітинних препаратів з ембріонального вентрального мезенцефалону 8-, 14- та 16-17-денних ембріонів щурів через три місяці після інтрастріатальної нейротрансплантації зрілим щурам з паркінсонізмом в автоматизованому тесті апоморфін-індукованої рухової асиметрії виявив значно вищу ефективність препаратів клітин ЦНС з 8-денних ембріонів та найнижчу ефективність з 16-17-денної ембріональної нервової тканини. Отримані дані корелювали з результатами гістоморфологічного аналізу, зокрема, з розміром трансплантатів, вираженістю гліальної реакції та кількістю дофамінергічних нейронів у них.

Різниця в терапевтичному ефекті клітин ембріональної нервової тканини може бути пов'язана як зі ступенем незрілості та прихильності самих клітин, так і з їхньою різною реакцією на фактори росту, що вивільняються в зоні індукованого пошкодження дофамінергічних нейронів. Зокрема, вплив EGF та FGF2 на розвиток теленцефальних нервових стовбурових клітин in vivo відбувається на різних стадіях ембріогенезу. Нейроепітеліальні клітини 8,5-денних ембріонів мишей при культивуванні in vitro в безсиворотковому середовищі проліферують у присутності FGF2, але не EGF, на який реагують лише популяції стовбурових клітин, виділених з мозку ембріонів на пізніших стадіях розвитку. Водночас нервові стовбурові клітини проліферують у відповідь на кожен з цих мітогенів та адитивно посилюють ріст у разі додавання EGF та FGF2 до культури з низькою щільністю посіву клітин. EGF-реактивні нейронні стовбурові клітини із зародкових зон 14,5-денних ембріонів мишей вважаються лінійними нащадками FGF-реактивних нейронних стовбурових клітин, які вперше з'являються після 8,5 днів гестації. Потенційний фенотип нейронних стовбурових та прогеніторних клітин залежить від комплексного впливу їхнього мікрооточення. Імунофенотипування нейронних клітин з перивентрикулярної та гіпокампальної зон 8-12- та 17-20-тижневих ембріонів людини за допомогою проточної цитофлуориметрії виявило значну варіабельність, пов'язану як з гестаційним віком, так і з індивідуальними конституційними особливостями донорського біоматеріалу. Коли ці нейронні клітини-попередники культивують у селективному безсиворотковому середовищі з EGF, FGF2 та NGF, нейросфери утворюються зі швидкістю, яка суттєво залежить від гестаційного віку. Клітини з різних ділянок мозку 5-13-тижневих ембріонів людини при короткочасному культивуванні з FGF2 у моношаровій культурі на ламініновому субстраті за наявності слідових кількостей факторів росту зберігають проліферацію протягом 6 тижнів з високим відсотком нестин-позитивних клітин на тлі спонтанного утворення клітин з маркерами всіх трьох ліній нейронної диференціації. Клітини, виділені з мезенцефалону ембріона людини при терміні гестації, що перевищує 13 тижнів, проліферують під впливом EGF, а також утворюють нейросфери. Синергетичний ефект був досягнутий при використанні комбінації EGF та FGF2. Найбільш інтенсивна проліферація нейронних стовбурових клітин з утворенням нейросфер спостерігається при культивуванні тканини кори головного мозку 6-8-тижневих ембріонів людини за наявності EGF2, IGF1 та 5% кінської сироватки на субстраті з фібронектином.

Слід зазначити, що питання щодо гестаційного віку та відділу ембріональної ЦНС, тканину якого краще використовувати з метою нейротрансплантації, залишаються відкритими. Відповіді на них слід шукати в нейрогенезі мозку, що розвивається, який триває протягом усього пренатального періоду – у той час, коли епітелій нервової трубки формує багатошарову структуру. Вважається, що джерелом стовбурових клітин та нових нейронів є радіальна глія, що складається з видовжених клітин з довгими відростками, радіально спрямованими відносно стінки мозкових міхурців та контактуючими з внутрішньою поверхнею шлуночків та зовнішньою піальною поверхнею стінки мозку. Раніше радіальна глія була наділена лише функцією нейронного тракту, по якому нейробласти мігрують з вентральної області до поверхневих відділів, а також їй відводилася скелетна роль у процесі формування правильної ламінарної організації кори. Сьогодні встановлено, що в міру розвитку радіальна глія трансдиференціюється в астроцити. Значна його частина у ссавців редукується одразу після народження, проте у тих видів тварин, у яких радіальна глія зберігається до дорослого віку, нейрогенез активно відбувається в постнатальний період.

У культурі радіальні гліальні клітини з ембріонального неокортексу гризунів утворювали нейрони та гліальні клітини, причому нейрони переважно формувалися на 14-16-денному гестаційному віці розвитку ембріона (період максимальної інтенсивності нейрогенезу в корі головного мозку мишей та щурів). На 18-й день ембріогенезу диференціація зміщувалася в бік утворення астроцитів зі значним зменшенням кількості новоутворених нейронів. Мічення радіальних гліальних клітин за допомогою GFP in situ дозволило виявити асиметричний поділ мічених клітин у порожнині мозкових міхурців 15-16-денних ембріонів щурів з появою дочірніх клітин з імунологічними та електрофізіологічними характеристиками нейробластів. Примітно, що, згідно з результатами динамічних спостережень, нейробласти, що розвиваються, використовують материнську клітину радіальних гліальних клітин для міграції до піальної поверхні.

Ендогенним маркером радіальної глії є проміжний філаментний білок нестин. За допомогою методу флуоресцентного потокового сортування клітин, мічених ретровірусом, асоційованим з GFP та експресованим під контролем нестину, було показано, що стовбурові клітини зубчастої звивини та гілусу гіпокампу людини (матеріал був отриманий під час операцій з приводу епілепсії) експресують нестин. Отже, вони належать до радіальної глії, яка у людини, як і в інших ссавців, зберігається лише в зубчастій звивині.

Водночас ефективність клітинної трансплантації визначається не лише високою життєздатністю донорських клітин, їх потенціалом диференціації та здатністю заміщувати дефектні клітини, але, перш за все, їх спрямованою міграцією. Повна функціональна інтеграція трансплантованих клітин залежить від їхньої міграційної здатності – без порушення цитоархітектури мозку реципієнта. Оскільки радіальна глія зазнає майже повної редукції в постнатальному періоді, необхідно було з'ясувати, як донорські клітини можуть переміщатися із зони трансплантації до місця пошкодження мозку у дорослих реципієнтів. Існує два варіанти міграції клітин до ЦНС, які не залежать від радіальної глії: явище тангенціальної міграції або переміщення нейробластів під час розвитку кори головного мозку перпендикулярно до мережі радіальної глії, а також міграція «в ряд» або «уздовж ланцюга». Зокрема, міграція нейронних клітин-попередників із ростральної субшлуночкової зони до нюхової цибулини відбувається як послідовність щільно прилеглих клітин, оточених гліальними клітинами. Вважається, що ці клітини використовують клітини-партнери як субстрат міграції, а основним регулятором таких міжклітинних взаємодій є PSA-NCAM (полісіалільована молекула адгезії нейронних клітин). Отже, міграція нейронів не обов'язково вимагає участі радіальної глії або вже існуючих аксональних зв'язків. Екстрарадіальна форма руху клітин по «нитці» вздовж рострального міграційного тракту зберігається протягом усього життя, що вказує на реальну можливість цілеспрямованої доставки трансплантованих нейронних клітин-попередників до зрілої нервової системи.

Існує гіпотеза про наявність лінії стовбурових клітин в онтогенезі мозку, згідно з якою на ранніх стадіях розвитку мозку стовбурова клітина є нейроепітеліальною клітиною, яка в міру дозрівання трансдиференціюється в радіальну глію. У дорослому віці роль стовбурових клітин виконують клітини, що мають характеристики астроцитів. Незважаючи на низку спірних моментів (суперечності щодо стовбурових клітин гіпокампу, а також глибоких відділів мозку, які не мають шаруватої кори та розвиваються з таламічних горбків, де радіальна глія відсутня), чітка та проста концепція послідовної зміни фенотипу стовбурових клітин протягом онтогенезу виглядає дуже привабливою.

Вплив факторів мікрооточення на детермінацію та подальшу диференціацію нейронно-диференційованих клітин був чітко продемонстрований шляхом трансплантації зрілих стовбурових клітин спинного мозку щурів у різні області зрілої нервової системи. Коли стовбурові клітини трансплантували в зубчасту звивину або в область міграції нейронів у нюхових цибулинах, спостерігалася активна міграція трансплантованих клітин з утворенням численних нейронів. Трансплантація стовбурових клітин у спинний мозок та область рогу Аммона призвела до утворення астроцитів та олігодендроцитів, тоді як трансплантація в зубчасту звивину призвела до утворення не лише гліальних клітин, а й нейронів.

У статевозрілого щура кількість клітин, що діляться, у зубчастій звивині може сягати кількох тисяч на добу – менше 1% від загальної кількості гранулярних клітин. Нейрони становлять 50-90% клітин, астоцити та інші гліальні елементи – близько 15%. Решта клітин не мають антигенних ознак нейронів та глії, але містять антигени ендотеліальних клітин, що вказує на тісний зв'язок між нейрогенезом та ангіогенезом у зубчастій звивині. Прихильники можливості диференціації ендотеліальних клітин у нейрональні клітини-попередники посилаються на здатність ендотеліальних клітин in vitro синтезувати BDNF.

Швидкість самозбірки нейронних ланцюгів вражає: під час диференціації клітини-попередники гранулярних клітин мігрують до зубчастої звивини та формують відростки, що ростуть у напрямку до SAZ-зони рогу Аммона та формують синапси з пірамідальними глутаматергічними та інтеркалярними гальмівними нейронами. Новостворені гранулярні клітини інтегруються в існуючі нейронні ланцюги протягом 2 тижнів, а перші синапси з'являються вже через 4-6 днів після появи нових клітин. Шляхом частого введення BrdU або 3H-тимідину (один з методів ідентифікації дорослих стовбурових клітин) зрілим тваринам у рогу Аммона було виявлено велику кількість мічених нейронів та астроцитів, що вказує на можливість формування нових нейронів не тільки в зубчастій звивині, але й в інших частинах гіпокампу. Інтерес до процесів поділу, диференціації та загибелі клітин у зубчастій звивині гіпокампу зрілого мозку також зумовлений тим, що нейрони, що утворюються тут, локалізуються в одній з ключових ділянок гіпокампу, що відповідає за процеси навчання та пам'яті.

Таким чином, сьогодні встановлено, що нейронні клітини-попередники походять з клітин субепендимальної зони бічного шлуночка статевозрілих гризунів. Вони мігрують вздовж рострального міграційного тракту, утвореного поздовжньо орієнтованими астрогліальними клітинами, до нюхової цибулини, де вбудовуються в шар гранулярних клітин і диференціюються в нейрони цієї структури. Міграцію нейронних клітин-попередників виявлено в ростральному міграційному тракті дорослих мавп, що вказує на можливість формування нових нейронів у нюховій цибулині приматів. Нервові стовбурові клітини були виділені з нюхової цибулини дорослої людини та перенесені в лінії, клоновані клітини яких диференціюються в нейрони, астроцити та олігодендроцити. Стовбурові клітини були знайдені в гіпокампі зрілого мозку щурів, мишей, мавп та людини. Нервові стовбурові клітини субгранулярної зони зубчастої фасції є джерелом клітин-попередників, що мігрують до медіальних та латеральних кінцівок гіпокампу, де вони диференціюються в зрілі гранулярні клітини та гліальні елементи. Аксони de novo сформованих нейронів зубчастої фасції простежуються до поля CA3, що свідчить про участь новоутворених нейронів у реалізації функцій гіпокампу. В асоціативних зонах неокортексу дорослих мавп виявлено нейрональні клітини-попередники, що мігрують із субшлуночкової зони. У VI шарі неокортексу мозку миші нові пірамідні нейрони виявляються через 2-28 тижнів після індукованого пошкодження та загибелі нативних нейронів цього шару внаслідок міграції раніше сплячих клітин-попередників субшлуночкової зони. Нарешті, реальність постнатального нейрогенезу в мозку людини підтверджується дворазовим збільшенням кількості кортикальних нейронів, яке триває протягом перших 6 років після народження.

Неабияке значення для практичної клітинної трансплантології має питання регуляції процесів розмноження та диференціації нервових стовбурових та прогениторних клітин. Найважливішими факторами, що пригнічують проліферацію нервових клітин-попередників, є глюкокортикоїди, які різко зменшують кількість поділів, тоді як видалення надниркових залоз, навпаки, значно збільшує кількість мітозів (Gould, 1996). Примітно, що морфогенез зубчастої звивини у гризунів найбільш інтенсивний протягом перших двох тижнів постнатального розвитку в період відсутності реакції на стрес на тлі різкого зниження продукції та секреції стероїдних гормонів кори надниркових залоз. Кортикостероїди пригнічують міграцію гранулярних клітин – нові нейрони не вбудовуються в зернистий шар зубчастої звивини, а залишаються в воротах надниркових залоз. Передбачається, що одночасно порушуються процеси формування синаптичних зв'язків. Захист клітин від такої «стероїдної агресії» здійснюється шляхом мінімальної експресії мінералокортикоїдних та глюкокортикоїдних рецепторів на проліферуючих гранулярних клітинах не лише під час розвитку зубчастої звивини, але й у дорослих тварин. Однак, з усіх нейронів мозку саме нейрони гіпокампу характеризуються найвищим вмістом глюкокортикоїдних рецепторів, що й зумовлює стресовий вплив на гіпокамп. Психоемоційний стрес та стресові ситуації пригнічують нейрогенез, а хронічний стрес різко знижує здатність тварин до здобуття нових навичок та навчання. Більш виражений негативний вплив хронічного стресу на нейрогенез цілком зрозумілий, якщо врахувати переважно сплячий стан нейронних стовбурових клітин. При іммобілізації вагітних щурів (для гризунів – надзвичайно сильний стресовий фактор) було виявлено, що пренатальний стрес також викликає зменшення кількості клітин зубчастої звивини та значно пригнічує нейрогенез. Відомо, що глюкокортикоїди беруть участь у патогенезі депресивних станів, морфологічним еквівалентом яких є пригнічення нейрогенезу, патологічна реорганізація нейронів та міжнейронних зв'язків, а також загибель нервових клітин. З іншого боку, антидепресантні хіміотерапевтичні засоби активують утворення нейронів de novo, що підтверджує зв'язок між процесами утворення нових нейронів у гіпокампі та розвитком депресії. Естрогени мають значний вплив на нейрогенез, ефекти якого протилежні дії глюкокортикостероїдів та полягають у підтримці проліферації та життєздатності нейронних клітин-попередників. Слід зазначити, що естрогени значно підвищують здатність тварин до навчання. Деякі автори пов'язують циклічні зміни кількості гранулярних клітин та їх надлишок у самок з впливом естрогенів.

Відомо, що нейрогенез контролюється EGF, FGF та BDNF, проте механізми впливу зовнішніх сигналів на стовбурові клітини від мітогенів та факторів росту вивчені недостатньо. Встановлено, що PDGF in vitro підтримує нейрональний напрямок диференціації клітин-попередників, а циліарний нейротрофічний фактор (CNTF), подібно до трийодтироніну, стимулює утворення переважно гліальних елементів – астроцитів та олігодендроцитів. Гіпофізний аденілатциклазу-активуючий білок (PACAP) та вазоактивний кишковий пептид (VIP) активують проліферацію нейронних клітин-попередників, але водночас пригнічують процеси диференціації дочірніх клітин. Опіоїди, особливо у разі їх тривалого впливу, значно пригнічують нейрогенез. Однак опіоїдні рецептори не були ідентифіковані в стовбурових клітинах та нейронних клітинах-попередниках зубчастої звивини (вони присутні в диференціюючих нейронах ембріонального періоду), що не дозволяє оцінити прямий вплив опіоїдів.

Потреби практичної регенеративно-пластичної медицини змусили дослідників звернути особливу увагу на вивчення плюри- та мультипотентності стовбурових клітин. Реалізація цих властивостей на рівні регіональних стовбурових клітин дорослого організму могла б у майбутньому забезпечити виробництво необхідного трансплантаційного матеріалу. Вище було показано, що епігенетична стимуляція нейронних стовбурових клітин дозволяє отримувати проліферуючі клітини, вже преформовані за нейронними фенотипами, що обмежує їх кількість. У випадку використання тотипотентних властивостей ембріональної стовбурової клітини, проліферація до отримання достатньої кількості клітин відбувається раніше, ніж нейронна диференціація, і розмножені клітини легко перетворюються на нейронний фенотип. Для отримання нейронних стовбурових клітин ЕСК виділяють з внутрішньої клітинної маси бластоцисти та культивують в обов'язковій присутності LIF, що зберігає їх тотипотентність та здатність до необмеженого поділу. Після цього індукують нейронну диференціацію ЕСК за допомогою ретиноєвої кислоти. Трансплантація отриманих нейронних стовбурових клітин у стріатум, пошкоджений хіноліном та 6-гідроксидофаміном, супроводжується їх диференціацією в дофамінергічні та серотонінергічні нейрони. Після ін'єкції у шлуночки ембріонального мозку щура, нейронні клітини-попередники, отримані з ЕСК, мігрують до різних ділянок мозку реципієнта, включаючи кору, стріатум, перегородку, таламус, гіпоталамус та мозочок. Клітини, що залишаються в порожнині шлуночків, утворюють епітеліальні структури, що нагадують нервову трубку, а також окремі острівці ненервальної тканини. У паренхімі мозку ембріона-реципієнта трансплантовані клітини продукують три основні типи клітин нервової системи. Деякі з них мають видовжені апікальні дендрити, тіла пірамідальних клітин та базальні аксони, що проектуються в мозолисте тіло. Астроцити донорського походження поширюють відростки до сусідніх капілярів, а олігодендроцити тісно контактують з мієліновими муфтами, беручи участь у формуванні мієліну. Таким чином, нейронні клітини-попередники, отримані з ЕСК in vitro, здатні до спрямованої міграції та регіональної диференціації, адекватної сигналам мікрооточення, забезпечуючи багато ділянок мозку, що розвивається, нейронами та глією.

Деякі автори розглядають можливість де- та трансдиференціації регіональних стовбурових клітин дорослого організму. Непрямим підтвердженням дедиференціації клітин у культурі з розширенням їх потенціалів є дані про приживлення нервових стовбурових клітин миші в червоному кістковому мозку з подальшим розвитком з них клітинних ліній, що дають функціонально активні клітини периферичної крові. Крім того, трансплантація генетично мічених (LacZ) клітин нейросфери, отриманих зі зрілого або ембріонального мозку, в мозок опромінених мишей з пригніченим кровотворенням, призвела до утворення не тільки нейронних похідних зі стовбурових клітин, але й спричинила генерацію клітин крові, що свідчить про плюрипотентність нейронних стовбурових клітин, що реалізується поза мозком. Таким чином, нейронна стовбурова клітина здатна диференціюватися в клітини крові під впливом сигналів з мікрооточення кісткового мозку з попередньою трансформацією в гемопоетичну стовбурову клітину. З іншого боку, при трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку в мозок було встановлено їх диференціацію під впливом мікрооточення тканини мозку в гліальні та нейронні клітини. Отже, потенціал диференціації нервових та гемопоетичних стовбурових клітин не обмежується тканинною специфічністю. Іншими словами, фактори локального мікрооточення, відмінні від тих, що характерні для тканин мозку та кісткового мозку, здатні змінювати напрямок диференціації цих клітин. Було показано, що нервові стовбурові клітини, введені у венозну систему опромінених мишей, створюють популяції мієлоїдних, лімфоїдних та незрілих гемопоетичних клітин у селезінці та кістковому мозку. In vitro було встановлено вплив морфогенетичних білків кісткового мозку (BMP) на виживання та диференціацію нервових стовбурових клітин, що визначає, як і на ранніх стадіях ембріогенезу, їх розвиток у нервовому або гліальному напрямках. У культурах нервових стовбурових клітин з 16-денних ембріонів щурів BMP індукують утворення нейронів та астроглії, тоді як у культурах стовбурових клітин, отриманих з перинатального мозку, утворюються лише астроцити. Крім того, BMP пригнічують генерацію олігодендроцитів, які з'являються in vitro лише при додаванні антагоніста BMP noggin.

Процеси трансдиференціації не є видоспецифічними: гемопоетичні стовбурові клітини кісткового мозку людини, трансплантовані в стріатум дорослих щурів, мігрують до білої речовини зовнішньої капсули, іпси- та контралатеральної неокортексу, де вони утворюють астроцитоподібні клітинні елементи (Azizi et al., 1998). Коли стовбурові клітини кісткового мозку алотрансплантують у латеральний шлуночок новонароджених мишей, міграцію гемопоетичних стовбурових клітин можна простежити до структур переднього мозку та мозочка. У стріатумі та молекулярному шарі гіпокампу мігруючі клітини трансформуються в астроцити, а в нюховій цибулині, внутрішньому шарі гранулярних клітин мозочка та ретикулярній формації стовбура мозку вони утворюють нейроноподібні клітини з позитивною реакцією на нейрофіламенти. Після внутрішньовенного введення гемопоетичних клітин дорослим мишам, мічені GFP мікро- та астроцити були виявлені в неокортексі, таламусі, стовбурі мозку та мозочку.

Крім того, мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку, які дають початок усім типам клітин сполучної тканини, також можуть зазнавати нейронної трансдиференціації за певних умов (нагадаємо, що ембріональним джерелом мезенхіми є клітини нервового гребеня). Було показано, що стромальні клітини кісткового мозку людини та миші, культивовані in vitro у присутності EGF або BDNF, експресують маркер нейронних клітин-попередників нестин, а додавання різних комбінацій факторів росту призводить до утворення клітин з маркерами глії (GFAP) та нейронів (ядерний білок, NeuN). Мічені сингенні мезенхімальні стовбурові клітини, трансплантовані в латеральний шлуночок мозку новонароджених мишей, мігрують та локалізуються в передньому мозку та мозочку, не порушуючи цитоархітектури мозку реципієнта. Мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку диференціюються в зрілі астроцити в стріатумі та молекулярному шарі гіпокампу, і заселяють нюхову цибулину, зернисті шари мозочка та ретикулярну формацію, де вони трансформуються в нейрони. Мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку людини здатні диференціюватися в макроглію in vitro та інтегруватися в структури мозку щурів після трансплантації. Пряма трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку в гіпокамп дорослих щурів також супроводжується їх міграцією в паренхіму мозку та нейрогліальною диференціацією.

Вважається, що трансплантація стовбурових клітин кісткового мозку може розширити можливості клітинної терапії захворювань ЦНС, що характеризуються надмірною патологічною загибеллю нейронів. Слід, однак, зазначити, що не всі дослідники визнають факт взаємної трансформації нервових та гемопоетичних стовбурових клітин, особливо in vivo, що знову ж таки пов'язано з відсутністю надійного маркера для оцінки їх трансдиференціації та подальшого розвитку.

Трансплантація стовбурових клітин відкриває нові горизонти для клітинної генної терапії спадкової неврологічної патології. Генетична модифікація нервових стовбурових клітин передбачає вбудовування генетичних регуляторних конструкцій, продукти яких взаємодіють з білками клітинного циклу в режимі автоматичної регуляції. Трансдукція таких генів в ембріональні клітини-попередники використовується для розмноження нервових стовбурових клітин. Більшість генетично модифікованих клітинних клонів поводяться як стабільні клітинні лінії, не виявляючи ознак трансформації in vivo або in vitro, але мають виражену здатність до контактного гальмування проліферації. При трансплантації розмножені трансфіковані клітини інтегруються в тканину реципієнта, не порушуючи цитоархітектури та не зазнаючи пухлинної трансформації. Донорські нервові стовбурові клітини не деформують зону інтеграції та на рівних конкурують за простір з клітинами-попередниками хазяїна. Однак на 2-3-й день інтенсивність поділу трансфектованих клітин різко знижується, що відповідає контактному гальмуванню їх проліферації in vitro. Ембріони-реципієнти трансфектантів нервових стовбурових клітин не мають аномалій у розвитку центральної нервової системи, всі ділянки мозку, що контактують з трансплантатом, розвиваються нормально. Після трансплантації клони нервових стовбурових клітин швидко мігрують із зони ін'єкції та часто виходять за межі відповідних ембріональних зон вздовж рострального тракту, адекватно інтегруючись з іншими ділянками мозку. Інтеграція генетично модифікованих клонів та трансфікованих клітинних ліній нервових стовбурових клітин у мозок організму-господаря характерна не лише для ембріонального періоду: ці клітини імплантуються в численні ділянки центральної нервової системи плода, новонародженого, дорослої людини та навіть старіючого організму-реципієнта та демонструють здатність до адекватної інтеграції та диференціації. Зокрема, після трансплантації в порожнину шлуночків мозку трансфіковані клітини мігрують, не пошкоджуючи гематоенцефалічний бар'єр, та стають невід'ємними функціональними клітинними компонентами тканини мозку. Донорські нейрони формують відповідні синапси та експресують специфічні іонні канали. При збереженні цілісності гематоенцефалічного бар'єру астроглія, похідна трансфектованих нервових стовбурових клітин, поширює відростки до судин головного мозку, а донорські олігодендроцити експресують основний білок мієліну та мієлінізують нейрональні відростки.

Крім того, нейронні стовбурові клітини трансфікуються для використання як клітинні вектори. Такі векторно-генетичні конструкції забезпечують стабільну експресію in vivo чужорідних генів, що беруть участь у розвитку нервової системи, або використовуються для корекції існуючих генетичних дефектів, оскільки продукти цих генів здатні компенсувати різні біохімічні аномалії центральної нервової системи. Висока міграційна активність трансфікованих стовбурових клітин та адекватна імплантація в зародкові зони різних ділянок мозку, що розвивається, дозволяють сподіватися на повне відновлення спадкової недостатності клітинних ферментів. При моделюванні синдрому атаксії-телеангіектазії (мутантні лінії мишей pg та pcd) клітини Пуркіньє зникають з мозочка експериментальних тварин протягом перших тижнів постнатального розвитку. Було показано, що введення нейронних стовбурових клітин у мозок таких тварин супроводжується їх диференціацією в клітини Пуркіньє та гранулярні нейрони. У мутантів pcd частково коригуються порушення координації рухів та зменшується інтенсивність тремору. Подібні результати були отримані шляхом трансплантації клонованих людських нейронних стовбурових клітин приматам, у яких дегенерація клітин Пуркіньє була індукована за допомогою онконази. Після трансплантації донорські нервові стовбурові клітини були виявлені в гранулярному, молекулярному та шарах клітин Пуркіньє паренхіми мозочка. Отже, генетична модифікація нервових клітин-попередників може забезпечити стабільну комітовану модифікацію фенотипу, стійку до зовнішніх впливів. Це особливо важливо при патологічних процесах, пов'язаних з розвитком у реципієнта факторів, що перешкоджають виживанню та диференціації донорських клітин (наприклад, під час імунної агресії).

Мукополісахаридоз VII типу у людей характеризується нейродегенерацією та прогресуючою інтелектуальною недостатністю, що у мишей моделюється делеційною мутацією в гені бета-глюкуронідази. Після трансплантації трансфікованих нервових стовбурових клітин, що секретують бета-глюкуронідазу, у шлуночки головного мозку новонароджених дефектних мишей-реципієнтів, донорські клітини спочатку виявляються в термінальній зоні, а потім поширюються по всій паренхімі мозку, стабільно коригуючи цілісність лізосом у мозку мутантних мишей. У моделі хвороби Тея-Сакса ретровірусно-трансдуковані нервові стовбурові клітини, при внутрішньоутробному введенні плодам мишей та трансплантації новонародженим мишам, забезпечують ефективну експресію бета-субодиниці бета-гексозамінідази у реципієнтів з мутацією, що призводить до патологічного накопичення бета2-гангліозиду.

Ще одним напрямком регенеративної медицини є стимуляція проліферативного та диференціювального потенціалу власних нейронних стовбурових клітин пацієнта. Зокрема, нейронні стовбурові клітини секретують NT-3 під час гемісекції спинного мозку та асфіксії головного мозку у щурів, експресують NGF та BDNF у перегородці та базальних гангліях, тирозингідроксилази у стріатумі, а також рілін у мозочку та основний білок мієліну у головному мозку.

Однак питанням стимуляції нейрогенезу явно приділяється недостатньо уваги. Нечисленні дослідження свідчать про те, що функціональне навантаження на нервові центри, що відповідають за розрізнення запахів, відображається на утворенні нових нейронів. У трансгенних мишей з дефіцитом молекул нейрональної адгезії зниження інтенсивності нейрогенезу та зменшення кількості нейронів, що мігрують до нюхових цибулин, поєднувалося з порушенням здатності розрізняти запахи, хоча поріг сприйняття запахів та короткочасна нюхова пам'ять не були порушені. Функціональний стан клітин зубчастої звивини відіграє важливу роль у регуляції нейрогенезу: ослаблення впливу глутамату на гранулярні клітини після руйнування енторинальної кори сприяє проліферації та диференціації нейронів, а стимуляція волокон перфорантного шляху (основного аферентного входу до гіпокампу) викликає гальмування нейрогенезу. Антагоністи NMDA-рецепторів активують процеси утворення нових нейронів, тоді як агоністи, навпаки, знижують інтенсивність нейрогенезу, що за своєю дією нагадує дію глюкокортикостероїдів. У літературі зустрічаються суперечливі результати досліджень: інформація про експериментально доведений гальмівний вплив збуджувального нейромедіатора глутамату на нейрогенез не узгоджується з даними про стимуляцію проліферації клітин-попередників та появу нових нейронів зі збільшенням судомної активності в гіпокампі тварин з експериментальними каїновими та пілокарпіновими моделями епілепсії. Водночас, у традиційній моделі епілепсії, спричиненої багаторазовою субпороговою стимуляцією певної ділянки мозку (кіндлінг) та характеризується менш вираженою загибеллю нейронів, інтенсивність нейрогенезу зростає лише в пізній фазі кіндлінгу, коли в гіпокампі спостерігаються пошкодження та загибель нейронів. Показано, що при епілепсії судомна активність стимулює нейрогенез з аномальною локалізацією нових гранулярних нейронів, багато з яких з'являються не тільки в зубчастій звивині, але й у воротах корінця. Такі нейрони мають велике значення в розвитку проростання мохових волокон, оскільки їхні аксони утворюють нормально відсутні зворотні колатералі, що формують численні синапси з сусідніми гранулярними клітинами.

Використання регіональних нейронних стовбурових клітин відкриває нові перспективи для застосування клітинної трансплантації в лікуванні метаболічних та генетичних нейродегенеративних захворювань, демієлінізуючих захворювань та посттравматичних розладів центральної нервової системи. Перед проведенням замісної клітинної трансплантації за одним із методів проводиться відбір та розширення необхідного типу нейронних клітин-попередників ex vivo з метою їх подальшого введення безпосередньо в пошкоджену ділянку мозку. Терапевтичний ефект у цьому випадку зумовлений заміщенням пошкоджених клітин або локальним вивільненням факторів росту та цитокінів. Цей метод регенеративно-пластичної терапії вимагає трансплантації достатньо великої кількості клітин із заздалегідь визначеними функціональними характеристиками.

Подальші дослідження молекулярних характеристик та регенеративно-пластичного потенціалу зрілих стовбурових клітин мозку, а також здатності регіональних стовбурових клітин різного тканинного походження до трансдиференціації також слід вважати доцільними. Сьогодні вже проведено скринінг антигенів гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку з визначенням маркерної комбінації клітин, здатних трансдиференціюватися в клітини-попередники нейральних стовбурових клітин (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Отримано клітини, які утворюють нейросфери in vitro та формують нейрони при пересадці в мозок новонароджених імунодефіцитних мишей. Цікавими для клітинної ксенотрансплантології є результати досліджень щодо можливості перехресної трансплантації стовбурових клітин у особин еволюційно віддалених таксонів. Результати імплантації нейральних стовбурових клітин у область пухлини мозку залишаються без належної інтерпретації: трансплантовані клітини активно мігрують по всьому об'єму пухлини, не виходячи за його межі, а при введенні клітин в інтактну частину мозку спостерігається їх активна міграція в бік пухлини. Питання про біологічне значення такої міграції залишається відкритим.

Слід зазначити, що успішна трансплантація нервових стовбурових клітин, а також інших нейронних клітин-попередників, отриманих з ЕСК, можлива лише за умови використання високоочищених нейронних клітин-попередників, оскільки недиференційовані ембріональні стовбурові клітини неминуче трансформуються в тератоми та тератокарциноми при пересадці дорослому імунокомпетентному реципієнту. Навіть мінімальна кількість погано диференційованих клітин у суспензії донорських клітин різко підвищує пухлиногенність трансплантата та неприйнятно збільшує ризик розвитку пухлини або утворення ненервальної тканини. Отримання однорідних популяцій нейронних клітин-попередників можливе при використанні клітин, що виникають на певних етапах нормального ембріогенезу, як альтернативного джерела донорської тканини. Інший підхід передбачає ретельне усунення небажаних клітинних популяцій шляхом лінійно-специфічного відбору. Використання ЕСК для нейротрансплантації після їх недостатнього впливу на фактори росту in vitro також є небезпечним. У цьому випадку не можна виключати збій програми нейронної диференціації з формуванням структур, властивих нервовій трубці.

Сьогодні цілком очевидно, що нейронні стовбурові клітини проявляють тропізм до патологічно змінених ділянок центральної нервової системи та мають виражений регенеративно-пластичний ефект. Мікрооточення в місці загибелі клітин нервової тканини моделює напрямок диференціації трансплантованих клітин, поповнюючи таким чином дефіцит специфічних нейронних елементів у зоні ураження ЦНС. При деяких нейродегенеративних процесах виникають нейрогенні сигнали для рекапітуляції нейрогенезу, і нейронні стовбурові клітини зрілого мозку здатні реагувати на цю повчальну інформацію. Численні експериментальні дані слугують наочною ілюстрацією терапевтичного потенціалу нейронних стовбурових клітин. Інтрацистернальне введення клону нейронних стовбурових клітин тваринам з лігуванням середньої мозкової артерії (модель ішемічного інсульту) допомагає зменшити площу та об'єм деструктивно зміненої ділянки мозку, особливо у випадку трансплантації нейронних стовбурових клітин разом з FGF2. Імуноцитохімічно спостерігається міграція донорських клітин до ішемічної зони з подальшою їх інтеграцією з інтактними клітинами мозку реципієнта. Трансплантація незрілих клітин нейроепітеліальної лінії миші MHP36 у мозок щурів з експериментальним інсультом покращує сенсомоторну функцію, а введення цих клітин у шлуночки головного мозку посилює когнітивну функцію. Трансплантація нейрально преформованих гемопоетичних клітин кісткового мозку людини щурам усуває дисфункцію кори головного мозку, спричинену ішемічним пошкодженням. При цьому ксеногенні нейронні клітини-попередники мігрують з місця ін'єкції до зони деструктивних змін у тканині мозку. Внутрішньочерепна трансплантація гомологічних клітин кісткового мозку при травматичному пошкодженні кори головного мозку у щурів призводить до часткового відновлення рухової функції. Донорські клітини приживаються, проліферують, зазнають нейронної диференціації в нейрони та астроцити та мігрують до ураження. При введенні в стріатум дорослих щурів з експериментальним інсультом клоновані нейронні стовбурові клітини людини заміщують пошкоджені клітини ЦНС та частково відновлюють порушену функцію мозку.

Нейронні стовбурові клітини людини переважно виділяють із ембріонального теленцефалону, який розвивається значно пізніше, ніж більш каудально розташовані частини нервового стовбура. Показано можливість виділення нейронних стовбурових клітин зі спинного мозку плода людини віком 43-137 днів, оскільки за наявності EGF та FGF2 ці клітини утворюють нейросфери та проявляють мультипотентність на ранніх пасажах, диференціюючись у нейрони та астроцити. Однак тривале культивування нейронних клітин-попередників (понад 1 рік) позбавляє їх мультипотентності – такі клітини здатні диференціюватися лише в астроцити, тобто стають уніпотентними. Регіональні нейронні стовбурові клітини можна отримати в результаті часткової бульбектомії та після розмноження в культурі за наявності LIF пересадити тому ж пацієнту з нейродегенеративними змінами в інших відділах центральної нервової системи. У клініці вперше була проведена замісна клітинна терапія з використанням нейронних стовбурових клітин для лікування пацієнтів з інсультом, що супроводжується пошкодженням базальних гангліїв головного мозку. В результаті трансплантації донорських клітин відзначено покращення клінічного стану більшості пацієнтів.

Деякі автори вважають, що здатність нейронних стовбурових клітин до приживлення, міграції та інтеграції в різні ділянки нервової тканини у разі пошкодження ЦНС відкриває необмежені можливості для клітинної терапії не лише локальних, але й екстенсивних (інсульт або асфіксія), мультифокальних (розсіяний склероз) і навіть глобальних (більшість спадкових метаболічних розладів або нейродегенеративних деменцій) патологічних процесів. Дійсно, коли клоновані нейронні стовбурові клітини миші та людини пересаджують тваринам-реципієнтам (мишам і приматам відповідно) з дегенерацією дофамінергічних нейронів у мезостріатальній системі, індукованою введенням метилфенілтетрапіридину (модель хвороби Паркінсона) за 8 місяців до трансплантації, донорські нейронні стовбурові клітини інтегруються в ЦНС реципієнта. Через місяць трансплантовані клітини локалізуються двосторонньо вздовж середнього мозку. Деякі з отриманих нейронів донорського походження експресують тирозингідролазу за відсутності ознак імунної реакції на трансплантат. У щурів, яким вводили 6-гідроксидопамін (інша експериментальна модель хвороби Паркінсона), адаптація трансплантованих клітин до мікрооточення в мозку хазяїна визначалася умовами культивування нейронних стовбурових клітин перед їх трансплантацією. Нейронні стовбурові клітини, швидко проліферуючи in vitro під впливом EGF, компенсували дефіцит дофамінергічних нейронів у пошкодженому стріатумі ефективніше, ніж клітини з 28-денних культур. Автори вважають, що це пов'язано з втратою здатності сприймати відповідні сигнали диференціації під час процесу поділу клітин нейронних клітин-попередників in vitro.

У деяких дослідженнях робилися спроби підвищити ефективність впливу на процеси реіннервації пошкодженого стріатуму шляхом пересадки ембріональних клітин стріатуму в цю область як джерела нейротрофічних факторів з одночасною трансплантацією дофамінергічних нейронів вентрального мезенцефалону. Як виявилося, ефективність нейротрансплантації значною мірою залежить від методу введення ембріональної нервової тканини. В результаті досліджень з трансплантації препаратів ембріональної нервової тканини в шлуночкову систему мозку (щоб уникнути травмування паренхіми стріатуму) було отримано інформацію про їх позитивний вплив на руховий дефект при паркінсонізмі.

Однак, в інших дослідженнях експериментальні спостереження показали, що трансплантація препаратів ембріональної нервової тканини вентрального мезенцефалону, що містять дофамінергічні нейрони, у шлуночок головного мозку, а також трансплантація ГАМК-ергічних ембріональних нейронних елементів у стріатум щурів з геміпаркінсонізмом не сприяє відновленню порушених функцій дофамінергічної системи. Навпаки, імуноцитохімічний аналіз підтвердив дані про низький рівень виживання дофамінергічних нейронів вентрального мезенцефалону, трансплантованих у стріатум щурів. Терапевтичний ефект внутрішньошлуночкової трансплантації ембріональної нервової тканини вентрального мезенцефалону реалізувався лише за умови одночасної імплантації препарату ембріональних стріарних клітин у денервований стріатум. Автори вважають, що механізм цього ефекту пов'язаний з позитивним трофічним впливом ГАМК-ергічних елементів ембріонального стріатуму на специфічну дофамінергічну активність внутрішньошлуночкових трансплантатів вентрального мезенцефалону. Виражена гліальна реакція в трансплантатах супроводжувалася незначною регресією параметрів апоморфінового тесту. Останнє, у свою чергу, корелювало з вмістом GFAP у сироватці крові, що безпосередньо вказувало на порушення проникності гематоенцефалічного бар'єру. На основі цих даних автори дійшли висновку, що рівень GFAP у сироватці крові може бути використаний як адекватний критерій для оцінки функціонального стану трансплантата, а підвищена проникність гематоенцефалічного бар'єру для нейроспецифічних антигенів, таких як GFAP, є патогенетичною ланкою у розвитку недостатності трансплантата внаслідок аутоімунного пошкодження нервової тканини реципієнта.

З точки зору інших дослідників, приживлення та інтеграція нервових стовбурових клітин після трансплантації є стабільними та довічними, оскільки донорські клітини знаходяться у реципієнтів протягом щонайменше двох років після трансплантації та без значного зменшення їхньої кількості. Спроби пояснити це тим, що в недиференційованому стані нервові стовбурові клітини не експресують молекули MHC класу I та II на рівні, достатньому для індукції імунної реакції відторгнення, можна вважати вірними лише стосовно низькодиференційованих нейронних попередників. Однак не всі нейронні стовбурові клітини в мозку реципієнта зберігаються в незрілому стані спокою. Більшість з них зазнають диференціації, під час якої молекули MHC експресуються в повному обсязі.

Зокрема, недостатня ефективність використання інтрастріатальної трансплантації препаратів ембріонального вентрального мезенцефалону, що містять дофамінергічні нейрони, для лікування експериментального паркінсонізму пов'язана з низьким рівнем виживання трансплантованих дофамінергічних нейронів (лише 5-20%), що зумовлено реактивним гліозом, що супроводжує локальну травму паренхіми мозку під час трансплантації. Відомо, що локальна травма паренхіми мозку та супутній гліоз призводять до порушення цілісності гематоенцефалічного бар'єру з вивільненням антигенів нервової тканини, зокрема, OCAR та нейронспецифічного антигену, у периферичну кров. Наявність цих антигенів у крові може спричинити вироблення специфічних цитотоксичних антитіл до них та розвиток аутоімунної агресії.

В. Цимбалюк та співавтори (2001) повідомляють, що досі залишається актуальною традиційна точка зору, згідно з якою центральна нервова система є імунологічно привілейованою зоною, ізольованою від імунної системи гематоенцефалічним бар'єром. У своєму огляді літератури автори наводять низку робіт, які вказують на те, що ця точка зору не повністю відповідає сутності імунних процесів у мозку ссавців. Встановлено, що мічені речовини, введені в паренхіму мозку, можуть досягати глибоких шийних лімфатичних вузлів, і після внутрішньомозкового введення антигенів в організмі утворюються специфічні антитіла. Клітини шийних лімфатичних вузлів реагують на такі антигени проліферацією, починаючи з 5-го дня після ін'єкції. Утворення специфічних антитіл також виявлено під час трансплантації шкіри в паренхіму мозку. Автори огляду наводять кілька гіпотетичних шляхів транспорту антигенів з мозку до лімфатичної системи. Одним з них є перехід антигенів з периваскулярних просторів у субарахноїдальний простір. Передбачається, що периваскулярні простори, локалізовані вздовж великих судин мозку, є еквівалентом лімфатичної системи в мозку. Другий шлях лежить вздовж білих волокон - через ґратчасту кістку в лімфатичні судини слизової оболонки носа. Крім того, у твердій мозковій оболонці є розгалужена мережа лімфатичних судин. Непроникність гематоенцефалічного бар'єру для лімфоцитів також досить відносна. Доведено, що активовані лімфоцити здатні виробляти ферменти, що впливають на проникність структур мозку - "імунного фільтра". На рівні посткапілярних венул активовані Т-хелпери проникають крізь неушкоджений гематоенцефалічний бар'єр. Теза про відсутність у мозку клітин, що представляють антигени, не витримує критики. Наразі переконливо доведена можливість представлення антигенів у ЦНС щонайменше трьома типами клітин. По-перше, це дендритні клітини кісткового мозку, які локалізуються в мозку вздовж великих кровоносних судин і в білій речовині. По-друге, антигени здатні презентувати ендотеліальні клітини судин мозку, причому в асоціації з антигенами MHC, що підтримує клональний ріст Т-клітин, специфічних до цих антигенів. По-третє, мікро- та астрогліальні клітини діють як антигенпрезентуючий агент. Беручи участь у формуванні імунної відповіді в центральній нервовій системі, астроцити набувають властивостей імунної ефекторної клітини та експресують ряд антигенів, цитокінів та імуномодуляторів. При інкубації з γ-інтерфероном (γ-INF) астрогліальні клітини in vitro експресують антигени MHC класу I та II, а стимульовані астроцити здатні до антигенпрезентації та підтримки клональної проліферації лімфоцитів.

Травма тканини мозку, післяопераційне запалення, набряк та відкладення фібрину, що супроводжують трансплантацію ембріональної нервової тканини, створюють умови для підвищеної проникності гематоенцефалічного бар'єру з порушенням аутотолерантності, сенсибілізацією та активацією CD3+CD4+ лімфоцитів. Презентація ауто- та алоантигенів здійснюється астроцитами та мікрогліальними клітинами, які реагують на γ-INF експресією молекул MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, костимуляторних молекул B7-1 (CD80) та B7-2 (CD86), а також секрецією IL-1a, IL-ip та γ-INF.

Отже, факт тривалішого виживання ембріональної нервової тканини після внутрішньомозкової трансплантації, ніж після її периферичного введення, навряд чи можна пов'язати з відсутністю ініціації трансплантаційного імунітету. Більше того, моноцити, активовані лімфоцити (цитотоксичні CD3+CD8+ та Т-хелпери) та цитокіни, що вони продукують, а також антитіла до антигенів периферичного трансплантата ембріональної нервової тканини відіграють головну роль у процесі його відторгнення. Низький рівень експресії молекул MHC в ембріональній нервовій тканині має певне значення у створенні умов для тривалішої стійкості нейротрансплантатів до Т-клітинних імунних процесів. Саме тому в експерименті імунне запалення після трансплантації ембріональної нервової тканини в мозок розвивається повільніше, ніж після пересадки шкіри. Проте повне руйнування окремих трансплантатів нервової тканини спостерігається через 6 місяців. У цьому випадку Т-лімфоцити, обмежені антигенами MHC класу II, переважно локалізуються в зоні трансплантації (Nicholas et al., 1988). Експериментально встановлено, що під час ксенологічної нейротрансплантації виснаження Т-хелперів (L3T4+), але не цитотоксичних Т-лімфоцитів (Lyt-2), продовжує виживання нервової тканини щурів у мозку мишей-реципієнтів. Відторгнення нейротрансплантата супроводжується його інфільтрацією макрофагами та Т-лімфоцитами хазяїна. Отже, макрофаги хазяїна та активовані мікрогліальні клітини діють in situ як антигенпрезентуючи імуностимулюючі клітини, а підвищена експресія донорських антигенів MHC класу I посилює кілерну активність цитотоксичних Т-лімфоцитів реципієнта.

Немає сенсу аналізувати численні спекулятивні спроби пояснити факт відторгнення нейротрансплантата реакцією імунної системи реципієнта на ендотеліальні клітини або гліальні елементи донора, оскільки навіть чисті лінії нейронних клітин-попередників піддаються імунній атаці. Примітно, що експресія Fas-лігандів клітинами мозку, які зв'язуються з рецепторами апоптозу (молекулами Fas) на Т-лімфоцитах, що інфільтрують мозок, та індукують їх апоптоз, відіграє важливу роль у механізмах тривалішого виживання трансплантата в межах ЦНС, що є типовим захисним механізмом трансбар'єрних аутоімуногенних тканин.

Як слушно зазначають В. Цимбалюк та співавтори (2001), трансплантація ембріональної нервової тканини характеризується розвитком запалення за участю клітин, сенсибілізованих до антигенів мозку та активованих клітин, антитіл, а також в результаті локальної продукції цитокінів. Важливу роль у цьому відіграє попередньо існуюча сенсибілізація організму до антигенів мозку, яка виникає під час розвитку захворювань ЦНС і може бути спрямована на антигени трансплантата. Саме тому справді тривале виживання гістонесумісних нейротрансплантатів досягається лише шляхом пригнічення імунної системи циклоспорином А або шляхом введення моноклональних антитіл до CD4+ лімфоцитів реципієнта.

Таким чином, багато проблем нейротрансплантації залишаються невирішеними, зокрема ті, що пов'язані з імунологічною сумісністю тканин, які можуть бути вирішені лише після цілеспрямованих фундаментальних та клінічних досліджень.