Гемопоетичні стовбурові клітини пуповинної крові

Хорошим по проліферативне потенціалу і репопуляціонним можливостям кровотворних клітин джерелом гемопоетичних стовбурових клітин виступає пуповинна кров. Неодноразово показано, що до моменту пологів пуповинна кров містить чималу кількість слабо коммітірованних клітин-попередників гемопоезу. Деякі автори вважають, що перевага трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові полягає у відсутності необхідності пошуку донора, сумісного за HLA-антигенів. На їхню думку, незрілість імунної системи новонародженого обумовлює знижену функціональну активність імунокомпетентних клітин і відповідно більш низьку, ніж при трансплантації кісткового мозку, частоту розвитку тяжкої реакції "трансплантат проти господаря". При цьому виживаність клітинного трансплантата пуповинної крові не нижче, ніж клітин кісткового мозку, навіть в разі використання меншого числа ГСК, що вводяться з розрахунку на 1 кг маси тіла хворого. Однак, на наш погляд, питання оптимальної кількості трансплантуються клітин пуповинної крові, необхідного для ефективного приживлення в організмі реципієнта, їх імунологічної сумісності і ще ряд аспектів проблеми трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові вимагають більш серйозного аналізу.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Отримання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові

Процедура отримання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові вимагає її забору негайно після народження дитини і відділення його від посліду, коли плацента знаходиться in utero або ex utero, а також при кесаревому розтині, але теж ex utero. Показано, що в разі скорочення часу від моменту народження до відділення новонародженого від плаценти до 30 секунд обсяг одержуваної пуповинної крові зростає в середньому на 25-40 мл. При більш пізньому проведенні даної процедури така ж кількість крові втрачається. Встановлено, що раннє відділення дитини від посліду не тягне за собою ніяких негативних наслідків для новонародженого.

У Російському НДІ гематології та трансфузіології розроблені ефективні і маловитратні технології отримання пуповинної крові як при фізіологічних пологах ((70,2 + 25,8) мл), так і при кесаревому розтині ((73,4 + 25,1) мл). Запропоновано методику сепарації пуповинної крові з досить високим виходом ядросодержащих і мононуклеарних клітин - (83,1 + 9,6) і (83,4 + 14,1)% відповідно. Удосконалено спосіб кріоконсервування пуповинної крові, що забезпечує високу схоронність мононуклеарних клітин і CFU-GM - (96,8 + 5,7) і (89,6 + 22,6)% відповідно. Визначено ефективність дренажного способу забору пуповинної крові з використанням контейнера "Компопласт-300" (Росія). Забір пуповинної крові автори проводили відразу після народження дитини і відділення його від посліду, в умовах розміщення плаценти in utero або ex utero. Перед пункцією пуповинної вени пупковий канатик одноразово обробляли 5% настоянкою йоду, а потім двічі - 70% етиловим спиртом. Кров відтікала по з'єднувальним трубках в контейнер мимовільно. Тривалість процедури забору займала не більше 10 хвилин. Обсяг 66 зібраних дренажним способом зразків пуповинної крові в середньому склав (72 + 28) мл, а кількість лейкоцитів в усередненому повному обсязі зразка - (1,1 + 0,6) х х 107. При аналізі пуповинної крові на стерильність (бактеріальна контамінація, ВІЛ-1, віруси гепатитів в і С, сифіліс та цитомегаловірусна інфекція) тільки в одному зразку були виявлені IgG-антитіла до вірусу гепатиту С. В іншому дослідженні плаценту відразу після її народження укладали фетальної поверхнею донизу на спеціальну рамку, пуповину обробляли 5% розчином йоду і 75% етіло им спиртом. Відень пуповини дренувати за допомогою голки від трансфузійної системи (G16). Кров стікала в контейнер мимовільно. Обсяг крові, що забирається таким способом, в середньому становив (55 + 25) мл. В роботі G. Kogler і співавторів (1996) пуповинну кров забирали закритим способом і отримали великі обсяги крові - в середньому (79 + 26) мл. Автори відзначають, що серед 574 зразків пуповинної крові близько 7% містять менше 40 мл крові, що не дозволяє використовувати їх для трансплантації. K. Isoyama і співавтори (1996), забираючи кордової крові шляхом активної ексфузіі за допомогою шприців, отримували в середньому 69,1 мл крові (обсяг пуповинної крові варіював від 15 до 135 мл). Нарешті, A. Abdel-Mageed PI співавторам (1997) за допомогою катетеризації пуновінной вени вдалося отримати в середньому 94 мл пуповинної крові (від 56 до 143 мл).

Для зниження ризику ятрогенного інфікування і забруднення материнськими виділеннями розроблена закрита система забору крові, заснована на широко застосовується трансфузіоіной системі Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), що містить 62,5 мл CPDA (citrate-phosphate-dextrose with adenine) в якості антикоагулянту. Технологія отримання матеріалу має першочергове значення для підготовки якісного зразка щодо обсягу, змісту і чистоти клітинної суспензії. З існуючих методів забору пуповинної крові, коториеусловно класифікують на закриту, напіввідчинені і відкриту системи, следуетотдавать перевагу першій, оскільки в закритій системі істотно знижується ризик мікробного забруднення матеріалу, а також контамінації клітинної суспензії материнськими клітинами.

A. Nagler і співавтори (1998) провели порівняльний аналіз ефективності всіх трьох систем забору пуповинної крові. У першому варіанті процедура здійснювалася в закритій системі шляхом ексфузіі крові безпосередньо в контейнер. У другому варіанті кордової крові отримували методом активної ексфузіі крові шпріцамр1 з подальшим промиванням вен плаценти і одночасним дренуванням крові в контейнер (відкритий спосіб). У третьому варіанті кров забирали в напіввідкритій системі за допомогою активного вилучення її шприцами і промивання через артерію пуповини з одночасною ексфузіей в контейнер. У першому варіанті автори отримали пуповинну кров в обсязі (76,4 + 32,1) мл при вмісті лейкоцитів (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ в 1 мл крові. У другому варіанті відповідні показники склали (174,4 + 42,8) мл і (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ / мл; в третьому - (173,7 + 41,3) мл і (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ / мл. Найчастіше інфікування зразків пуповинної крові відзначалося при використанні відкритої системи. Встановлено прямий кореляційний залежність між масою плаценти і обсягом витягується крові - зі збільшенням маси плаценти кількість збирається крові зростає.

Після забору пуповинної крові слід етап сепарації - виділення мононуклеарних клітин і очищення клітинної суспензії від еритроцитів. В умовах експерименту ядерні клітини виділяють методом їх седиментації метилцелюлозою при лизисе еритроцитів амонію хлоридом. Однак в клінічних цілях застосовувати метилцеллюлозу не слід, так як втрати на ній гемопоетичних стовбурових клітин досягають 50-90%. Лізірованіе еритроцитів в зв'язку з великими обсягами робочого розчину в клініці також майже не проводиться, хоча відсоток виділення таким способом ядерні клітин з фенотипом CD34 +, а також клітин-попередників з функціями CFU-GM і CFU-GEMM значно вище. Повідомляється про появу нового засобу для виділення мононуклеарних клітин в градієнті щільності buyant density solution (BDS72). Ця речовина має такі фізіологічні параметри: pH - 7,4, осмоляльність - 280 мосм / кг, щільність - 1,0720 г / мл. На думку авторів, з його допомогою можна виділити до 100% СD34-позитивних клітин і видалити 98% еритроцитів. Однак в клініці BDS72 поки ще не застосовується.

У апробованих методиках виділення ядерні клітин з пуповинної крові зазвичай використовується 10% розчин гідроксиетилкрохмалю або 3% розчин желатину. Ефективність осадження еритроцитів і виділення ядерні клітин в обох випадках виявляється приблизно рівною. Однак в разі застосування в якості седіментірующего речовини желатин вдається отримати кілька більшу кількість CFU-GM, ніж при використанні гідроксиетилкрохмалю. Передбачається, що відмінності в ефективності виділення CFU-GM обумовлені неоднаковою швидкістю осадження окремих фракцій ядерні клітин або ж здатністю молекул гідроксиетилкрохмалю абсорбуватися на поверхні рецепторів гемопоетіческіх клітин і тим самим блокувати їх чутливість до колонієстимулюючим факторів, які застосовують при культивуванні CFU-GM in vitro. Проте, обидва седіментатори цілком можуть бути придатні для виділення ядерні клітин при створенні масштабних банків пуповинної крові.

Методи сепарації і кріоконсервування пуповинної крові в принципі не відрізняються від тих, які застосовуються в роботі з кровотворними стовбуровими клітинами периферичної крові і кісткового мозку дорослих донорів. Але при заготівлі великої кількості зразків пуповинної крові для її банків способи сепарації повинні бути, перш за все, маловитратними. Тому в даний час, на жаль, для клінічних потреб використовують вже апробовані рутинні методи виділення і кріоконсервування клітин пуповинної крові, а більш ефективні, але фінансовоемкіе методи залишаються долею експериментаторів.

В цілому утвердилися критерії оцінки кількості кровотворних клітин і вимоги до дослідження зразків пуповинної крові з метою виявлення інфекційних збудників. Щоб убезпечити трансплантацію гемопоетичних клітин пуповинної крові, всі зразки крові необхідно досліджувати насамперед на інфекції, що передаються гематогенним шляхом, і генетичні захворювання. Ряд авторів рекомендують додаткові спеціальні методи дослідження пуповинної крові з метою діагностування таких генетичних захворювань, як а-таласемія, серповидно-клітинна анемія, дефіцит аденозіндезамінази, агаммаглобулинемия Брутона, хвороби Харлер і Понтера.

Згідно з рекомендаціями Л. Ticheli і співавторів (1998), в кожному зразку пуповинної крові необхідно визначати кількість ядерні клітин, СБ34-позитивних клітин та CFU-GM, провести HLA-типування, визначити групу крові по АВО і її резус-приналежність. Крім того, здійснюють бактеріологічний посів, серологічне дослідження на ВІЛ і цитомегаловирусную інфекцію, HBsAg, вірусний гепатит С, HTLY-I і HTLV-II (Т-клітинний лейкоз людини), сифіліс і токсоплазмоз. Обов'язковою є полімеразна ланцюгова реакція на цитомегаловирусную і ВІЛ-інфекцію.

Сама процедура отримання пуповинної крові повинна виконуватися в суворій відповідності принципам медичної біоетики. До початку забору крові необхідно отримати згоду вагітної жінки на його здійснення. Попередня розмова з вагітною для отримання інформованої згоди на виконання всіх маніпуляцій, починаючи з ексфузіі крові і закінчуючи заповненням документації, проводиться тільки медичними працівниками. Ні в якому разі неприпустимо виконання будь-якої з цих процедур персоналом, які мають біологічну, хімічну, фармацевтичну та інше немедичне утворення, з огляду на порушення встановлених норм біоетики та прав людини. При позитивних тестах на носійство HBsAg, наявність антитіл до збудників гепатиту С, ВІЛ-інфекції та сифілісу пуповинну кров не забирають, а зразки вже зібраної крові вибраковуються і знищуються. Слід зазначити, що носійство латентних інфекцій у новонароджених зустрічається набагато рідше, ніж у дорослих, отже, ймовірність гематогенного переносу і розвитку інфекційних ускладнень при инфузиях кровотворних клітин пуповинної крові істотно нижче, ніж в разі використання для трансплантації кісткового мозку дорослих донорів.

Важливим моментом застосування пуповинної крові в клініці є оцінка трансплантата, в основі якої лежить визначення кількості кровотворних стовбурних клітин в зразку пуповинної крові і доз клітин, необхідних для пересадки. В даний час ще не розроблені стандарти оптимальної кількості клітин пуповинної крові, необхідного для трансплантації. Немає загальноприйнятої точки зору навіть на такі рутинні параметри, як кількість СD34-позитивних клітин та CFU-GM. Деякі автори оцінюють потенціал кровотворних клітин за допомогою аналізу довгострокових культур з визначенням змісту колонієутворюючих одиниць, загальних для гранулоцитів, еритроцитів, моноцитів і мегакаріоцитів - CFU-GEMM.

Однак в клінічних умовах стандартна оцінка трансплантата пуповинної крові включає, як правило, лише визначення кількості ядерні або мононуклеарних клітин.

Зберігання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові

Деякі проблеми существут і в технології зберігання гемопоетичних клітин пуповинної крові. При кріоконсервації гемопоетичних стовбурових клітин для досягнення оптимального режиму їх заморожування необхідно максимально зменшити обсяг пуповинної крові, а також попередньо видалити еритроцити щоб уникнути гемолізу і небезпеки розвитку реакції несумісності по еритроцитарних антигенів (ABO, Rh). Для цих цілей придатні різні способи виділення ядерні клітин. На початку 90-х років минулого століття найбільшого поширення набув метод виділення ядерні клітин в градієнті щільності на основі фіколла з щільністю 1,077 г / мл або Перкола з щільністю 1,080 г / мл. Сепарація пуповинної крові в градієнті щільності дозволяє виділити переважно мононуклеарние клітини, але призводить до значних втрат гемопоетичних клітин-попередників - до 30-50%.

Седіментірующая ефективність гідроксиетилкрохмалю в процесі виділення кровотворних клітин пуповинної крові оцінюється по-різному. Одні автори вказують на низьку якість сепарації за допомогою цього методу, інші дослідники, навпаки, серед усіх можливих способів віддають перевагу виділенню ГСК пуповинної крові саме з використанням 6% розчину гідроксиетилкрохмалю. При цьому підкреслюється висока ефективність седиментації гемопоетичних клітин, яка, за деякими даними, сягає від 84% до 90%.

Прихильники іншої точки зору вважають, що практично всі способи фракціонування пов'язані з великими втратами ядросодержашіх клітин і пропонують виробляти сепарацію шляхом центрифугування, розділяючи пуповинну кров на 3 фракції: еритроцитарної, лейкоцитарна кільце і плазму. Виділяючи клітини таким способом, автори встановили, що вміст мононуклеарних клітин, ранніх гемопоетичних клітин-попередників і клітин з імунофенотипові CD34 + в кінцевому підсумку склало відповідно 90, 88 і 100% від початкового рівня. Подібні величини приросту очищених цим методом клітин пуповинної крові отримані і іншими дослідниками: після седиментації виділено 92% ядросодержащих, 98% - мононуклеарних, 96% - СD34-позитивних клітин та 106% колонієутворюючих одиниць.

В кінці 90-х років в якості седиментуючого засобу широке застосування отримала желатину. У клінічній практиці за допомогою желатину гемопоетичних стовбурових клітин з пуповинної крові виділяють з 1994 року. При використанні 3% розчину желатини ефективність виділення ядерні клітин досягає 88-94%. Широкомасштабне застосування желатину при створенні банку пуповинної крові підтвердило її переваги перед іншими седіментірующімі засобами. Порівняльний аналіз ефективності всіх вищеперелічених способів виділення ядерні клітин в умовах їх послідовного застосування на кожному з тестованих зразків пуповинної крові довів, що оптимальним седіментатори по виходу мононуклеарних клітин з фенотипом CD34 + / CD45 +, а також за кількістю CFU-GM і CFU-GEMM є 3% розчин желатину. Значно менш ефективними виявилися методи з використанням градієнта щільності фіколла, а також застосування гідроксиетилкрохмалю і метилцелюлози, при яких втрати гемопоетичних клітин досягали 60%.

Розширення обсягів трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові пов'язано не тільки з розробкою методів їх отримання, а й зберігання. Існує чимало проблем, безпосередньо пов'язаних з підготовкою пуповинної крові до тривалого зберігання і вибором оптимальної технології кріоконсервування її зразків. Серед них - питання доцільності виконання сепараційних процедур, використання різних кріоконсервірующіх середовищ і застосування способів підготовки розморожених клітин до трансплантації. Транспортування нативних зразків пуповинної крові нерідко здійснюється з регіонів, віддалених від гематологічних центрів. У зв'язку з цим виникає проблема допустимих термінів зберігання пуповинної крові від моменту її отримання до початку кріоконсервації, що має особливе значення при створенні банків пуповинної крові.

Дослідження функціональної активності гемопоетичних клітин пуповинної крові після тривалого зберігання (до 12 років) в рідкому азоті дозволило встановити, що близько 95% кровотворних клітин на протягом цього часу не втрачають свою високу проліферативну здатність. У роботі С. Юрасова і співавторів (1997) доведено, що зберігання пуповинної крові при кімнатній температурі (22 ° С) або при температурі 4 ° С протягом 24 і 48 годин істотно не знижує життєздатність кровотворних клітин, яка від початкового рівня становить відповідно 92 і 88%. Однак в разі продовження терміну зберігання до трьох діб кількість життєздатних ядерні клітин в пуповинній крові значно зменшується. У той же час в ході інших досліджень встановлено, що при зберіганні протягом 2-3 діб при температурі 22 або 4 ° С перш за все страждає життєздатність зрілих гранулоцитів, а не гемопоетичних клітин.

На життєздатність гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові негативний вплив можуть надавати компоненти систем для її забору. Аналіз впливу різних антикоагулянтів, механізм дії яких обумовлений зв'язуванням іонів кальцію (ACD, EDTA, XAPD-1), на гемопоетичні клітини-попередники в умовах зберігання пуповинної крові від 24 до 72 годин виявив їх негативний вплив на життєздатність ядерні клітин. У зв'язку з цим автори рекомендують використовувати PBS (розчин фосфатного буфера) з додаванням нативного гепарину без консерванту в концентрації 20 ОД / мл, що, на їхню думку, дозволяє збільшити тривалість зберігання нефракціоновані пуповинної крові до 72 годин і зберігає функціональну активність колонієутворюючих одиниць. Однак при дослідженні збереження CFU-GM і CFU-G показано, що час зберігання пуповинної крові до початку кріоконсервації не повинно перевищувати дев'яти годин. Очевидно, в даному випадку повинен діяти принцип, згідно з яким при наявності суперечливих даних слід використовувати мінімальний рекомендований термін зберігання пуповинної крові і приступати до програмованої заморожуванні виділених клітин якомога швидше.

При заморожуванні гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові в якості кріопротектори зазвичай використовується 10% розчин ДМСО. Однак, крім вираженого кріопротекторними дії, диметилсульфоксид в такій концентрації надає і прямий цитотоксичний ефект, навіть за умови мінімальної його експозиції з кровотворними клітинами пуповинної крові. Для зменшення цитотоксичної дії ДМСО застосовується нульова температура експозиції, підвищення швидкості проведення всіх маніпуляцій і багаторазове відмивання після розморожування зразків пуповинної крові.

В Інституті гематології та трансфузіології АМН України з 1995 року розвивається науковий напрямок, метою якого є всебічне дослідження пуповинної крові як альтернативного джерела стовбурових гемопоетичних клітин. Зокрема, розроблені нові технології низькотемпературного кріоконсервування гемопоетіческіх клітин нефракціоновані і фракционированной пуповинної крові. Як кріопротектори використовується низькомолекулярний медичний полівінілпіролідон. В основі способу кріоконсервування нефракціоновані пуповинної крові лежить оригінальна технологія передпідготовки клітин до заморожування і методика спеціальної обробки клітинної суспензії безпосередньо перед трансплантацією.

Одним з найважливіших факторів, що впливають на рівень функціональної активності кріоконсервіруемих гемопоетичних стовбурових клітин, є швидкість охолодження клітинної суспензії, особливо в період фази кристалізації. Програмний підхід до вирішення проблеми швидкості і часу заморожування надає великі можливості для створення простих і високоефективних методів кріоконсервування, причому без відмивання клітинної суспензії від кріопротекторів перед трансплантацією.

Найбільш небезпечні для життєздатності клітин під час їх заготівлі етапи безпосереднього заморожування і розморожування. При заморожуванні гемопоетичних клітин значна їх частина може руйнуватися в момент переходу міжклітинної середовища з рідкої в тверду фазу - кристалізації. Для зниження відсотка загибелі клітин використовують кріопротектори, механізми дії і кріозахисного ефективність яких досить повно висвітлені в науковій літературі.

Перспективним напрямком оптимізації методів кріоконсервування кісткового мозку і клітин пуповинної крові є поєднання в одному розчині низьких концентрацій декількох криопротекторов з різним механізмом дії, наприклад, діє на внутрішньоклітинному рівні ДМСО і гідроксиетилкрохмалю або альбуміну, що володіють екстрацелюлярний огороджувальних ефектом.

Для кріоконсервації клітин пуповинної крові традиційно використовується 20% розчин ДМСО, який, постійно механічно помішуючи на крижаній бані, повільно вливають в клітинну суспензію до досягнення рівного (1: 1) співвідношення обсягів кріопротектори і клітинної суспензії. При цьому кінцева концентрація диметилсульфоксиду становить 10%. Потім клітинну суспензію охолоджують на програмної кріоустановкі зі швидкістю ГС / хв до -40 ° С, після чого швидкість охолодження збільшують до 10 ° С / хв. Після досягнення -100 ° С контейнер з клітинної суспензією поміщають в рідкий азот (-196 ° С). При такій методиці кріоконсервації збереження функціонально активних мононуклеарних клітин після розморожування досягає 85% від початкового рівня.

Модифікації методик кріоконсервації спрямовані на зниження концентрації ДМСО за рахунок додавання гідроксиетилкрохмалю (кінцеві концентрації диметилсульфоксиду і гідроксиетилкрохмалю складають відповідно 5 і 6%). Висока ефективність такого поєднання криопротекторов спостерігається при заморожуванні суспензії мієлоїдних клітин, причому з не меншою цітопротекціі, ніж при використанні одного тільки 10% розчину диметилсульфоксиду. Кількість життєздатних ядерні клітин досягало 96,7% від вихідного рівня, а функціональна їх активність, оцінена за кількістю CFU-GM, становила 81,8%.

При використанні розчину диметилсульфоксиду в концентраціях від 5 до 10% в поєднанні з 4% гідроксиетилкрохмалем (кінцева концентрація) встановлено, що збереження СD34-позитивних клітин в таких діапазонах диметилсульфоксида практично не змінюється. У той же час в умовах зниження концентрації диметилсульфоксиду від 5 до 2,5% спостерігається масова загибель клітин пуповинної крові - кількість життєздатних клітинних одиниць знижується з 85,4 до 12,2%. Інші автори також прийшли до висновку, що саме 5 і 10% розчини диметилсульфоксиду (в авторському варіанті - в комбінації з аутологічної сироваткою) з максимальною ефективністю забезпечують цитопротекцію при кріоконсервуванні ГСК пуповинної крові. Крім того, висока збереження послідовно заморожуються і розморожувати клітин відзначається в разі поєднання 5 або 10% диметилсульфоксиду з 4% розчином гідроксиетилкрохмалю, особливо при контрольованій швидкості охолодження, що дорівнює ГС / хв. У ще одній роботі використовувався кріозахисного розчин, що складається вже з трьох інгредієнтів - ДМСО, очищеного людського альбуміну та середовища RPMI в пропорції 1: 4: 5, який додавали до клітинної суспензії до рівного співвідношення обсягів (кінцева концентрація диметилсульфоксиду склала 5%). Після розморожування на водяній бані при температурі + 4ГС збереження CFU-GM перевищувала 94%.

Деякі автори пропонують використовувати для кріоконсервування нефракціоновані пуповинну кров, оскільки в процесі видалення еритроцитів втрачаються значні кількості гемопоетичних клітин. У цьому варіанті для захисту мононуклеарних клітин від шкідливої дії кріокрісталлізаціі використовується 10% розчин диметилсульфоксиду. Заморожування проводиться при постійній швидкості охолодження, що становить ГС / хв, до -80 ° С, після чого суспензію клітин пуповинної крові опускають в рідкий азот. При даній методиці заморожування відбувається частковий лізис еритроцитів, тому зразки крові не вимагають фракціонування. Після розморожування клітинну суспензію відмивають від вільного гемоглобіну і диметилсульфоксиду в розчині людського альбуміну або в сироватці аутокрови хворого і використовують для трансплантації.

Збереження гемопоетичних клітин-попередників після розморожування нефракціоновані пуповинної крові дійсно вище, ніж фракционированной, проте в зв'язку з кріоустойчівостью частини еритроцитів можуть виникнути серйозні посттрансфузійні проблеми внаслідок переливання АВО-несумісних еритроцитів. Крім того, відчутно зростає обсяг інформації, що зберігається нефракціоновані крові. З клінічної точки зору, все-таки краще криоконсервация попередньо виділених і очищених від інших клітинних фракцій гемопоетичних клітин пуповинної крові.

Зокрема, розроблений спосіб кріоконсервації клітин фракционированной пуповинної крові, що дозволяє видаляти еритроцити на етапі підготовки до заморожування, в якому використовується 6% розчин гідроксиетилкрохмалю в складі плазмозамінної розчину "Стабізол". Після розморожування отримана таким способом клітинна суспензія готова до клінічного застосування без додаткових маніпуляцій.

Таким чином, в даний час існує безліч досить ефективних способів кріоконсервування пуповинної крові. Принципова їхня відмінність полягає в тому, що зразки крові заморожують нефракціоновані або піддають поділу на клітинні фракції на етапі підготовки і заготовляють ядерні клітини без домішки еритроцитів.

Трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові

В кінці 80-х - початку 90-х років минулого століття було встановлено, що пуповинна кров, що забезпечує життєдіяльність плода в період вагітності, відрізняється високим вмістом гемопоетичних стовбурових клітин. Відносна простота отримання клітин пуповинної крові і відсутність явних етичних проблем сприяли застосуванню стволових клітин пуповинної крові в практичній медицині. Перша успішна трансплантація пуповинної крові дитини з анемією Фанконі послужила відправною точкою для розширення обсягів трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові і створення системи її банкового забезпечення. У світовій системі банків пуповинної крові найбільшим є Нью-Йоркський центр плацентарної крові, який перебуває на балансі Національного інституту здоров'я США. Число зберігаються зразків пуповинної крові в цьому банку наближається до 20 ТОВ. Зростає і кількість реципієнтів (в основному діти), яким була проведена успішна трансплантація. Як повідомляє Департамент здоров'я США, безрецидивний період посттрансплантаційного життя реципієнтів ГСК пуповинної крові вже перевищує 10 років.

Це й не дивно, так як численні дослідження гемопоетичного потенціалу пуповинної крові показали, що за кількістю і якістю самих ранніх стовбурових клітин вона не тільки не поступається кістковому мозку дорослої людини, а й за деякими показниками перевищує його. Більш високий проліферативний потенціал стовбурових клітин пуповинної крові обумовлений онтогенетичними особливостями клітинної сигналізації, наявністю на ГСК рецепторів до специфічних факторів росту, здатністю клітин пуповинної крові до аутокринной продукції факторів росту, великими розмірами і довжиною теломер.

Таким чином, геномні та фенотипічні особливості стовбурових кровотворних клітин пуповинної крові зумовлюють якісне приживлення трансплантата з високим потенціалом відновлення донорського гемопоезу в організмі реципієнта.

Переваги гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові

Серед реальних переваг використання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові з метою трансплантації перед іншими джерелами кровотворних клітин слід зазначити практично нульовий ризик для здоров'я донора (якщо взагалі не вважати таким плаценту), а також відсутність необхідності загальної анестезії. Застосування пуповинної крові розширює можливості клітинної трансплантації за рахунок частково сумісних по HLA-системі трансплантатів (несумісність від одного до трьох антигенів). Відпрацьована методика тривалого зберігання гемопоетичних клітин пуповинної крові в замороженому стані, що збільшує ймовірність отримання рідкісних HLA-типів і скорочує час пошуку HLA-сумісного трансплантата для алогенних трансплантацій. При цьому значно знижується ризик розвитку деяких латентних інфекцій, що передаються трансмісивним шляхом. Крім того, виникає недорога форма біологічного страхування життя в зв'язку з можливістю використовувати клітини пуповинної крові для аутологічної трансплантації.

Однак внаслідок малих обсягів крові, які можна зібрати з плаценти (в середньому не більше 100 мл), на передній план виходить проблема отримання максимально можливої кількості крові з вени пупкового канатика при строгому дотриманні умови мінімального ризику бактеріальної контамінації одержуваних зразків пуповинної крові.

Примітивні гемопоетичні клітини пуповинної крові зазвичай ідентифікують по наявності на їх поверхні глікофосфопротеіна CD34, а також на підставі їх функціональних властивостей шляхом дослідження клоногенних або колоніеобразованія in vitro. Порівняльний аналіз показав, що в пуповинної крові та кістковому мозку максимальний вміст СD34-позитивних клітин у фракції мононуклеарів становить відповідно 1,6 і 5,0%, максимальний рівень колонієутворюючих одиниць в субпопуляції СD34 + -клітин - 80 і 25%, тотальна ефективність клонування СD34 + клітин - 88 і 58%, максимальний вміст колонієутворюючих клітин з високим потенціалом проліферації (HPP-CFC в СD34 + -популяціі) - 50 і 6,5%. До цього слід додати, що ефективність клонування СD34 + СD38-клітин і здатність відповідати на ЦИТОКІНОВИЙ стимуляцію також вище у гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові.

Поєднання фенотипических антигенів Thy-1, CD34 і CD45RA підтверджує високий проліферативний потенціал кровотворних клітин пуповинної крові, а експресія цих трьох антигенів на поверхні клітин пуповинної крові свідчить про їх належність до стовбурових клітин. До того ж встановлено, що в пуповинної крові містяться клітини з фенотипом CD34 +, що не мають маркерів лінійної диференціювання. Рівень в пуповинної крові клітинних субпопуляцій з фенотипическим профілем CD34 + / Lin становить близько 1% від усієї кількості СD34-позитивних клітин. Гемопоетичні клітини-попередники пуповинної крові дають початок як лімфоїдної лінії клітин, так і поліпотентні мієлоїдний ряду лінійної клітинної диференціювання, що також вказує на їх приналежність до стовбурових клітин.

Як уже згадувалося, істотні відмінності між кістковим мозком і пуповинної кров'ю полягають в кількості одержуваних при одній процедурі забору використовуваних для трансплантації гемопоетичних клітин. Якщо при пересадці кісткового мозку втрати клітинної маси в процесі сепарації, кріоконсервування, розморожування і тестування допустимі в межах 40-50%, то для пуповинної крові такі втрати клітин досить істотні, так як при використанні недостатньої кількості ГСК трансплантат може виявитися неспроможним. За даними G. Kogler і співавторів (1998), для клітинної трансплантації при масі тіла реципієнта 10 кг потенційними трансплантатами (загальна чисельність зібраних зразків пуповинної крові - 2098) можуть бути всі зразки пуповинної крові, при масі тіла 35 кг - 67%, і лише 25% зразків зможуть забезпечити ефективну трансплантацію у пацієнтів з масою тіла 50-70 кг. Така клінічна ситуація свідчить про необхідність оптимізації та підвищення ефективності існуючих методів забору, розмноження і зберігання клітин пуповинної крові. Тому в даний час в літературі широко обговорюються питання стандартизації методів забору, тестування, сепарації і кріоконсервування пуповинної крові для створення банків крові, її застосування в клініці, а також обумовлюються умови і терміни зберігання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові.

[7], [8], [9],

Використання гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові в медицині

Зазвичай з пуповинної крові вдається виділити до 10 ⁶ гемопоетичних стовбурових клітин, рідко більше. У зв'язку з цим до сьогоднішнього дня залишається відкритим питання про достатність такої кількості гемопоетичних клітин пуповинної крові для відновлення кровотворення дорослого реципієнта. Думки з цього приводу розділилися. Деякі дослідники вважають, що такої кількості цілком достатньо для трансплантації дітям, але занадто мало для пересадки дорослій людині, для якого оптимальним є введення (7-10) x 10 ⁶ СD34-позитивних клітин на 1 кг маси тіла - в середньому 7 x 10 ⁸ на одну трансплантацію. З цих розрахунків випливає, що один зразок пуповинної крові містить в 700 разів менше гемопоетичних стовбурових клітин, ніж потрібно для однієї трансплантації дорослому пацієнту. Однак така кількісна оцінка зроблена за аналогією з кількістю переливають клітин кісткового мозку і зовсім не враховує онтогенетических особливостей гемопоезу.

Зокрема, ігнорується факт більш високого проліферативного потенціалу гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові в порівнянні з кровотворними клітинами-попередниками кісткового мозку. Результати дослідження колонієутворюючих потенціалу in vitro дозволяють вважати, що одна доза пуповинної крові здатна забезпечити реконституції гемопоезу дорослого реципієнта. З іншого боку, не слід забувати, що кількість ГСК зменшується навіть в процесі ембріонального розвитку: зміст СD34-позитивних клітин в пуповинній крові лінійно знижується в 5 разів в терміни від 20 тижнів (кров для дослідження отримана при передчасному перериванні вагітності) до 40 тижнів гестації (період фізіологічних пологів), що супроводжується Паралельно, перманентно наростаючою експресією маркерів лінійної цітодіфференціаціі.

Через відсутність стандартизованого підходу до кількісного визначення клітин-попередників в зразках пуповинної крові суперечки з приводу оптимальної дози гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові тривають. Частина дослідників вважають, що в якості критеріїв підбору зразків пуповинної крові можна використовувати кількість ядерні клітин і мононуклеарів, перераховано на масу тіла реципієнта, тобто, їх дозу. Деякі автори вважають, що мінімальний кількісний поріг СD34 + -клітин навіть для проведення аутотрансплантации ГСК становить 2 х 10 ⁶ / кг. При цьому збільшення дози гемопоетичних клітин до 5 x 10 ⁶ клітин / кг (всього в 2,5 рази) вже забезпечує більш сприятливий перебіг раннього посттрансплантаційного періоду, знижує частоту інфекційних ускладнень і скорочує тривалість періоду превентивної антибіотикотерапії.

За даними E. Gluckman і співавторів (1998), в онкогематології умовою для успішної трансплантації клітин пуповинної крові є введення не менше 3,7 × 10 ⁷ ядерні клітин з розрахунку на 1 кг маси тіла реципієнта. При зниженні дози гемопоетичних стовбурових клітин до 1 × 10 ⁷ і менш ядерні клітин на 1 кг маси тіла пацієнта різко зростає ризик неспроможності трансплантата і рецидиву онкозахворювання крові. Слід визнати, що мінімальна кількість клітин-попередників, необхідних для швидкого відновлення гемопоезу після алотрансплантації ГСК, поки що невідомо. Теоретично цього можна досягти за допомогою однієї клітини, але в клінічній практиці трансплантації кісткового мозку швидке і стабільне приживлення гарантується переливанням принаймні (1-3) × 10 ⁸ ядерні клітин на 1 кг маси тіла пацієнта.

Нещодавно проведене детальне дослідження з визначення оптимального кількості ГСК в онкогематології включало спостереження за пацієнтами трьох груп, виділених в залежності від вмісту СD34-позитивних клітин в трансплантуються матеріалі. Хворим першої групи вводили (3-5) × 10 ⁶ клітин / кг. Доза ГСК у пацієнтів другої групи склала (5-10) х 10 ⁶ клітин / кг, а хворим третьої групи трансплантували більше 10 х 10 ⁶ СD34 + -клітин / кг. Кращі результати спостерігалися в групі реципієнтів, які отримували трансплантат з кількістю СD34-позитивних клітин, рівним (3-5) × 10 ⁶ / кг. При збільшенні дози трансплантуються клітин понад 5 x 10 ⁶ / кг статистично значущих переваг виявлено не було. При цьому дуже великий вміст ГСК в трансплантаті (> 10 х х 10 ⁶ / кг) пов'язане з реінфузія значної кількості резидуальних клітин пухлини, що призводить до рецидиву захворювання. Прямого зв'язку між кількістю трансплантованих алогенних клітин-попередників і розвитком реакції "трансплантат проти господаря" встановлено не було.

Накопичений світовий досвід трансплантації ГСК пуповинної крові підтверджує їх високий репопуляціонний потенціал. Швидкість приживлення трансплантата пуповинної крові корелює з кількістю введених ядерні клітин. Кращі результати спостерігаються при трансплантації 3 x 10 ⁷ / кг, в той час як для кісткового мозку ця доза становить 2 х 10 ⁸ / кг. За даними координаційних центрів, в кінці 2000 року в світі було виконано 1 200 пересадок клітин пуповинної крові, переважно від донорів-родичів (83%). Очевидно, що кордової крові слід розглядати як альтернативу кістковому мозку для трансплантації хворим з гемобластозами.

Разом з тим, неонатальна природа кордового джерела кровотворної тканини вселяє оптимізм в силу наявності функціональних особливостей її ГСК. При цьому тільки клінічний досвід може дати відповідь на питання про достатність одного зразка пуповинної крові для відновлення гемопоезу дорослого реципієнта з аплазією кровотворення. Трансплантація клітин пуповинної крові використовується в програмах лікування багатьох захворювань пухлинної і непухлинної природи: лейкози і мієлодиспластичні синдроми, неходжкінська лімфома і нейробластома, апластична анемія, вроджені анемії Фанконі і Даймонда-Блекфена, дефіцит адгезії лейкоцитів, синдром Барра, хвороба Гюнтера, синдром Харлер, таласемія .

Пильної уваги і окремого дослідження заслуговують імунологічні аспекти трансплантації кровотворних клітин пуповинної крові. Показано, що в разі пересадки стовбурових клітин пуповинної крові від донорів з неповною HLA-сумісністю результати трансплантації виявляються цілком задовільними, що, на думку авторів, вказує на меншу иммунореактивность клітин пуповинної крові, ніж кісткового мозку.

Детальне вивчення клітинного складу пуповинної крові виявило особливості як фенотипічного спектра ефекторних клітин імунної системи, так і їх функціональної активності, що дозволило розглядати кордової крові як джерело ГСК з відносно низьким ризиком розвитку реакції 'трансплантат проти господаря ". Серед ознак функціональної незрілості імунокомпетентних клітин пуповинної крові слід зазначити дисбаланс вироблення цитокінів та зниження чутливості до цітокі- нової регуляції імунної відповіді. Що виникає внаслідок цього пригнічення активності цитотоксичних лімфоцитів вважається чинником, що сприяє формуванню імунологічної толерантності до трансплантуються гемопоетичних тканини. У популяції лімфоцитів пуповинної крові, на відміну від периферичної крові і кісткового мозку дорослих донорів, переважають неактивні, незрілі лімфоцити і клітини-супресори. Це свідчить про знижену готовності Т-лімфоцитів пуповинної крові до імунної відповіді. Важливою особливістю моноцитарній популяції клітин пуповинної крові є низький вміст функціонально повноцінних і активних антігенпрезентірующіх клітин.

З одного боку, невисока ступінь зрілості ефекторних клітин імунної системи в пуповинної крові розширює показання до її застосування в клініці, так як ці особливості забезпечують зниження інтенсивності імунного конфлікту між клітинами донора і реципієнта. Але, з іншого боку, відомо про існування кореляції між ступенем розвитку реакції "трансплантат проти господаря" і протипухлинним ефектом трансплантації, тобто, розвитком ефекту "трансплантат проти лейкозу". У зв'язку з цим було проведено дослідження протипухлинної цитотоксичности клітин пуповинної крові. Отримані результати свідчать про те, що, незважаючи на дійсно ослаблений відповідь імунокомпетентних клітин пуповинної крові на антигенну стимуляцію, активуються в першу чергу лімфоцити є природними кілерами і кіллероподобнимі клітинами, які беруть активну участь в механізмах реалізації протипухлинної цитотоксичности. Крім того, в пуповинної крові виявлено субпопуляції лімфоцитів з фенотипом CD16 + CD56 + і CD16 "TCRa / p +. Передбачається, що саме ці клітини в активованої формі реалізують реакцію" трансплантат проти лейкозу ".

В Інституті онкології АМН України кріоконсервовані гемопоетичні клітини пуповинної крові вводилися онкологічним хворим зі стійкими гіпоплазії кровотворення внаслідок хіміо- та радіотерапії. У таких пацієнтів трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові досить ефективно відновлювала пригнічений кровотворення, про що свідчило стійке підвищення вмісту зрілих формених елементів у периферичній крові, а також збільшення показників, що характеризують стан клітинного і гуморального імунітету. Стабільність репопуляціонного ефекту після пересадки кровотворних клітин пуповинної крові дозволяє продовжувати променеву і хіміотерапію, не перериваючи курс лікування. Є відомості про більш високу ефективність аллотрансплантации стовбурових клітин пуповинної крові онкогематологічним хворим: річний ризик розвитку рецидиву пухлинного захворювання при їх застосуванні становив 25% проти 40% у пацієнтів з пересадженим алло генним кістковим мозком.

Механізм дії кріоконсервованих стовбурових клітин пуповинної крові слід вважати результатом гуморальної стимуляції кровотворення реципієнтів, викликаної унікальною здатністю неонатальних клітин до аутокринной продукції гемопоетичних факторів росту, а також наслідком тимчасового приживлення донорських клітин (як підтвердження - достовірне підвищення вмісту фетального гемоглобіну периферичної крові реципієнтів на 7-15 -е добу після трансфузии в порівнянні з вихідними даними). Відсутність у реципієнтів пуповинної крові посттрансфузійних реакцій - результат відносної толерантності її імунокомпетентних клітин, а також довірчий критерій біологічної повноцінності кріоконсервованого матеріалу.

Клітини-попередники Т-лімфоцитів-кілерів пуповинної крові здатні до активації під впливом екзогенної цитокиновой стимуляції, що використовується з метою розробки нових ex vivo і in vivo методик індукції протипухлинної цитотоксичности лімфоїдних елементів трансплантата для подальшої імунотерапії. Крім того, "незрілість" генома імунокомпетентних клітин пуповинної крові дозволяє застосовувати їх для посилення протипухлинної активності методами молекулярного моделювання.

Сьогодні пуповинна кров знайшла широке застосування перш за все в дитячій гематології. У дітей з гострими лейкозами алотрансплантація гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові, в порівнянні з Алотрансплантація кісткового мозку, значно знижує частоту розвитку реакції "трансплантат проти господаря". Однак при цьому відзначається більш тривалий період нейтро- і тромбоцитопенії, і, на жаль, більш високий рівень 100-денний посттрансплантаційного смертності. Більш тривалий період відновлення змісту в периферичної крові гранулоцитів і тромбоцитів може бути обумовлений недостатньою дифференцировкой окремих субпопуляцій СD34-позитивних клітин пуповинної крові, про що свідчать невисокий рівень поглинання радіоактивного родаміну і низька експресія на їх поверхні антигенів CD38.

У той же час трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові дорослим хворим, виконана через відсутність як сумісного неспорідненого донора кісткового мозку, так і можливості провести мобілізацію аутологічних ГСК, показала високу річну безрецидивную виживання в групі пацієнтів у віці не старше 30 років (73%) . Розширення вікового діапазону реципієнтів (18-46 років) призводило до зниження виживаності до 53%.

Кількісний аналіз клітин з фенотипом CD34 + в кістковому мозку і пуповинної крові виявив більш високу (в 3,5 рази) їх зміст в кістковому мозку, проте в пуповинної крові відзначено значне переважання клітин з фенотипическим профілем CD34 + HLA-DR .Известно, чтоклеткікровісіммунологіческімі маркерами CD34 + HLA-DR пролиферируют активніше, ніж клітини з імунофенотипові CD34 + HLA-DR +, що підтверджено в експериментальних дослідженнях зростання довгострокової гемопоетичних культури клітин in vitro. Примітивні клітинні попередники з фенотипом CD34 + CD38 містяться як в пуповинної крові, так і в кістковому мозку, але клітини пуповинної крові з маркерним набором CD34 + CD38 мають більш високу клоногенних активністю, ніж кровотворні клітини того ж фенотипу, виділені з кісткового мозку дорослих донорів. Крім того, клітини пуповинної крові з імунофенотипові CD34 + CD38 швидше проліферують у відповідь на стимуляцію цитокінами (IL-3, IL-6, G-CSF) і відтворюють в 7 разів більше колоній в довгострокових культурах, ніж клітини кісткового мозку.

Банки стовбурових клітин пуповинної крові

Для належного розвитку нової галузі практичної медицини - трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові, як і для здійснення пересадок гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку, необхідна наявність розгалуженої мережі банків крові, які вже створені в США і Європі. Внутрішньодержавні мережі банків пуповинної крові об'єднує Асоціація банків Netcord. Доцільність створення міжнародного об'єднання банків пуповинної крові визначається тим, що для виконання неспоріднених трансплантацій необхідна велика кількість тіпірованних зразків пуповинної крові, що дозволяє підібрати HLA-ідентичного донора. Тільки установа системи банків зі зберіганням в них зразків крові різних HLA-типів може реально вирішити проблему пошуку необхідного донора. Організація такої системи банків пуповинної крові вимагає попередньої розробки етичних і юридичних норм, які в даний час продовжують обговорюватися на міжнародному рівні.

Для створення банків пуповинної крові в Україні належить відпрацювати цілий ряд положень і документів.

Перш за все, це питання стандартизації способів забору, фракціонування і заморожування пуповинної крові. Необхідно регламентувати правила забору пуповинної крові в пологових будинках відповідно до вимог медичної етики, визначити мінімальний обсяг пуповинної крові, що забезпечує успішну трансплантацію. Слід провести порівняння і стандартизацію різних критеріїв оцінки якості і кількості кровотворних клітин-попередників, а також методів HLA-типування та способів діагностики генетичних та інфекційних захворювань, які можуть передаватися при інфузії клітин пуповинної крові, встановити загальні критерії відбору здорових донорів. Варто обговорити і питання створення окремих сховищ для сироватки, клітин і ДНК, отриманих з пуповинної крові.

Абсолютно необхідна організація комп'ютерної мережі даних про пуповинну кров для здійснення взаємозв'язку з регістрами донорів кісткового мозку. Для подальшого розвитку клітинної трансплантології потрібно розробити спеціальні протоколи порівняння результатів трансплантації пуповинної крові і кісткового мозку від HLA-ідентичних родичів і неспоріднених донорів. У рішенні етичних і юридичних проблем клінічного застосування клітин пуповинної крові може допомогти стандартизація документації, що включає інформовану згоду батьків, а також повідомлення матері або родичів про виявлені у дитини генетичних і / або інфекційних хворобах.

Визначальною умовою розвитку клітинної трансплантології в Україні буде прийняття Національної програми донорства стовбурових клітин і розвиток міжнародного співробітництва з іншими країнами за допомогою Світової донорської кістковомозковою асоціації (WMDA), Національної донорської кістковомозковою програми США (NMDP) та інших регістрів.

Узагальнюючи поки ще коротку історію розвитку трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові, відзначимо, що перші припущення про можливість застосування в клініці пуповинної крові, висловлені ще на початку 70-х років, підтвердилися в 80-і роки результатами експериментальних досліджень на тваринах, а в 1988 році вже була проведена перша в світі трансплантація кровотворних клітин пуповинної крові людині, після чого почала створюватися світова мережа банків пуповинної крові. Через 10 років число хворих з пересадженими кровотворними клітинами пуповинної крові наблизилося до 800. Серед них були пацієнти з різними захворюваннями пухлинної (лейкози, лімфоми, солідні пухлини) і непухлинної (вроджені імунодефіцити, анемії, хвороби, пов'язані з порушенням обміну речовин) природи.

У пуповинній крові вміст ранніх і коммітірованних клітинних попередників вище, ніж в периферичної крові дорослої людини. За кількістю гранулоцитарно-макрофагальних колонієутворюючих одиниць і їх проліферативного потенціалу пуповинна кров значно перевершує периферичну кров дорослих навіть після введення ростових факторів. У довгострокових клітинних культурах in vitro відзначена велика проліферативна активність і життєздатність клітин пуповинної крові, ніж клітин кісткового мозку. Критичними моментами в трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові є кількість і кровотворний потенціал ядерні клітин, наявність цитомегаловірусної інфекції, HLA-сумісність донора і реципієнта, маса тіла і вік хворого.

Проте, трансплантацію стовбурових клітин пуповинної крові слід розглядати як альтернативу пересадці кісткового мозку з метою лікування важких захворювань крові, в першу чергу у дітей. Клінічні проблеми трансплантації клітин пуповинної крові поступово вирішуються - вже існують досить ефективні методи забору, сепарації і кріоконсервації клітин пуповинної крові, забезпечуються умови для формування банків пуповинної крові, вдосконалюються способи тестування ядерні клітин. Оптимальними для сепарації при масштабної заготівлі гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові при створенні банків слід вважати 3% розчин желатину і 6% розчин гідроксиетилкрохмалю.

П. Перехрестенків і співавтори (2001) справедливо відзначають, що трансплантація стовбурових клітин пуповинної крові повинна зайняти належне місце в комплексі лікувальних заходів з подолання депресій кровотворення різного генезу, оскільки ГСК пуповинної крові відрізняються рядом істотних переваг, серед яких важливим є відносна простота їх заготовки, відсутність ризику для донора, низька контамінація неонатальних клітин вірусами і порівняно невисока собівартість пересадки. Деякі автори вказують на те, що трансплантація клітин пуповинної крові рідше, ніж пересадка клітин кісткового мозку, супроводжується ускладненнями, пов'язаними з реакцією "трансплантат проти господаря", що обумовлено, на їхню думку, слабкою експресією на клітинах пуповинної крові HLA-DR антигенів і їх незрілістю. Проте, основною популяцією ядерних клітин пуповинної крові є Т-лімфоцити (СDЗ-позитивні клітини), зміст яких становить близько 50%, що на 20% менше, ніж в периферичної крові дорослої людини, однак фенотипічні відмінності субпопуляцій Т-клітин з цих джерел незначні.

Серед чинників, прямо впливають на виживаність при трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові, слід зазначити вік хворих (кращі результати спостерігаються у реципієнтів у віці від року до 5 років), ранню діагностику захворювання і форму лейкозу (ефективність значно вище при гострих лейкозах). Велике значення мають доза ядерні клітин пуповинної крові, а також їх HLA-сумісність з реципієнтом. Не випадково аналіз клінічної ефективності трансплантації ГСК пуповинної крові в онкогематології свідчить про кращі результати лікування при використанні родинних трансплантатів: річна безрецидивної виживаність в цьому випадку досягає 63%, тоді як при неспорідненій трансплантації - всього 29%.

Таким чином, наявність великої кількості стовбурових клітин в пуповинній крові і висока репопуляціонная здатність неонатальних гемопоетичних стовбурових клітин дозволяють використовувати їх для алогенних трансплантацій у онкогематологічних хворих. Однак слід звернути увагу на те, що рекапітуляція гемопоезу після трансплантації кровотворних клітин пуповинної крові "розтягнута в часі": відновлення змісту в периферичної крові нейтрофілів звичайно спостерігається до кінця 6-го тижня, а явища тромбоцитопенії зникають, як правило, через 6 місяців. Крім того, незрілість кровотворних клітин пуповинної крові зовсім не виключає імунологічних конфліктів: важкий перебіг гострої і хронічної реакції "трансплантат проти господаря" спостерігається відповідно у 23 та 25% реципієнтів. Рецидиви гострого лейкозу до кінця першого року після пересадки клітин пуповинної крові відзначаються в 26% випадків.

[10], [11]