Обмеження, небезпеки та ускладнення клітинної трансплантації

Регенеративна пластична медицина базується на клінічній реалізації тоті- та плюрипотентних властивостей ембріональних та прогениторних стовбурових клітин, які дозволяють in vitro та in vivo створювати специфічні клітинні лінії, що репопулюють пошкоджені тканини та органи хворої людини.

Реальна можливість використання ембріональних стовбурових клітин та стовбурових клітин остаточних тканин (так званих «дорослих» стовбурових клітин) людини в терапевтичних цілях вже не викликає сумнівів. Однак експерти Національної та Медичної академій США (Стовбурові клітини та майбутня регенеративна медицина National Academy Press) та Національного інституту охорони здоров'я США (Стовбурові клітини та майбутні напрямки досліджень. Nat. Inst, of Health USA) рекомендують провести більш детальне вивчення властивостей стовбурових клітин в експериментах на адекватних біологічних моделях та об'єктивну оцінку всіх наслідків трансплантації, і лише потім використовувати стовбурові клітини в клініці.

Встановлено, що стовбурові клітини входять до складу тканинних похідних усіх трьох зародкових шарів. Стовбурові клітини знаходяться в сітківці, рогівці, епідермісі шкіри, кістковому мозку та периферичній крові, у кровоносних судинах, пульпі зуба, нирках, шлунково-кишковому епітелії, підшлунковій залозі та печінці. За допомогою сучасних методів було доведено, що нейронні стовбурові клітини локалізуються в головному та спинному мозку дорослої людини. Ці сенсаційні дані привернули особливу увагу вчених та ЗМІ, оскільки нейрони в мозку служили класичним прикладом статичної клітинної популяції, яка не відновлюється. Як у ранні, так і в пізні періоди онтогенезу, в мозку тварин і людини завдяки нейронним стовбуровим клітинам утворюються нейрони, астроцити та олігодендроцити (Стовбурові клітини: науковий прогрес та напрямки майбутніх досліджень. Національний інститут охорони здоров'я США).

Однак за нормальних умов пластичність стовбурових клітин дефінітивних тканин не проявляється. Для реалізації пластичного потенціалу стовбурових клітин дефінітивних тканин їх необхідно виділити, а потім культивувати в середовищах з цитокінами (LIF, EGF, FGF). Більше того, похідні стовбурових клітин успішно приживаються лише при пересадці в організм тварини з пригніченою імунною системою (γ-опромінення, цитостатики, бусульфан тощо). На сьогоднішній день не отримано переконливих доказів реалізації пластичності стовбурових клітин у тварин, які не зазнали впливу радіації чи інших впливів, що викликають глибоку імуносупресію.

У таких умовах небезпечний потенціал ЕСК проявляється, перш за все, під час їх трансплантації в ектопічні ділянки – під час підшкірного введення ЕСК імунодефіцитним мишам у місці ін'єкції утворюються тератокарциноми. Крім того, під час розвитку ембріона людини частота хромосомних аномалій вища, ніж в ембріогенезі у тварин. На стадії бластоцисти лише 20-25% ембріонів людини складаються з клітин з нормальним каріотипом, а переважна більшість ранніх ембріонів людини, отриманих після екстракорпорального запліднення, демонструють хаотичний хромосомний мозаїцизм і дуже часто зустрічаються з числовими та структурними абераціями.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Корисний вплив стовбурових клітин

Попередні результати клінічних випробувань підтверджують корисний вплив стовбурових клітин на пацієнта, але досі немає інформації про довгострокові наслідки клітинної трансплантації. У літературі спочатку переважали повідомлення про позитивні результати трансплантації ембріональних фрагментів мозку при хворобі Паркінсона, але потім почали з'являтися дані, що заперечують ефективний терапевтичний ефект ембріональної або фетальної нервової тканини, пересадженої в мозок пацієнтів.

У середині 20 століття вперше було виявлено відновлення кровотворення у летально опромінених тварин після внутрішньовенного переливання клітин кісткового мозку, а в 1969 році американський дослідник Д. Томас здійснив першу трансплантацію кісткового мозку людині. Відсутність знань про механізми імунологічної несумісності клітин кісткового мозку донора та реципієнта на той час призводила до високої смертності через часті невдалі трансплантації та розвиток реакції «трансплантат проти господаря». Відкриття головного комплексу гістосумісності, до якого входять лейкоцитарні антигени людини (HbA1c), та вдосконалення методів їх типування дозволили значно підвищити виживаність після трансплантації кісткового мозку, що призвело до широкого використання цього методу лікування в онкогематології. Десятиліття потому були проведені перші трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК), отриманих з периферичної крові за допомогою лейкаферезу. У 1988 році пуповинна кров вперше була використана як джерело ГСК у Франції для лікування дитини з анемією Фанконі, а з кінця 2000 року в пресі з'явилися повідомлення про здатність ГСК диференціюватися в клітини різних типів тканин, що потенційно розширює сферу їх клінічного застосування. Однак виявилося, що трансплантаційний матеріал, поряд з ГСК, містить значну кількість негемопоетичних клітинних домішок різної природи та властивостей. У зв'язку з цим розробляються методи очищення трансплантата та критерії оцінки його клітинної чистоти. Зокрема, використовується позитивна імуноселекція CD34+ клітин, яка дозволяє виділити ГСК за допомогою моноклональних антитіл.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Ускладнення терапії стовбуровими клітинами

Ускладнення при трансплантації кісткового мозку найчастіше бувають гематологічними та пов'язані з тривалим періодом ятрогенної панцитопенії. Найчастіше розвиваються інфекційні ускладнення, анемія та крововиливи. У зв'язку з цим надзвичайно важливо вибрати оптимальний режим збору, обробки та зберігання кісткового мозку для максимального збереження стовбурових клітин, що забезпечить швидке та стабільне відновлення кровотворення. При характеристиці трансплантата наразі зазвичай оцінюються такі параметри: кількість мононуклеарних та/або ядерних клітин, колонієутворюючих одиниць та вміст CD34-позитивних клітин. На жаль, ці показники дають лише непряму оцінку реальної гемопоетичної здатності популяції стовбурових клітин трансплантата. Сьогодні немає абсолютно точних параметрів для визначення достатності трансплантата для тривалого відновлення кровотворення у пацієнтів, навіть при аутологічній трансплантації кісткового мозку. Розробка загальних критеріїв надзвичайно складна через відсутність суворих стандартів обробки, кріоконсервації та тестування трансплантата. Крім того, необхідно враховувати всю різноманітність факторів, що впливають на параметри успішного відновлення кровотворення у кожного окремого пацієнта. При аутологічній трансплантації кісткового мозку найважливішими з них є кількість попередніх курсів хіміотерапії, особливості режиму кондиціонування, період захворювання, при якому було проведено забір кісткового мозку, та схеми використання колонієстимулюючих факторів у посттрансплантаційному періоді. Крім того, не слід забувати, що хіміотерапія, що передує забору трансплантата, може негативно впливати на стовбурові клітини кісткового мозку.

Частота тяжких токсичних ускладнень значно зростає під час алогенної трансплантації кісткового мозку. У зв'язку з цим цікаві статистичні дані щодо алогенної трансплантації кісткового мозку при таласемії. У звітах Європейської групи з трансплантації кісткового мозку зареєстровано близько 800 трансплантацій кісткового мозку пацієнтам з таласемією майор. Алогенна трансплантація при таласемії у переважній більшості випадків проводиться від HLA-ідентичних братів і сестер, що пов'язано з тяжкими ускладненнями та високою смертністю під час трансплантації матеріалу стовбурових клітин від частково сумісних споріднених або сумісних неспоріднених донорів. Щоб мінімізувати ризик фатальних інфекційних ускладнень, пацієнтів розміщують в ізольованих асептичних боксах з ламінарним потоком повітря та отримують низько- або абактеріальну дієту. Для бактеріальної деконтамінації кишечника призначають нерозсмоктуючі форми антибіотиків та протигрибкових препаратів per os. Для профілактики внутрішньовенно вводять амфотерицин B. Профілактику системних інфекцій підсилюють амікацином та цефтазидимом, які призначають за день до трансплантації, продовжуючи лікування до виписки пацієнта. Усі препарати крові перед переливанням опромінюються в дозі 30 Гр. Парентеральне харчування під час трансплантації є необхідною умовою і починається одразу після обмеження споживання їжі природним шляхом.

З високою токсичністю імуносупресивних препаратів пов'язаний ряд ускладнень, які часто викликають нудоту, блювоту та мукозит, ураження нирок та інтерстиціальну пневмонію. Одним з найважчих ускладнень хіміотерапії є вено-оклюзивне захворювання печінки, що призводить до смерті в ранньому післятрансплантаційному періоді. До факторів ризику тромбозу вен портальної системи печінки належать вік пацієнтів, наявність гепатиту та фіброзу печінки, а також імуносупресивна терапія після трансплантації кісткового мозку. Вено-оклюзивне захворювання особливо небезпечне при таласемії, яка супроводжується гемосидерозом печінки, гепатитом та фіброзом – частими супутниками трансфузійної терапії. Тромбоз вен портальної системи печінки розвивається через 1-2 тижні після трансплантації та характеризується швидким підвищенням вмісту білірубіну та активності трансаміназ у крові, прогресуванням гепатомегалії, асциту, енцефалопатії та болю у верхній частині живота. Гістологічно в матеріалі розтину виявлено пошкодження ендотелію, субендотеліальні крововиливи, пошкодження центрилобулярних гепатоцитів, тромботичну обструкцію венул та центральних вен печінки. У пацієнтів з таласемією описані випадки летальної зупинки серця, пов'язаної з токсичною дією цитостатиків.

У передтрансплантаційний період циклофосфамід та бусульфан часто викликають токсично-геморагічний цистит з патологічними змінами уроепітеліальних клітин. Застосування циклоспорину А при трансплантації кісткового мозку часто супроводжується нефро- та нейротоксичністю, гіпертензивним синдромом, затримкою рідини в організмі та цитолізом гепатоцитів. Статева та репродуктивна дисфункція частіше спостерігається у жінок. У дітей раннього віку статеве дозрівання після трансплантації зазвичай не порушується, але у дітей старшого віку патологія розвитку статевої сфери може бути дуже серйозною – аж до стерильності. До ускладнень, безпосередньо пов’язаних із самою трансплантацією, належать відторгнення алогенних клітин кісткового мозку, несумісність за системою АВО, гострі та хронічні форми реакції «трансплантат проти господаря».

У пацієнтів з трансплантацією кісткового мозку, несумісною за системою ABO, ізоаглютиніни донора, що контролюються системою ABO, виробляються протягом 330-605 днів після трансплантації, що може призвести до тривалого гемолізу та різко збільшити потребу в переливанні крові. Цьому ускладненню запобігають, переливаючи лише еритроцити 0 типу. Після трансплантації у деяких пацієнтів розвивається аутоімунна нейтропенія, тромбоцитопенія або панцитопенія, для корекції яких потрібна спленектомія.

У 35-40% реципієнтів гостра реакція «трансплантат проти господаря» розвивається протягом 100 днів після алогенної трансплантації кісткового мозку, ідентичного за HLA. Ступінь ураження шкіри, печінки та кишечника варіюється від висипу, діареї та помірної гіпербілірубінемії до десквамації шкіри, кишкової непрохідності та гострої печінкової недостатності. У пацієнтів з таласемією частота гострої реакції «трансплантат проти господаря» I ступеня після трансплантації кісткового мозку становить 75%, а II ступеня та вище – 11-53%. Хронічна реакція «трансплантат проти господаря» як системний поліорганний синдром зазвичай розвивається протягом 100-500 днів після алогенної трансплантації кісткового мозку у 30-50% пацієнтів. Уражаються шкіра, ротова порожнина, печінка, очі, стравохід та верхні дихальні шляхи. Розрізняють обмежену форму хронічної реакції «трансплантат проти господаря», коли уражається шкіра та/або печінка, та поширену форму, коли генералізовані ураження шкіри поєднуються з хронічним агресивним гепатитом, ураженням очей, слинних залоз або будь-якого іншого органу. Смерть часто спричиняють інфекційні ускладнення, що виникають внаслідок тяжкого імунодефіциту. При таласемії легка форма хронічної реакції «трансплантат проти господаря» зустрічається у 12%, середньої тяжкості — у 3%, а тяжка — у 0,9% реципієнтів алогенного HLA-сумісного кісткового мозку. Тяжким ускладненням трансплантації кісткового мозку є відторгнення трансплантата, яке розвивається через 50-130 днів після операції. Частота відторгнення залежить від режиму кондиціонування. Зокрема, у пацієнтів з таласемією, які отримували лише метотрексат у період підготовки, відторгнення трансплантата кісткового мозку спостерігалося у 26% випадків, при комбінації метотрексату з циклоспорином А — у 9% випадків, а при призначенні лише циклоспорину А — у 8% випадків (Газієв та ін., 1995).

Інфекційні ускладнення після трансплантації кісткового мозку спричиняються вірусами, бактеріями та грибками. Їх розвиток пов'язаний з глибокою нейтропенією, індукованою хіміотерапевтичними препаратами в період кондиціонування, пошкодженням слизових бар'єрів цитостатиками та реакцією «трансплантат проти господаря». Залежно від часу розвитку розрізняють три фази інфекційних ускладнень. У першій фазі (розвивається в перший місяць після трансплантації) переважають пошкодження слизових бар'єрів та нейтропенія, часто супроводжувані вірусними інфекціями (герпес, вірус Епштейна-Барр, цитомегаловірус, Varicella zoster), а також інфекціями, спричиненими грампозитивними та грамнегативними бактеріями, грибами Candida, аспергілами. У ранньому посттрансплантаційному періоді (другий та третій місяці після трансплантації) найважчою інфекцією є цитомегаловірусна, яка часто призводить до смерті пацієнтів у другій фазі інфекційних ускладнень. При таласемії цитомегаловірусна інфекція після трансплантації кісткового мозку розвивається у 1,7-4,4% реципієнтів. Третя фаза спостерігається в пізньому посттрансплантаційному періоді (через три місяці після операції) і характеризується тяжким комбінованим імунодефіцитом. Інфекції, спричинені Varicella zoster, стрептококом, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae та гепатотропними вірусами, є поширеними в цей період. При таласемії смертність пацієнтів після трансплантації кісткового мозку пов'язана з бактеріальним та грибковим сепсисом, ідіопатичною інтерстиціальною та цитомегаловірусною пневмонією, гострим респіраторним дистрес-синдромом, гострою серцевою недостатністю, тампонадою серця, крововиливом у мозок, вено-оклюзивним захворюванням печінки та гострою реакцією "трансплантат проти господаря".

Наразі досягнуто певних успіхів у розробці методів виділення чистих популяцій гемопоетичних стовбурових клітин з кісткового мозку. Удосконалено методику отримання фетальної крові з пуповини, створено методи виділення гемопоетичних клітин з пуповинної крові. У науковій пресі є повідомлення про те, що гемопоетичні стовбурові клітини здатні до розмноження при культивуванні в середовищах з цитокінами. При використанні спеціально розроблених біореакторів для розширення гемопоетичних стовбурових клітин біомаса гемопоетичних стовбурових клітин, виділених з кісткового мозку, периферичної або пуповинної крові, значно зростає. Можливість розширення гемопоетичних стовбурових клітин є важливим кроком до клінічного розвитку клітинної трансплантації.

Однак, перед розмноженням гемопоетичних стовбурових клітин in vitro необхідно виділити гомогенну популяцію гемопоетичних стовбурових клітин. Зазвичай це досягається за допомогою маркерів, що дозволяють селективно мітити гемопоетичні стовбурові клітини моноклональними антитілами, ковалентно зв'язаними з флуоресцентною або магнітною міткою, та виділити їх за допомогою відповідного сортувальника клітин. Водночас питання фенотипових характеристик гемопоетичних стовбурових клітин остаточно не вирішене. А. Петренко, В. Грищенко (2003) розглядають клітини з антигенами CD34, AC133 та Thyl на своїй поверхні та без маркерів CD38, HLA-DR або інших маркерів диференціації (клітини з фенотипом CD34+Liir) як кандидатів на роль гемопоетичних стовбурових клітин. Лінійні (Lin) маркери включають глікофорин А (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Клітини з фенотипом CD34+CD45RalüW CD71low, а також фенотипом CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low вважаються перспективними для трансплантації.

Проблемним залишається питання кількості гемопоетичних стовбурових клітин, достатньої для ефективної трансплантації. Наразі джерелами гемопоетичних стовбурових клітин є кістковий мозок, периферична та пуповинна кров, а також ембріональна печінка. Розмноження гемопоетичних стовбурових клітин досягається шляхом їх культивування в присутності ендотеліальних клітин та гемопоетичних факторів росту. У різних протоколах для індукції проліферації ГСК використовуються мієлопротеїни, СКФ, еритропоетин, інсуліноподібні фактори росту, кортикостероїди та естрогени. При використанні комбінацій цитокінів in vitro можна досягти значного збільшення пулу ГСК з піком їх виходу наприкінці другого тижня культивування.

Традиційно трансплантацію гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові використовують переважно для лікування гемобластозів. Однак мінімальна доза гемопоетичних клітин, необхідна для успішної трансплантації клітин пуповинної крові, становить 3,7 x 10⁻ ^{ядерних} клітин на 1 кг маси тіла реципієнта. Використання меншої кількості гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові значно підвищує ризик відторгнення трансплантата та рецидиву захворювання. Тому трансплантацію гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові використовують переважно для лікування гемобластозів у дітей.

На жаль, досі не існує стандартів щодо заготівлі або стандартизованих протоколів клінічного використання гемопоетичних клітин пуповинної крові. Відповідно, самі стовбурові клітини пуповинної крові не є юридично визнаним джерелом гемопоетичних клітин для трансплантації. Крім того, немає етичних чи правових норм, що регулюють діяльність та організацію банків пуповинної кровіb, які існують за кордоном. Тим часом, для безпечної трансплантації всі зразки пуповинної крові повинні ретельно контролюватися. Перед забором крові у вагітної жінки необхідно отримати її згоду. Кожна вагітна жінка повинна бути обстежена на носійство HBsAg, наявність антитіл до вірусів гепатиту С, ВІЛ та сифілісу. Кожен зразок пуповинної крові має бути стандартно протестований на кількість ядерних клітин, CD34+ та колонієутворюючу здатність. Крім того, проводиться HbA-типування, визначення групи крові за системою ABO та її належності за резус-фактором. Необхідні процедури тестування: бактеріологічний посів на стерильність, серологічне тестування на ВІЛ-1 та ВІЛ-2 інфекції, HBsAg, вірусний гепатит С, цитомегаловірусну інфекцію, HTLY-1 та HTLY-II, сифіліс та токсоплазмоз. Крім того, для виявлення цитомегаловірусної та ВІЛ-інфекцій проводиться полімеразна ланцюгова реакція. Доцільним є доповнити протоколи тестування аналізом ГСК пуповинної крові для виявлення таких генетичних захворювань, як α-таласемія, серповидноклітинна анемія, дефіцит аденозиндезамінази, агаммаглобулінемія Брутона, хвороби Гурлера та Понтера.

Наступним етапом підготовки до трансплантації є питання збереження гемопоетичних стовбурових клітин. Найбільш небезпечними процедурами для життєздатності клітин під час їх підготовки є заморожування та розморожування. При заморожуванні гемопоетичних клітин значна їх частина може бути зруйнована через кристалоутворення. Для зниження відсотка загибелі клітин використовуються спеціальні речовини – кріопротектори. Найчастіше як кріопротектор використовують ДМСО в кінцевій концентрації 10%. Однак ДМСО в такій концентрації характеризується прямим цитотоксичним ефектом, який проявляється навіть за умов мінімального впливу. Зниження цитотоксичного ефекту досягається суворим підтриманням нульової температури режиму впливу, а також дотриманням регламенту обробки матеріалу під час та після розморожування (швидкість усіх маніпуляцій, використання багаторазових процедур промивання). Не слід використовувати концентрації ДМСО менше 5%, оскільки це спричиняє масову загибель гемопоетичних клітин протягом періоду заморожування.

Наявність домішок еритроцитів у суспензійній суміші гемопоетичних стовбурових клітин створює ризик розвитку реакції несумісності за еритроцитарними антигенами. Водночас, при видаленні еритроцитів, втрата гемопоетичних клітин значно зростає. У зв'язку з цим запропоновано метод нефракціонованого виділення гемопоетичних стовбурових клітин. У цьому випадку для захисту ядерних клітин від шкідливого впливу низьких температур використовується 10% розчин ДМСО та охолодження з постійною швидкістю (Гс/хв) до -80°C, після чого клітинну суспензію заморожують у рідкому азоті. Вважається, що цей метод кріоконсервації призводить до часткового лізису еритроцитів, тому зразки крові не потребують фракціонування. Перед трансплантацією клітинну суспензію розморожують, відмивають від вільного гемоглобіну та ДМСО у розчині людського альбуміну або в сироватці крові. Збереження гемопоетичних попередників за допомогою цього методу дійсно вище, ніж після фракціонування пуповинної крові, але ризик трансфузійних ускладнень через переливання АВО-несумісних еритроцитів залишається.

Створення банківської системи для зберігання зразків HLA-тестованих та типованих HSC могло б вирішити вищезазначені проблеми. Однак це вимагає розробки етичних та правових норм, які наразі лише обговорюються. Перед створенням банківської мережі необхідно прийняти низку нормативних актів та документів щодо стандартизації процедур збору, фракціонування, тестування та типування, а також кріоконсервації HSC. Обов'язковою умовою ефективної роботи банків HSC є організація комп'ютерної бази для взаємодії з реєстрами Всесвітньої асоціації донорів кісткового мозку (WMDA) та Національної програми донорів кісткового мозку США (NMDP).

Крім того, необхідно оптимізувати та стандартизувати методи розширення ГСК in vitro, насамперед гемопоетичних клітин пуповинної крові. Розширення ГСК пуповинної крові необхідне для збільшення кількості потенційних реципієнтів, сумісних із системою HLA. Через невеликі обсяги пуповинної крові кількість ГСК, що містяться в ній, зазвичай не здатна забезпечити репопуляцію кісткового мозку у дорослих пацієнтів. Водночас, для проведення неспоріднених трансплантацій необхідно мати доступ до достатньої кількості типованих зразків ГСК (від 10 000 до 1 500 000 на реципієнта).

Трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин не усуває ускладнень, що супроводжують трансплантацію кісткового мозку. Аналіз показує, що при трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові важкі форми гострої реакції «трансплантат проти господаря» розвиваються у 23% реципієнтів, а хронічні форми — у 25%. У онкогематологічних пацієнтів рецидиви гострого лейкозу протягом першого року після трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові спостерігаються у 26% випадків.

В останні роки інтенсивно розвиваються методи трансплантації периферичних гемопоетичних стовбурових клітин. Вміст ГСК у периферичній крові настільки малий (1 ГСК на 100 000 клітин крові), що їх виділення без спеціальної підготовки не має сенсу. Тому донору спочатку проводять курс медикаментозної стимуляції виходу гемопоетичних клітин кісткового мозку в кров. Для цього використовуються такі далеко не нешкідливі препарати, як циклофосфамід та гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор. Але навіть після процедури мобілізації ГСК у периферичну кров вміст CD34+ клітин у ній не перевищує 1,6%.

Для мобілізації гемопоетичних стовбурових клітин у клініці найчастіше використовується S-SEC, яка характеризується відносно доброю переносимістю, за винятком майже природного виникнення болю в кістках. Слід зазначити, що використання сучасних кровотворних сепараторів дозволяє ефективно ізолювати гемопоетичні стовбурові клітини. Однак за нормальних умов гемопоезу для отримання достатньої кількості гемопоетичних стовбурових клітин, порівнянних за репопуляційною здатністю із суспензією кісткового мозку, необхідно виконати щонайменше 6 процедур. Кожна така процедура вимагає обробки 10-12 літрів крові на сепараторі, що може спричинити тромбоцитопенію та лейкопенію. Процедура сепарації передбачає введення донору антикоагулянту (цитрату натрію), що не виключає, однак, контактної активації тромбоцитів під час екстракорпорального центрифугування. Ці фактори створюють умови для розвитку інфекційних та геморагічних ускладнень. Ще одним недоліком методу є значна варіабельність мобілізаційної реакції, що вимагає контролю вмісту ГСК у периферичній крові донорів, що необхідно для визначення їх максимального рівня.

Аутогенна трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин, на відміну від алогенної трансплантації, повністю виключає розвиток реакції відторгнення. Однак суттєвим недоліком аутотрансплантації гемопоетичних стовбурових клітин, що обмежує коло показань до її проведення, є висока ймовірність реінфузії лейкемічних клонових клітин з трансплантатом. Крім того, відсутність імуноопосередкованого ефекту «трансплантат проти пухлини» значно збільшує частоту рецидивів злоякісних захворювань крові. Тому єдиним радикальним методом усунення неопластичного клонального кровотворення та відновлення нормального поліклонального кровотворення при мієлодиспластичних синдромах залишається інтенсивна поліхіміотерапія з трансплантацією алогенного кровотворення.

Але навіть у цьому випадку лікування більшості гемобластозів спрямоване лише на збільшення часу виживання пацієнтів та покращення їхньої якості життя. Згідно з кількома великими дослідженнями, тривала безрецидивна виживаність після алотрансплантації ГСК досягається у 40% онкогематологічних пацієнтів. При використанні стовбурових клітин HLA-сумісного брата/сестри найкращі результати спостерігаються у молодих пацієнтів з коротким анамнезом захворювання, кількістю бластних клітин до 10% та сприятливою цитогенетикою. На жаль, смертність, пов'язана з процедурою алотрансплантації ГСК у пацієнтів з мієлодиспластичними захворюваннями, залишається високою (у більшості повідомлень - близько 40%). Результати 10-річної роботи Національної програми донорства кісткового мозку в США (510 пацієнтів, медіанний вік - 38 років) свідчать про те, що безрецидивна виживаність протягом двох років становить 29% при відносно низькій ймовірності рецидиву (14%). Однак, смертність, пов'язана з процедурою алотрансплантації ГСК від неспорідненого донора, є надзвичайно високою та сягає 54% протягом дворічного періоду. Подібні результати були отримані в європейському дослідженні (118 пацієнтів, медіана віку – 24 роки, дворічна безрецидивна виживаність – 28%, рецидив – 35%, смертність – 58%).

Під час інтенсивних курсів хіміотерапії з подальшим відновленням кровотворення алогенними гемопоетичними клітинами часто виникають імуногематологічні та трансфузійні ускладнення. Вони значною мірою зумовлені тим, що групи крові людини успадковуються незалежно від молекул MHC. Тому, навіть якщо донор і реципієнт сумісні за основними антигенами HLA, їхні еритроцити можуть мати різні фенотипи. Розрізняють «велику» несумісність, коли у реципієнта вже є антитіла до еритроцитарних антигенів донора, та «малу» несумісність, коли у донора є антитіла до еритроцитарних антигенів реципієнта. Можливі випадки поєднання «великої» та «малої» несумісності.

Результати порівняльного аналізу клінічної ефективності алотрансплантації гемопоетичних стовбурових клітин кісткового мозку та пуповинної крові при гемобластозах свідчать про те, що у дітей після алотрансплантації гемопоетичних стовбурових клітин пуповинної крові ризик розвитку реакції «трансплантат проти господаря» значно знижується, але спостерігається триваліший період відновлення кількості нейтрофілів та тромбоцитів з вищою частотою 100-денної посттрансплантаційної смертності.

Вивчення причин ранньої смертності дозволило уточнити протипоказання до алогенної трансплантації ГСК, серед яких найважливішими є:

• наявність позитивних тестів на цитомегаловірусну інфекцію у реципієнта або донора (без профілактичного лікування);
• гостра променева хвороба;
• наявність або навіть підозра на наявність мікотичної інфекції у пацієнта (без проведення системної ранньої профілактики фунгіцидними препаратами);
• гемобластози, при яких пацієнти отримували тривале лікування цитостатиками (через високу ймовірність раптової зупинки серця та поліорганної недостатності);
• трансплантація від HLA-неідентичних донорів (без профілактики гострої реакції «трансплантат проти хазяїна» циклоспорином А);
• хронічний вірусний гепатит С (через високий ризик розвитку вено-оклюзивного захворювання печінки).

Таким чином, трансплантація ГСК може спричинити серйозні ускладнення, які часто призводять до смерті. У ранньому (до 100 днів після трансплантації) періоді до них належать інфекційні ускладнення, гостра реакція «трансплантат проти господаря», відторгнення трансплантата (відторгнення донорських ГСК), вено-оклюзивне захворювання печінки, а також пошкодження тканин, спричинені токсичністю режиму кондиціонування, який характеризується високою швидкістю ремоделювання (шкіра, судинний ендотелій, кишковий епітелій). Ускладнення пізнього посттрансплантаційного періоду включають хронічну реакцію «трансплантат проти господаря», рецидиви основного захворювання, затримку росту у дітей, порушення функції репродуктивної системи та щитовидної залози, а також пошкодження очей.

Останнім часом, у зв'язку з публікаціями про пластичність клітин кісткового мозку, виникла ідея використання ГСК для лікування інфарктів та інших захворювань. Хоча деякі експерименти на тваринах підтверджують цю можливість, висновки про пластичність клітин кісткового мозку потребують підтвердження. Цю обставину повинні враховувати ті дослідники, які вважають, що трансплантовані клітини кісткового мозку людини легко трансформуються в клітини скелетних м'язів, міокарда або ЦНС. Гіпотеза про те, що ГСК є природним клітинним джерелом регенерації цих органів, потребує серйозних доказів.

Зокрема, опубліковано перші результати відкритого рандомізованого дослідження В. Бєленкова (2003). Його метою було вивчення впливу C-SvK (тобто мобілізації аутологічних ГСК у кров) на клінічний, гемодинамічний та нейрогуморальний статус пацієнтів з хронічною серцевою недостатністю середнього та тяжкого ступеня, а також оцінка його безпеки на тлі стандартної терапії (інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту, бета-блокатори, діуретики, серцеві глікозиди). У першій публікації результатів дослідження автори програми зазначають, що єдиним аргументом на користь O-SvK є результати лікування одного пацієнта, у якого спостерігалося безперечне покращення всіх клінічних та гемодинамічних показників на тлі терапії цим препаратом. Однак теорія мобілізації ГСК у кров з подальшою регенерацією міокарда в постінфарктній зоні не була підтверджена – навіть у пацієнта з позитивною клінічною динамікою стрес-ехокардіографія з добутаміном не виявила появи зон життєздатного міокарда в області рубця.

Слід зазначити, що наразі явно недостатньо даних, щоб рекомендувати замісну клітинну терапію для широкого впровадження в повсякденну клінічну практику. Необхідні добре сплановані та високоякісні клінічні дослідження, щоб визначити ефективність різних варіантів регенеративної клітинної терапії, розробити показання та протипоказання до неї, а також рекомендації щодо комбінованого використання регенеративно-пластичної терапії та традиційного хірургічного або консервативного лікування. Досі немає відповіді на питання, яка саме популяція клітин кісткового мозку (стовбурові гемопоетичні чи стромальні) може давати початок нейронам та кардіоміоцитам, а також незрозуміло, які умови сприяють цьому in vivo.

Роботи в цих напрямках ведуться в багатьох країнах. У підсумковому звіті симпозіуму з гострої печінкової недостатності Національних інститутів охорони здоров'я США серед перспективних методів лікування, поряд з трансплантацією печінки, зазначається трансплантація ксено- або алогенних гепатоцитів та екстракорпоральне підключення біореакторів з клітинами печінки. Існують прямі докази того, що лише чужорідні функціонально активні гепатоцити здатні забезпечити ефективну підтримку печінки реципієнта. Для клінічного використання ізольованих гепатоцитів необхідно створити банк клітин, що дозволить значно скоротити час між виділенням клітин та їх використанням. Найбільш прийнятним методом створення банку ізольованих гепатоцитів є кріоконсервація клітин печінки в рідкому азоті. При використанні таких клітин у клініці у пацієнтів з гострою та хронічною печінковою недостатністю виявлено досить високий терапевтичний ефект.

Незважаючи на оптимістичні та обнадійливі результати трансплантації клітин печінки в експериментах та клінічній практиці, все ще існує багато проблем, які далекі від вирішення. До них належать обмежена кількість органів, придатних для отримання ізольованих гепатоцитів, недостатньо ефективні методи їх виділення, відсутність стандартизованих методів збереження клітин печінки, нечіткі уявлення про механізми регуляції росту та проліферації трансплантованих клітин, відсутність адекватних методів оцінки приживлення або відторгнення алогенних гепатоцитів. Сюди також належить наявність трансплантаційного імунітету при використанні алогенних та ксеногенних клітин, хоча й менший, ніж при ортотопічній трансплантації печінки, але потребує застосування імуносупресантів, інкапсуляції ізольованих гепатоцитів або їх спеціальної обробки ферментами. Трансплантація гепатоцитів часто призводить до імунного конфлікту між реципієнтом та донором у вигляді реакції відторгнення, що вимагає застосування цитостатиків. Одним із рішень цієї проблеми може бути використання полімерних мікропористих носіїв для виділення клітин печінки, що покращить їх виживання, оскільки капсульна мембрана ефективно захищає гепатоцити, незважаючи на імунізацію господаря.

Однак, при гострій печінковій недостатності така трансплантація гепатоцитів є неефективною через відносно тривалий час, необхідний для приживлення клітин печінки в новому середовищі та досягнення стадії оптимального функціонування. Потенційним обмеженням є секреція жовчі під час ектопічної трансплантації ізольованих гепатоцитів, а при використанні біореакторів значним фізіологічним бар'єром є видова невідповідність між білками людини та білками, що продукуються ксеногенними гепатоцитами.

У літературі є повідомлення про те, що локальна трансплантація стромальних стовбурових клітин кісткового мозку сприяє ефективній корекції дефектів кісток, а відновлення кісткової тканини в цьому випадку відбувається інтенсивніше, ніж при спонтанній репаративній регенерації. Кілька доклінічних досліджень на експериментальних моделях переконливо демонструють можливість використання трансплантатів стромальних клітин кісткового мозку в ортопедії, хоча потрібна подальша робота з оптимізації цих методів навіть у найпростіших випадках. Зокрема, оптимальні умови для розширення остеогенних стромальних клітин ex vivo ще не знайдені, а структура та склад їх ідеального носія (матриці) залишаються нерозвиненими. Мінімальна кількість клітин, необхідна для об'ємної регенерації кістки, не визначена.

Доведено, що мезенхімальні стовбурові клітини демонструють трансгермінальну пластичність, тобто здатність диференціюватися в типи клітин, фенотипово не пов'язані з клітинами вихідної лінії. За оптимальних умов культивування поліклональні лінії стромальних стовбурових клітин кісткового мозку можуть витримувати понад 50 поділів in vitro, що дозволяє отримати мільярди стромальних клітин з 1 мл аспірату кісткового мозку. Однак популяція мезенхімальних стовбурових клітин є гетерогенною, що проявляється як мінливістю розмірів колоній, різною швидкістю їх утворення, так і морфологічною різноманітністю типів клітин, від фібробластоподібних веретеноподібних до великих плоских клітин. Фенотипічна гетерогенність спостерігається вже через 3 тижні культивування стромальних стовбурових клітин: деякі колонії утворюють вузлики кісткової тканини, інші – скупчення адипоцитів, а треті, рідше – острівці хрящової тканини.

Трансплантація ембріональної нервової тканини спочатку використовувалася для лікування дегенеративних захворювань центральної нервової системи. В останні роки замість ембріональної тканини мозку трансплантують клітинні елементи нейросфер, отримані з нейронних стовбурових клітин (Полтавцева, 2001). Нейросфери містять комітовані попередники нейронів і нейроглії, що дає надію на відновлення втрачених функцій мозку після їх трансплантації. Після трансплантації диспергованих клітин нейросфер у область стріатуму мозку щурів відзначалася їх проліферація та диференціація в дофамінергічні нейрони, що усунуло рухову асиметрію у щурів з експериментальним геміпаркінсонізмом. Однак у деяких випадках з клітин нейросфер розвивалися пухлини, що призводило до загибелі тварин (Бйорклунд, 2002).

У клініці ретельні дослідження двох груп пацієнтів, в яких ні пацієнти, ні лікарі, що їх спостерігали, не знали (подвійне сліпе дослідження), що одній групі пацієнтів була трансплантована ембріональна тканина з нейронами, що продукують дофамін, а другій групі пацієнтів була проведена фіктивна операція, дали неочікувані результати. Пацієнти, яким була трансплантована ембріональна нервова тканина, почувалися не краще, ніж пацієнти контрольної групи. Крім того, у 5 з 33 пацієнтів через 2 роки після трансплантації ембріональної нервової тканини розвинулася стійка дискінезія, якої не було у пацієнтів контрольної групи (Стовбурові клітини: науковий прогрес та напрямки майбутніх досліджень. Національний інститут охорони здоров'я. США). Однією з невирішених проблем клінічних досліджень нейронних стовбурових клітин мозку залишається аналіз реальних перспектив та обмежень трансплантації їх похідних для корекції розладів ЦНС. Можливо, що нейроногенез у гіпокампі, індукований тривалою судомною активністю, що призводить до його структурної та функціональної перебудови, може бути фактором прогресуючого розвитку епілепсії. Цей висновок заслуговує на особливу увагу, оскільки вказує на можливі негативні наслідки генерації нових нейронів у зрілому мозку та формування ними аберантних синаптичних зв'язків.

Не слід забувати, що культивування в середовищах з цитокінами (мітогенами) наближає характеристики стовбурових клітин до характеристик пухлинних клітин, оскільки в них відбуваються аналогічні зміни в регуляції клітинних циклів, що визначають здатність до необмеженого поділу. Пересаджувати людині ранні похідні ембріональних стовбурових клітин є необдуманим, оскільки в цьому випадку загроза розвитку злоякісних новоутворень дуже висока. Набагато безпечніше використовувати їх більш комітований потомок, тобто клітини-попередники диференційованих ліній. Однак наразі надійної методики отримання стабільних ліній клітин людини, що диференціюються в потрібному напрямку, ще не розроблено.

Використання технологій молекулярної біології для корекції спадкової патології та захворювань людини шляхом модифікації стовбурових клітин становить великий інтерес для практичної медицини. Особливості геному стовбурових клітин дозволяють розробляти унікальні схеми трансплантації для корекції генетичних захворювань. Однак у цій галузі існує ряд обмежень, які необхідно подолати перед практичним застосуванням генної інженерії стовбурових клітин. Перш за все, необхідно оптимізувати процес модифікації геному стовбурових клітин ex vivo. Відомо, що тривала (3-4 тижні) проліферація стовбурових клітин знижує їх трансфекцію, тому для досягнення високого рівня їх генетичної модифікації необхідно кілька циклів трансфекції. Однак основна проблема пов'язана з тривалістю терапевтичної експресії генів. Досі в жодному дослідженні період ефективної експресії після трансплантації модифікованих клітин не перевищував чотирьох місяців. У 100% випадків з часом експресія трансфікованих генів знижується через інактивацію промоутерів та/або загибель клітин зі зміненим геномом.

Важливим питанням є вартість використання клітинних технологій у медицині. Наприклад, оціночна щорічна потреба у фінансуванні лише медичних витрат відділення трансплантації кісткового мозку, розрахованого на проведення 50 трансплантацій на рік, становить близько 900 000 доларів США.

Розвиток клітинних технологій у клінічній медицині – це складний та багатоетапний процес, що передбачає конструктивну співпрацю між багатопрофільними науковими та клінічними центрами та міжнародною спільнотою. Водночас, особливої уваги потребують питання наукової організації досліджень у галузі клітинної терапії. Найважливішими з них є розробка протоколів клінічних досліджень, контроль за достовірністю клінічних даних, формування національного реєстру досліджень, інтеграція в міжнародні програми багатоцентрових клінічних досліджень та впровадження результатів у клінічну практику.

На завершення вступу до проблем клітинної трансплантології хочу висловити сподівання, що об'єднання зусиль провідних українських спеціалістів з різних галузей науки забезпечить значний прогрес в експериментальних та клінічних дослідженнях і дасть змогу в найближчі роки знайти ефективні шляхи надання допомоги тяжкохворим людям, які потребують трансплантації органів, тканин і клітин.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]