Обмеження, небезпеки і ускладнення клітинної трансплантації

Регенеративно-пластична медицина заснована на реалізації в клініці тоті- і плюрипотентних властивостей ембріональних і прогеніторних стовбурових клітин, що дозволяють in vitro і in vivo створювати задані клітинні лінії, репопулірующіе пошкоджені тканини і органи хворої людини.

Реальна можливість використання в лікувальних цілях стовбурових клітин ембріона і стовбурових клітин дефінітивних тканин (так званих "дорослих" стовбурних клітин - adult stem cells) людини вже не викликає сумнівів. Однак експерти Національної та Медичної академій США (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) і Національний інститут здоров'я США (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) рекомендують більш детально вивчити властивості стовбурових клітин в дослідах на адекватних біологічних моделях і об'єктивно оцінити всі наслідки трансплантації, і тільки після цього використовувати стовбурові клітини в клініці.

Встановлено, що стовбурові клітини входять до складу тканинних похідних всіх трьох зародкових листків. Стовбурові клітини виявлені в сітківці ока, рогівці, епідермісі шкіри, кістковому мозку і в периферичної крові, в судинах, пульпи зуба, нирці, епітелії травного тракту, підшлунковій залозі та в печінці. За допомогою сучасних методів доведено, що стовбурові нейтральні клітини локалізовані в головному і спинному мозку дорослої людини. Ці сенсаційні дані привернули особливу увагу вчених і засобів масової інформації, так як нейрони головного мозку служили класичним прикладом статичної клітинної популяції, яка не відновлюється. Як в ранньому, так і в пізньому періодах онтогенезу за рахунок нейтральні стовбурових клітин в головному мозку тварин і людини утворюються нейрони, астроцити і олігодендроціти (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Однак в нормальних умовах пластичність стовбурових клітин дефінітивних тканин не виявляється. Для реалізації пластичного потенціалу стовбурових клітин дефінітивних тканин їх необхідно виділити, а потім культивувати в середовищах з цитокінами (LIF, EGF, FGF). Причому похідні стовбурових клітин успішно приживляються тільки при трансплантації в організм тварини з депрессіровать імунною системою (γ-опромінення, цитостатики, бусульфан і т.п.). На сьогоднішній день ніхто не почув переконливих доказів реалізації пластичності стовбурових клітин у тварин, що не піддавалися опроміненню або іншим впливам, що викликають глибоку імуносупресію.

В таких умовах небезпечні потенції ЕСК проявляються, в першу чергу, при їх трансплантації в ектопічні області - при підшкірній ін'єкції ЕСК імунодефіцитних мишам в місці введення утворюються тератокарціноми. Крім того, в процесі розвитку ембріона людини частота хромосомних аномалій вище, ніж в ембріогенезі у тварин. На стадії бластоцисти лише 20-25% зародків людини складаються з клітин з нормальним каріотипом, а у переважної більшості ранніх зародків людини, отриманих після запліднення in vitro, виявляється хаотичний хромосомний мозаїцизм і вельми часто зустрічаються числові і структурні аберації.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Сприятливий вплив стовбурових клітин

Попередні результати клінічних випробувань підтверджують сприятливий вплив стовбурових клітин на хворого, проте поки що немає відомостей про віддалені наслідки клітинної трансплантації. У літературі спочатку переважали повідомлення про позитивні результати трансплантації фрагментів мозку ембріонів при хворобі Паркінсона, однак потім почали з'являтися дані, які заперечують ефективну лікувальну дію ембріональної або фетальної нервової тканини, пересадженою в мозок хворих.

В середині XX століття вперше було виявлено відновлення кровотворення у летально опромінених тварин після внутрішньовенної трансфузії клітин кісткового мозку, а в 1969 році американський дослідник D. Thomas виконав першу трансплантацію кісткового мозку людини. Відсутність знань про механізми імунологічної несумісності клітин кісткового мозку донора і реципієнта в той час зумовило високу летальність внаслідок частого непріжівленія трансплантата і розвитку реакції "трансплантат проти господаря". Відкриття головного комплексу гістосумісності, до складу якого входять лейкоцитарні антигени людини (НbА), і вдосконалення методів їх типування дозволило значно збільшити виживаність після трансплантації кісткового мозку, що призвело до широкого поширення цього методу лікування в онкогематології. Через десятиліття були виконані перші трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК), отриманих з периферичної крові за допомогою лейкаферезу. У 1988 році у Франції для лікування дитини з анемією Фанконі в якості джерела ГСК вперше була використана пуповинна кров, а з кінця 2000 року в пресі стали з'являтися повідомлення про здатність ГСК диференціюватися в клітини різних типів тканин, що потенційно розширює сферу їх клінічного застосування. Однак виявилося, що матеріал для трансплантації, поряд з ГСК, містить значну кількість різноманітних за своєю природою і властивостями домішок негемопоетіческіх клітин. У зв'язку з цим розробляються методи очищення трансплантата і критерії оцінки його клітинної чистоти. Зокрема, використовується позитивна іммуноселекція СD34 + -клітин, що дозволяє виділити ГСК за допомогою моноклональних антитіл.

[8], [9], [10], [11], [12]

Ускладнення терапії стовбуровими клітинами

Ускладнення при трансплантації кісткового мозку найчастіше є гематологічними і пов'язані з тривалим періодом ятрогенной панцитопении. Найбільш часто розвиваються інфекційні ускладнення, анемія і геморагії. У зв'язку з цим вкрай важливим є підбір оптимального режиму забору, процесингу і зберігання кісткового мозку для максимального збереження стовбурових клітин, що забезпечить швидке і стабільне відновлення кровотворення. При характеристиці трансплантата в даний час прийнято оцінювати такі параметри: кількість мононуклеарних і / або ядерні клітин, колонієутворюючих одиниць і зміст СБ34-позитивних клітин. На жаль, ці показники дають лише непряму оцінку реальної кровотворної здібності стовбурової клітинної популяції трансплантата. На сьогодні не існує абсолютно точних параметрів визначення достатності трансплантата для довготривалого відновлення гемопоезу у пацієнтів навіть при аутологічної трансплантації кісткового мозку. Розробка загальних критеріїв вкрай утруднена через відсутність жорстких стандартів процесингу, кріоконсервації і тестування трансплантата. Крім того, необхідно враховувати все різноманіття чинників, що впливають на параметри успішного відновлення кровотворення у кожного конкретного хворого. При аутологічної трансплантації кісткового мозку найбільш важливими з них є число попередніх курсів хіміотерапії, особливості режиму кондиціонування, період захворювання, в який зроблений забір кісткового мозку, схеми застосування колониестимулирующих факторів в посттрансплантаційному періоді. До того ж не слід забувати, що передує забору трансплантата хіміотерапія може мати негативний вплив на стовбурові клітини кісткового мозку.

Частота розвитку важких токсичних ускладнень істотно зростає при проведенні алогенних трансплантації кісткового мозку. У зв'язку з цим представляють інтерес статистичні дані по пересадці алогенного кісткового мозку при таласемії. У звітах Європейської групи трансплантації кісткового мозку зареєстровано близько 800 пересадок кісткового мозку пацієнтам з великою таласемією. Алогенна трансплантація при таласемії в переважній більшості випадків виконується від HLA-ідентичних сибсов, що пов'язано з важкими ускладненнями і високою смертністю при трансплантації стволового клітинного матеріалу частково сумісних родинних або сумісних неспоріднених донорів. Для максимального зниження ризику фатальних інфекційних ускладнень пацієнти поміщаються в ізольовані асептичні бокси з ламінарним потоком повітря, отримують низько- або абактеріальним дієту. Для бактеріальної деконтамінації кишечника per os призначають нерезорбціонние форми антибіотиків, протигрибкові препарати. З метою профілактики внутрішньовенно вводять амфотерицин В. Профілактику системних інфекцій закріплюють амікацином і цефтазидимом, які призначають за день до трансплантації, продовжуючи лікування до виписки пацієнтів. Всі препарати крові перед переливанням опромінюються в дозі 30 Гр. Парентеральне харчування при трансплантації є необхідною умовою і починається відразу по обмеженню прийому їжі природним шляхом.

Цілий ряд ускладнень пов'язаний з високою токсичністю імунодепресивних препаратів, які часто викликають нудоту, блювоту і мукозити, пошкодження нирок і інтерстиціальну пневмонію. Одним з найбільш важких ускладнень хіміотерапії є веноокклюзіонная хвороба печінки, що призводить до смерті в ранній посттрансплантаційного період. Серед факторів ризику тромбозу вен портальної системи печінки слід зазначити вік пацієнтів, наявність гепатиту і фіброзу печінки, а також проведення імуносупресивної терапії після трансплантації кісткового мозку. Веноокклюзіонная хвороба особливо небезпечна при таласемії, яка супроводжується гемосидерозом печінки, гепатитом і фіброзом - частими супутниками транс- фузионной терапії. Тромбоз вен портальної системи печінки розвивається через 1-2 тижні після трансплантації і характеризується швидким збільшенням вмісту в крові білірубіну і активності трансаміназ, прогресуванням гепатомегалии, асцитом, енцефалопатією і болями у верхній половині живота. Гістологічно в аутопсійному матеріалі визначаються пошкодження ендотелію, субендотеліальні геморагії, ураження центролобулярних гепатоцитів, тромботична обструкція венул і центральних вен печінки. У хворих таласемією описані випадки фатальною зупинки серця, пов'язаної з токсичним впливом цитостатиків.

У період підготовки до трансплантації циклофосфамід і бусульфан часто викликають токсико-геморагічний цистит з патологічними змінами уроепітеліальних клітин. Застосування циклоспорину А при трансплантації кісткового мозку нерідко супроводжується ефектами нефро- і нейротоксичність, гіпертензійним синдромом, затримкою рідини в організмі і цитолизом гепатоцитів. Порушення статевої і репродуктивної функції частіше спостерігається у жінок. У дітей молодшого віку після трансплантації пубертатне розвиток зазвичай не страждає, але у дітей більш старшого віку патологія розвитку статевої сфери може бути дуже серйозною - аж до стерильності. До ускладнень, безпосередньо пов'язаним з самим трансплантатом, відносяться відторгнення клітин алогенного кісткового мозку, несумісність за системою АВО, гострі і хронічні форми реакції "трансплантат проти господаря".

В організмі пацієнтів після пересадки АВО-несумісного кісткового мозку ізоагглютініни типу "господар проти АВО донора" виробляються протягом 330-605 днів після трансплантації, що може привести до тривалого гемолизу і різко збільшити потребу в гемотрансфузіях. Зазначене ускладнення запобігає переливанням еритроцитів тільки групи 0. Після трансплантації у ряду хворих відзначаються аутоиммунная нейтропенія, тромбоцитопенія або панцитопенія, для корекції яких необхідно проводити спленектомію.

У 35-40% реципієнтів гостра реакція "трансплантат проти господаря" розвивається протягом 100 днів після трансплантації алогенного НЬА-ідентичного кісткового мозку. Ступінь ураження шкіри, печінки і кишечника варіює від висипу, діареї та помірної гіпербілірубінемії до десквамації шкіри, кишкової непрохідності та гострої печінкової недостатності. У хворих таласемією частота гострої реакції "трансплантат проти господаря" I ступеня після трансплантації кісткового мозку становить 75%, II ступеня і вище - 11-53%. Хронічна реакція "трансплантат проти господаря" як системний поліорганний синдром зазвичай розвивається протягом 100-500 днів після трансплантації алогенного кісткового мозку у 30-50% пацієнтів. Уражаються шкіра, порожнину рота, печінку, очі, стравохід і верхні дихальні шляхи. Розрізняють обмежену форму хронічної реакції "трансплантат проти господаря", коли уражається шкіра і / або печінку, і поширену, коли генералізоване ураження шкіри поєднується з хронічним агресивним гепатитом, ураженням очей, слинних залоз або будь-якого іншого органу. Причиною смерті часто стають інфекційні ускладнення, що виникають в результаті важкого імунодефіциту. При таласемії легка форма хронічної реакції "трансплантат проти господаря" зустрічається у 12%, помірна - у 3% і важка - у 0,9% реципієнтів алогенного НLА-сумісного кісткового мозку. Важким ускладненням при пересадці кісткового мозку є відторгнення трансплантата, яке розвивається через 50-130 днів після операції. Частота відторгнення залежить від режиму кондиціонування. Зокрема, у хворих таласемією, які отримували в період підготовки тільки метотрексат, відторгнення трансплантата кісткового мозку спостерігається в 26% випадків, при комбінації метотрексату з циклоспорином А - в 9%, а при призначенні тільки циклоспорину А - в 8% випадків (Газієв і ін ., 1995).

Інфекційні ускладнення після трансплантації кісткового мозку викликають віруси, бактерії і гриби. Їх розвиток пов'язаний з глибокою нейтропенією, яку індукують хіміопрепарати в період кондиціонування, ураженням цитостатиками слизових бар'єрів і реакцією "трансплантат проти господаря". Залежно від часу розвитку, розрізняють три фази інфекційних ускладнень. У першій фазі (розвивається в перший місяць після трансплантації) переважають ушкодження слизових бар'єрів і нейтропенія, часто супроводжуються вірусними інфекціями (герпес, вірус Епштейна-Барр, цитомегаловірус, Varicella zoster), а також інфекціями, викликаними грамположі- тільними і грамнегативними бактеріями, грибами Candida , аспергиллами. У ранньому посттрансплантаційному періоді (другий і третій місяці після трансплантації) найважчою інфекцією є цитомегаловірусна, яка нерідко призводить до смерті хворих у другій фазі інфекційних ускладнень. При таласемії цитомегаловірусна інфекція після трансплантації кісткового мозку розвивається у 1,7-4,4% реципієнтів. Третя фаза спостерігається в пізньому посттрансплантаційному періоді (через три місяці після операції) і характеризується важким комбінованим імунодефіцитом. В цьому періоді зазвичай зустрічаються інфекції, викликані Varicella zoster, стрептококом, пневмоцист Каріні, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, а також гепатотропними вірусами. При таласемії смертність хворих після трансплантації кісткового мозку пов'язана з бактеріальних і грибкових сепсисом, ідіопатичною інтерстиціальної і цитомегаловірусної пневмоніями, гострим респіраторним дистрес-синдромом, гострою серцевою недостатністю, тампонадой серця, крововиливами в мозок, Веноокклюзіонная хворобою печінки і гострою реакцією "трансплантат проти господаря".

В даний час досягнуті певні успіхи в розробці методів виділення з кісткового мозку чистої популяції стовбурових гемопоетичних клітин. Покращена техніка отримання крові плода з пуповини і створені методи виділення з кордової крові кровотворних клітин. У науковій пресі з'являються повідомлення про те, що при культивуванні в середовищах з цитокінами гемопоетичні стовбурові клітини здатні до розмноження. При використанні для експансії ГСК спеціально сконструйованих біореакторів біомаса стовбурових гемопоетичних клітин, виділених з кісткового мозку, периферичної або пуповинної крові, істотно збільшується. Можливість експансії ГСК є важливим кроком на шляху клінічного розвитку клітинної трансплантації.

Однак перед розмноженням ГСК in vitro необхідно виділити гомогенну популяцію кровотворних стовбурних клітин. Зазвичай це досягається за допомогою маркерів, що дозволяють вибірково помітити ГСК моноклональними антитілами, ковалентно зв'язаними з флуоресцентної або магнітної міткою, і виділити їх за допомогою відповідного клітинного сортера. У той же час питання про фенотипических характеристиках гемопоетичних стовбурових клітин остаточно не вирішене. А. Петренко., В. Грищенко (2003) в якості претендентів на ГСК розглядають клітини, на поверхні яких присутні CD34, АС133 і Thyl антигени і відсутні CD38, HLA-DR і інші маркери диференціації (клітини з фенотипом CD34 + Liir). До маркерів лінійної диференціювання (lineage, Lin) відносять гликофорин A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Перспективними для трансплантації вважаються клітини з фенотипом CD34 + CD45RalüW CD71low, а також CD34 + Thyl + CD38low / c-kit / low.

Проблемним залишається питання про кількість ГСК, достатньому для ефективної трансплантації. В даний час джерелом стовбурових кровотворних клітин є кістковий мозок, периферична і кордова кров, а також ембріональна печінка. Експансія стовбурових гемопоетичних клітин досягається шляхом їх культивування в присутності ендотеліоцитів і гемопоетичних факторів росту. У різних протоколах для індукції проліферації ГСК застосовують міелопротеіни, SCF, еритропоетин, інсуліноподібний фактор росту, кортикостероїди і естрогени. При використанні комбінацій цитокінів in vitro можна досягти значного збільшення пулу ГСК з піком їх виходу в кінці другого тижня культивування.

Традиційно ГСК пуповинної крові застосовують в основному при гемобластозах. Однак мінімальна доза гемопоетичних клітин, необхідна для успішної трансплантації клітин кордової крові, становить 3,7 x 10 ⁷ ядерні клітин на 1 кг маси тіла реципієнта. Використання меншої кількості ГСК значно збільшує ризик неспроможності трансплантата і рецидиву захворювання. Тому трансплантацію кровотворних клітин пуповинної крові в основному застосовують в лікуванні гемобластозів у дітей.

На жаль, до сих пір відсутні стандарти заготовки, а також стандартизовані протоколи клінічного застосування гемопоетичних клітин пуповинної крові. Відповідно і самі стовбурові клітини кордової крові не є законодавчо визнаним джерелом кровотворних клітин для трансплантації. Крім того, не існує ні етичних, ні правових норм, що регламентують діяльність і організацію банків пуповинної кровb, які є за кордоном. Тим часом, для безпечної трансплантації всі зразки пуповинної крові повинні піддаватися ретельному контролю. До початку забору крові у вагітної жінки необхідно отримати на це її згоду. Кожна вагітна повинна бути обстежена на носійство HBsAg, наявність антитіл до вірусів гепатиту С, ВІЛ-інфекції та сифілісу. Кожен зразок кордової крові необхідно стандартно тестувати на кількість ядерні клітин, СD34 + і колонієутворюючих здатність. Крім того, проводиться НЬА-типування, визначення групи крові по АВО і її приналежність по резус-фактору. Необхідними процедурами тестування є бактеріологічний посів на стерильність, серологічне дослідження на ВІЛ-1 і ВІЛ-2-інфекції, HBsAg, вірусний гепатит С, цитомегаловирусную інфекцію, НТLY-1 і НТLY-II, сифіліс і токсоплазмоз. Крім цього, для виявлення цитомегаловірусної та ВІЛ-інфекції проводиться полімеразна ланцюгова реакція. Це призводить до необхідності доповнити протоколи тестування аналізом ГСК пуповинної крові на виявлення таких генетичних захворювань, як а-таласемія, серповидно-клітинна анемія, дефіцит аденозіндезамінази, агаммаглобулинемия Брутона, хвороби Харлер і Понтера.

На наступному етапі підготовки до трансплантації постає питання про збереження ГСК. Найбільш небезпечними для життєздатності клітин при їх заготівлі є процедури заморожування і розморожування. При заморожуванні гемопоетичних клітин значна їх частина може руйнуватися через кристаллообразования. Для зменшення відсотка загибелі клітин використовуються спеціальні речовини - кріопротектори. Найчастіше в якості кріопротектори застосовується ДМСО в кінцевій концентрації 10%. Однак для ДМСО в такій концентрації характерно пряме цитотоксичну дію, яка проявляється навіть в умовах мінімальної експозиції. Зниження цитотоксичного ефекту досягається жорстким підтриманням нульової температури режиму експозиції, а також дотриманням регламенту обробки матеріалу в процесі і після розморожування (швидкість проведення всіх маніпуляцій, застосування процедур багаторазового відмивання). Не слід застосовувати концентрацію ДМСО менше 5%, так як при цьому в період заморожування відбувається масова загибель кровотворних клітин.

Наявність домішок еритроцитів в суспензійний суміші ГСК створює небезпеку розвитку реакції несумісності по еритроцитарних антигенів. У той же час при видаленні еритроцитів значно зростають втрати гемопоетичних клітин. У зв'язку з цим запропонована методика нефракціонованого виділення ГСК. В даному випадку для захисту ядерні клітин від шкідливого впливу низьких температур використовують 10% розчин ДМСО і охолодження з постійною швидкістю (ГС / хв) до -80 ° С, після чого клітинну суспензію заморожують в рідкому азоті. Вважається, що при такій методиці кріоконсервації відбувається частковий лізис еритроцитів, тому зразки крові не вимагають фракціонування. Перед трансплантацією клітинну суспензію розморожують, відмивають від вільного гемоглобіну і ДМСО в розчині людського альбуміну або в сироватці крові. Збереження гемопоетичних попередників при використанні даного методу дійсно вище, ніж після фракціонування пуповинної крові, однак небезпека трансфузійних ускладнень внаслідок переливання АВО-несумісних еритроцитів зберігається.

Започаткування системи банків для зберігання тестованих і тіпірованних по HLA зразків ГСК могло б вирішити наведені вище проблеми. Однак для цього потрібно розробити етичні та юридичні норми, які в даний час поки ще тільки обговорюються. Перед створенням банківської мережі необхідно прийняти цілий ряд положень і документів по стандартизації процедур забору, фракціонування, тестування і типування, а також кріоконсервації ГСК. Обов'язковою умовою ефективної діяльності банків ГСК є організація комп'ютерної бази для взаємозв'язку з регістрами Світовий донорської кістковомозковою асоціації (WMDA) і Національної донорської кістковомозковою програми Сполучених Штатів (NMDP).

Крім того, слід оптимізувати і стандартизувати методики експансії ГСК in vitro, в першу чергу гемопоетичних клітин кордової крові. Розмноження ГСК пуповинної крові необхідно для збільшення числа потенційних реципієнтів, сумісних по HLA-системі. Через невеликі обсяги кордової крові кількість містяться в ній ГСК, як правило, не в змозі забезпечити репопуляціі кісткового мозку у дорослих хворих. У той же час для проведення неспоріднених трансплантацій необхідно мати доступ до достатньої кількості тіпірованних зразків ГСК (від 10 000 до 1 500 000 на 1 реципієнта).

Трансплантація стовбурових кровотворних клітин не усуває ускладнень, які супроводжують пересадку кісткового мозку. Аналіз показує, що при трансплантації стовбурових клітин пуповинної крові важкі форми гострої реакції "трансплантат проти господаря" розвиваються у 23%, хронічної - у 25% реципієнтів. У онкогематологічних хворих рецидиви гострого лейкозу протягом першого року після трансплантації ГСК кордової крові спостерігаються в 26% випадків.

В останні роки інтенсивно розвиваються методи трансплантації периферичних гемопоетичних стовбурових клітин. Зміст ГСК в периферичної крові настільки мало (на 100 000 клітин крові припадає 1 ГСК), що їх виділення без спеціальної підготовки не має сенсу. Тому донору попередньо проводять курс медикаментозної стимуляції викиду гемопоетичних клітин кісткового мозку в кров. З цією метою використовуються такі далеко не нешкідливі препарати, як циклофосфамід і гранулоцитарнийколонієстимулюючий фактор. Але навіть після процедури мобілізації ГСК в периферичну кров вміст у ній СD34 + -клітин не перевищує 1,6%.

Для мобілізації ГСК в клініці частіше використовують С-СЕК, який характеризується відносно добре переноситься, за винятком майже закономірного появи болів в кістках. Треба зауважити, що застосування сучасних сепараторів крові дозволяє досить ефективно виділяти стовбурові попередники кровотворення. Однак в умовах нормального гемопоезу для отримання достатньої кількості гемопоетичних стовбурових клітин, порівнянного по репопулятівной здатності СІЛ кістковомозковою суспензії, необхідно виконати як мінімум 6 процедур. При кожній такій процедурі на сепараторі обробляється 10-12 л крові, що може викликати тромбоцитопенію і лейкопенію. Процедура сепарації передбачає введення донору антикоагулянту (натрію цитрат), що не виключає, однак, контактної активації тромбоцитів в процесі екстракорпорального центрифугування. Ці фактори створюють умови для розвитку інфекційних і геморагічних ускладнень. Ще один недолік методу полягає в значній варіабельності мобілізаційного відповіді, що вимагає моніторингу змісту ГСК в периферичної крові донорів, необхідного для визначення їх максимального рівня.

Аутогенне трансплантація ГСК, на відміну від алогенних, повністю виключає розвиток реакції відторгнення. Проте, суттєвим недоліком аутотрансплантации стовбурових гемопоетичних клітин, що обмежує спектр показань до її проведення, є висока ймовірність реінфузії клітин лейкозного клону з трансплантатом. Крім того, відсутність іммуноопосредованних ефекту "трансплантат проти пухлини" значно підвищує частоту рецидивів злоякісного захворювання крові. Тому єдиним радикальним способом елімінації неопластического клонального гемопоезу і відновлення нормального поліклонального кровотворення при мієлодиспластичні синдромах залишається інтенсивна поліхіміотерапія з трансплантацією алогенних ГСК.

Але навіть в цьому випадку лікування при більшості гемобластозов направлено лише на збільшення термінів виживання хворих і поліпшення якості їхнього життя. За даними декількох великих досліджень, тривала безрецидивної виживаність після алотрансплантації ГСК досягається у 40% онкогематологічних хворих. При використанні стовбурових клітин НЬА-сумісного сиблинга кращі результати спостерігаються у молодих хворих з коротким анамнезом захворювання, кількістю бластних клітин до 10% і сприятливою цитогенетикою. На жаль, смертність, пов'язана з процедурою аллотрансплантации ГСК, у пацієнтів з мієлодиспластичний захворюваннями залишається високою (в більшості повідомлень - близько 40%). Результати 10-річної роботи Національної програми донорства кісткового мозку США (510 хворих, медіана віку - 38 років) свідчать, що безрецидивної виживаність протягом двох років становить 29% при відносно низькій ймовірності рецидиву (14%). Однак смертність, обумовлена процедурою аллотрансплантации ГСК від нерідного донора, надзвичайно висока і досягає за дворічний період 54%. Подібні результати отримані і в Європейському дослідженні (118 хворих, медіана віку - 24 роки, дворічна безрецидивної виживаність - 28%, рецидив - 35%, смертність - 58%).

При проведенні інтенсивних курсів хіміотерапії з подальшим відновленням кровотворення алогенними гемопо- етичними клітинами часто виникають іммуногематологіческіх і трансфузійних ускладнень. Багато в чому вони пов'язані з тим, що групи крові у людини успадковуються незалежно від молекул МНС. Тому, навіть якщо донор і реципієнт сумісні з основним НLА-антигенів, їх еритроцити можуть мати різний фенотип. Виділяють "велику" несумісність, коли у реципієнта предсуществуют антитіла до антигенів еритроцитів донора, і "малу", коли у донора є антитіла до антигенів еритроцитів реципієнта. Можливі випадки поєднання "великий" і "малої" несумісності.

Результати порівняльного аналізу клінічної ефективності Алотрансплантація кісткового мозку і стовбурових гемопоетичних клітин пуповинної крові при гемобластозах свідчать про те, що у дітей після алотрансплантації ГСК кордової крові значно знижується ризик розвитку реакції "трансплантат проти господаря", проте спостерігається більш тривалий термін відновлення числа нейтрофілів і тромбоцитів при більш високій частоті 100-денний посттрансплантаційного смертності.

Вивчення причин ранньої летальності дозволило уточнити протипоказання до алогенних трансплантації ГСК, серед яких найважливішими є:

• наявність у реципієнта або донора позитивних тестів на цитомегаловирусную інфекцію (без проведення превентивного лікування);
• гостра променева хвороба;
• наявність або навіть підозра на наявність у пацієнта мікозной інфекції (без проведення системної ранньої профілактики фунгіцидними препаратами);
• гемобластози, при яких хворі отримували тривале лікування цитостатиками (через високу ймовірність раптової зупинки серця і поліорганної недостатності);
• пересадка від HLA-неідентичних донорів (без профілактики гострої реакції "трансплантат проти господаря" циклоспорином А);
• хронічний вірусний гепатит С (у зв'язку з високим ризиком розвитку Веноокклюзіонная хвороби печінки).

Таким чином, трансплантація ГСК здатна викликати серйозні ускладнення, які нерідко призводять до летального результату. У ранньому (до 100 днів після трансплантації) періоді до таких належать інфекційні ускладнення, гостра реакція "трансплантат проти господаря", реакція відторгнення трансплантата (непріжівленіе ГСК донора), веноокклюзіонная хвороба печінки, а також обумовлені токсичністю режиму кондиціонування ураження тканин, для яких характерна висока швидкість ремоделювання (шкіра, судинний ендотелій, епітелій кишечника). До ускладнень пізнього посттрансплантаційного періоду відносяться хронічна реакція "трансплантат проти господаря", рецидиви основного захворювання, затримка росту у дітей, порушення функції репродуктивної системи і щитовидної залози, ураження очей.

Останнім часом, у зв'язку з появою публікацій про пластичності клітин кісткового мозку, виникла ідея використання ГСК для лікування інфарктів та інших хвороб. Хоча деякі досліди на тваринах і свідчать на користь такої можливості, однак висновки про пластичності клітин кісткового мозку потребують підтвердження. Ця обставина має братися до уваги тими дослідниками, які вважають, що трансплантовані клітини кісткового мозку людини легко трансформуються в клітини скелетних м'язів, міокарда або ЦНС. Гіпотеза про те, що ГСК є природним клітинним джерелом регенерації цих органів, потребує серйозних доказах.

Зокрема, опубліковані перші результати відкритого рандомізованого дослідження В. Бєлєнкова (2003), мета якого - вивчення впливу С-СВК (тобто, мобілізації в кров аутологічних ГСК) на клінічний, гемодинамічний і нейрогуморальний статус хворих з помірною та важкою хронічною серцевою недостатністю, а також оцінка його безпеки на тлі стандартної терапії (інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту, бета-адреноблокатори, діуретики, серцеві глікозиди). У першій публікації результатів дослідження автори програми відзначають, що єдиним доказом на користь О-СЗР є результати лікування одного хворого, у якого на тлі терапії цим препаратом встановлено безперечне поліпшення всіх клінічних і гемодинамічних показників. Однак теорія мобілізації ГСК в кровотік з наступною регенерацією міокарда в постінфарктної зоні не підтвердилася - навіть у хворого з позитивною клінічною динамікою стрес-ехокардіографія з добутаміном не виявила появи зон життєздатного міокарда в рубцевої області.

Не можна не відзначити той факт, що на цей момент даних, що дозволяють рекомендувати замісну клітинну терапію для широкого впровадження в повсякденну клінічну практику, явно недостатньо. Необхідні добре продумані і якісно виконані клінічні дослідження, спрямовані на визначення ефективності різних варіантів регенеративної клітинної терапії, розробку показань і протипоказань до неї, а також методичних рекомендацій з комбінованого застосування регенеративно-пластичної терапії та традиційного хірургічного або консервативного лікування. До сих пір не отримано відповіді на питання про те, яка саме популяція клітин кісткового мозку (стовбурові гемопоетичні або стромальні) може давати початок нейронам і кардиомиоцитам, а також не ясно, які саме умови сприяють цьому in vivo.

Робота в цих напрямках проводиться в багатьох країнах. У резюме симпозіуму по гострої печінкової недостатності Національного інституту здоров'я США серед перспективних методів лікування, поряд з трансплантацією печінки, відзначені пересадка ксено або алогенних гепатоцитів і екстракорпоральне підключення біореакторів з клітинами печінки. Є прямі свідчення того, що тільки чужорідні функціонально активні гепатоцити здатні забезпечити ефективну підтримку печінки реципієнта. Для клінічного застосування ізольованих гепатоцитів необхідне створення банку клітин, що дозволить значно скоротити час між виділенням клітин і їх використанням. Найбільш прийнятною для створення банку ізольованих гепатоцитів є криоконсервация клітин печінки в рідкому азоті. При використанні таких клітин в клініці у хворих з гострою та хронічною печінковою недостатністю виявлено досить високий лікувальний ефект.

Незважаючи на оптимістичні і обнадійливі результати застосування трансплантації клітин печінки в експерименті та клініці, залишається чимало проблем, ще далеких від свого рішення. До таких належать обмежена кількість придатних органів для отримання ізольованих гепатоцитів, недостатньо ефективні методи їх виділення, відсутність стандартизованих способів консервації клітин печінки, нечіткі уявлення про механізми регуляції росту і проліферації пересаджених клітин, відсутність адекватних методів оцінки приживлення або відторгнення алогенних гепатоцитів. Сюди ж слід віднести наявність трансплантаційного імунітету при використанні алло-і ксеногенних клітин, хоча і меншого, ніж при ортотопічної трансплантації печінки, але вимагає застосування імуносупресорів, інкапсулювання ізольованих гепатоцитів або їх спеціальної обробки ферментами. Трансплантація гепатоцитів нерідко призводить до імунної конфлікту між реципієнтом і донором у вигляді реакції відторгнення, що вимагає застосування цитостатиків. Одним з рішень цієї проблеми може стати використання полімерних мікропористих носіїв для ізоляції клітин печінки, що поліпшить їх виживання, оскільки мембрана капсули ефективно захищає гепатоцити, незважаючи на імунізацію господаря.

Однак при гострій печінковій недостатності така пересадка гепатоцитів не дає ефекту через досить тривалого часу, необхідного для приживлення клітин печінки в новому середовищі з виходом на етап оптимального функціонування. Потенційним обмеженням є секреція жовчі при ектопічної трансплантації ізольованих гепатоцитів, а при використанні біореакторів істотним фізіологічним бар'єром виступає видове невідповідність між білками людини і білками, які продукують ксеногенні гепатоцити.

У літературі є повідомлення про те, що локальна трансплантація стромальних стовбурових клітин кісткового мозку сприяє ефективній корекції кісткових дефектів, причому відновлення кісткової тканини в цьому випадку протікає більш інтенсивно, ніж при спонтанної репаративної регенерації. У кількох доклінічних дослідженнях на експериментальних моделях переконливо показана можливість застосування трансплантатів стромальних клітин кісткового мозку в ортопедії, хоча для оптимізації цих методик, навіть в найпростіших випадках, необхідна подальша робота. Зокрема, оптимальні умови експансії остеогенних стромальних клітин ex vivo ще не знайдені, чи не відпрацьованими залишаються структура і склад їх ідеального носія (матриці). Не визначено мінімальну кількість клітин, необхідне для об'ємної регенерації кістки.

Доведено, що мезенхімальні стовбурові клітини виявляють трансгермальную пластичність - здатність диференціюватися в клітинні типи, фенотипически не зв'язані з клітинами початкової лінії. За оптимальних умов культивування поліклональні лінії стовбурових клітин строми кісткового мозку витримують in vitro більш 50 поділів, що дає можливість отримати мільярди стромальних клітин з 1 мл кістковомозкового аспирата. Однак популяція мезенхімальних стовбурових клітин відрізняється гетерогенність, що проявляється як варіабельністю розмірів колоній, різною швидкістю їх утворення, так і морфологічним різноманітністю клітинних типів - від фібробластоподібних веретеноподібних до великих плоских клітин. Вже через 3 тижні культивування стромальних стовбурових клітин спостерігається фенотипическая гетерогенність: одні колонії утворюють вузлики кісткової тканини, інші - скупчення адипоцитів, інші, більш рідкісні, формують острівці хрящової тканини.

Для лікування дегенеративних захворювань ЦНС спочатку використовувалася трансплантація ембріональної нервової тканини. В останні роки замість тканини ембріонального мозку стали трансплантувати клітинні елементи нейросфер, отриманих з нейральних стовбурових клітин (.Полтавцева, 2001). Нейросфер містять коммітірованние попередники нейронів і нейроглії - це дає надію на відновлення втрачених функцій мозку після їх трансплантації. Після пересадки клітин диспергованих нейросфер в область смугастого тіла мозку щура відзначені їх проліферація і диференціювання в дофамінергічних нейрони, що усували рухову асиметрію у щурів з експериментальним гемипаркинсонизма. Однак в деяких випадках з клітин нейросфер розвивалися пухлини, що призводило до загибелі тварин (Bjorklund, 2002).

У клініці ретельні дослідження двох груп хворих, в яких ні хворі, ні спостерігали за ними лікарі не знали (подвійне сліпе дослідження), що одній групі пацієнтів трансплантували ембріональну тканину з нейронами, що продукують дофамін, а другій групі хворих робили неправдиву операцію, дали несподівані результати . Пацієнти, яким пересаджували ембріональну нервову тканину, відчували себе не краще, ніж хворі контрольної групи. Крім того, у 5 з 33 пацієнтів через 2 роки після трансплантації ембріональної нервової тканини розвинулася персистентная дискінезія, якої не було у хворих групи контролю (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Однією з невирішених завдань клінічного дослідження нейтральні стовбурових клітин мозку залишається аналіз реальних перспектив і обмежень трансплантації їх похідних для корекції порушень ЦНС. Не виключено, що індукований тривалої судомної активністю нейроногенез в гіпокампі, що приводить до його структурних і функціональних перебудов, може бути фактором прогресуючого розвитку епілепсії. Такий висновок заслуговує на особливу увагу, оскільки вказує на можливі негативні наслідки генерації нових нейронів в зрілому мозку і формування ними абберантних синаптичних зв'язків.

Не слід забувати, що культивування в середовищах з цитокінами (митогенами) наближає характеристики стовбурових клітин до таких у клітин пухлин, оскільки в них відбуваються близькі зміни регуляції клітинних циклів, що визначають здатність до необмеженого поділу. Нерозважливо трансплантувати людині ранні похідні ембріональних стовбурових клітин, так як в цьому випадку загроза розвитку злоякісних новоутворень дуже велика. Значно безпечніше використовувати їх більш коммітірованних потомство, тобто, клітини-попередники диференційованих ліній. Однак в даний час ще не відпрацьована надійна техніка отримання стабільних ліній клітин людини, що диференціюються в потрібному напрямку.

Застосування технологій молекулярної біології для корекції спадкової патології і захворювань людини за допомогою модифікації стовбурових клітин представляє великий інтерес для практичної медицини. Особливості геному стовбурових клітин дають можливість розробки унікальних схем трансплантації з метою корекції генетичних захворювань. Але і в цьому напрямку є ряд обмежень, які потрібно подолати до початку практичного застосування генної інженерії стовбурових клітин. Перш за все необхідно оптимізувати процес модифікації генома стовбурових клітин ex vivo. Відомо, що тривала (3-4 тижні) проліферація стовбурових клітин знижує їх трансфіціруемость, тому для досягнення високого рівня їх генетичної модифікації необхідне проведення декількох циклів трансфіцірованія. Однак основна проблема пов'язана з тривалістю експресії терапевтичного гена. До сих пір ні в одному з досліджень період ефективної експресії після трансплантації модифікованих клітин не перевищував чотирьох місяців. У 100% випадків з плином часу експресія трансфікованих генів знижується через інактивації промоторів і / або загибелі клітин з модифікованим геномом.

Важливою проблемою є вартість застосування клітинних технологій в медицині. Наприклад, орієнтовна щорічна потреба у фінансуванні тільки медичних витрат відділення пересадки кісткового мозку, розрахованого на виконання 50 трансплантацій на рік, становить близько 900 000 доларів США.

Розвиток клітинних технологій в клінічній медицині - складний і багатоетапний процес, який передбачає конструктивну співпрацю багатопрофільних наукових і клінічних центрів та міжнародної спільноти. При цьому особливої уваги потребують питання наукової організації досліджень в галузі клітинної терапії. Найбільш важливими з них є розробка протоколів клінічних досліджень, контроль достовірності клінічних даних, формування національного регістру досліджень, інтеграція в міжнародні програми багатоцентрових клінічних досліджень і впровадження результатів в клінічну практику.

Завершуючи введення в проблеми клітинної трансплантології, хотілося б висловити надію на те, що об'єднання зусиль провідних фахівців України з різних областей науки забезпечить істотний прогрес в експериментальних і клінічних дослідженнях і дозволить в найближчі роки знайти ефективні шляхи надання допомоги тяжкохворим людям, які потребують трансплантації органів , тканин і клітин.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]