Стовбурові клітини і регенеративно-пластична медицина

Сьогодні мало хто з практичних лікарів не знає про розвиток нового напряму в лікуванні важких, раніше силами традиційної і нетрадиційної медицини невиліковних захворювань. Йдеться про регенеративно-пластичної медицині, заснованої на використанні регенераційної потенціалу стовбурових клітин. Навколо розвивається напряму виникла безпрецедентна наукова дискусія і навколонаукова галас, багато в чому створена завдяки інформаційним гіпербол Всесвітньої мережі Internet. За дуже короткий час лабораторні дослідження терапевтичних можливостей стовбурових клітин вийшли за межі експерименту і стали активно впроваджуватися в практичну медицину, що породило масу проблем наукового, етичного, релігійного, юридичного і законодавчого плану. Державні і громадські інституції виявилися явно не готовими до швидкості переходу стовбурових клітин з чашок Петрі в системи для внутрішньовенного введення, що не йде на користь як суспільству в цілому, так і конкретного стражденному людині. У неймовірному за кількістю і якістю обсязі відомостей про можливості стовбурових клітин нелегко розібратися і фахівцям (яких взагалі-то і немає, оскільки кожен намагається освоїти нове віяння науки самостійно), не кажучи вже про лікарів, безпосередньо не займаються регенератівнопластіческой медициною.

[1], [2], [3]

Для чого ж потрібні подібні експерименти і чи потрібні вони взагалі?

На перший погляд, створення клітинних міжвидових химер є плодом нестримної фантазії забув про біоетику вченого-фанатика. Однак саме цей підхід значно розширив наші фундаментальні знання про ембріогенезі, оскільки дозволив провести підрахунок кількості клітин, необхідних для органогенезу (утворення печінки, головного мозку, шкіри, органів імунної системи). Крім того (мабуть, це головне в біології ЕСК), генетики отримали в своє розпорядження унікальний інструмент, за допомогою якого при хімерізаціі зародків можна встановити функціональне призначення генів. Спочатку спеціальною методикою подвійного нокауту в ЕСК "вимикають" досліджувану пару генів. Потім такі ЕСК вводять в бластоцисту і відстежують зміни, що виникають в організмі розвивається химерного зародка. Таким чином були встановлені функції генів sf-1 (розвиток надниркової залози і статевих органів), urt-l (закладка нирки), mуоD (розвиток скелетних м'язів), gata-l-4 (закладка еритро- і лімфопоезу). Крім того, в ЕСК лабораторних тварин можна ввести (трансфекованих) ще не вивчені гени людини для визначення їх функції за допомогою химерного зародка.

Але, як правило, виправдання експерименту отриманням нових фундаментальних знань не зустрічає підтримки у широкої аудиторії. Наведемо приклад прикладного значення хімерізаціі за допомогою ЕСК. В першу чергу, це ксенотрансплантація, тобто, пересадка органів тварини людині. Теоретично створення клітинних химер "людина-свиня" дозволяє отримати тварину, значно ближче за антигенними характеристиками до донору ЕСК, що в різних клінічних ситуаціях (цукровий діабет, цироз печінки) може врятувати життя хворій людині. Правда, для цього потрібно спочатку навчитися повертати властивість тотіпотентності геному зрілої соматичної клітини, після чого її можна буде вводити в розвивається зародок свині.

Сьогодні властивість ЕСК в спеціальних умовах культивування ділитися практично нескінченно використовується для напрацювання тотипотентність клітинної маси з подальшою її диференціацією в спеціалізовані клітини, наприклад дофаминергические нейрони, які потім трансплантують хворому на хворобу Паркінсона. При цьому трансплантації обов'язково передує спрямована диференціювання отриманої клітинної маси в потрібні для лікування спеціалізовані клітини і очищення останніх від недиференційований клітинних елементів.

Як з'ясувалося в подальшому, загроза канцерогенезу була далеко не єдиною перешкодою на шляху клітинної трансплантації. Спонтанно ЕСК в ембріоідних тільцях диференціюються гетерогенно, тобто, утворюють похідні найрізноманітніших клітинних ліній (нейрони, кератиноцити, фібробласти, ендотеліоцити). В поле зору мікроскопа в цьому випадку серед клітин різноманітних фенотипів виділяються кардіоміоцити, кожен з яких скорочується в своєму ритмі. Однак для лікування хворого необхідно мати чисті популяції клітин: нейронів - при інсульті, кардіоміоцитів - при інфаркті міокарда, β-клітин підшлункової залози - при цукровому діабеті, кератиноцитів - при опіках і т.д.

Наступний етап розвитку клітинної трансплантології був пов'язаний з розробкою технологій отримання достатньої кількості (мільйони клітин) таких чистих клітинних популяцій. Пошук факторів, що викликають спрямовану диференціювання ЕСК, носив емпіричний характер, оскільки послідовність їх синтезу в процесі ембріогенезу залишалася невідомою. Спочатку було встановлено, що утворення жовткового мішка індукується додаванням в культуру ЕСК цАМФ і ретиноєвої кислоти. Лінії гемопоетичних клітин утворювалися при наявності в середовищі культивування 1L-3, SCF, фактора росту фібробластів (FGH), інсуліноподібний фактор росту (IGF-1), 1L-6 і гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора (G-СSF). Клітини нервової системи формувалися з ЕСК після видалення LIF і шару фібробластів, що виконує роль фідера. Після обробки ретиноєвої кислотою в присутності ембріональної сироватки ЕСК починали диференціюватися в нейрони, а кардіоміоцити виходили при додаванні диметилсульфоксида (ДМСО), який забезпечує спрямовану доставку гідрофобних сигнальних молекул в клітинне ядро. При цьому накопичення в культуральному середовищі активних форм кисню, а також електрична стимуляція сприяли формуванню зрілих скорочуються кардіоміоцитів.

Величезні сили і засоби були витрачені на пошук умов для диференціювання ЕСК в інсулінпродуцірующіх клітини підшлункової залози. Однак скоро стало ясно, що цілий ряд спеціалізованих ліній клітин β-клітини підшлункової залози, клітини імунної та ендокринної систем, адипоцити) не виникають з ЕСК при їх стимуляції за принципом "один стимулюючий фактор - одна лінія клітин". Цей принцип виявився справедливим тільки для обмеженого числа клітинних ліній. Зокрема, утворення нейронів можна індукувати ретиноєвої кислотою, клітин м'язової лінії - трансформирующим фактором росту-β (ТСР-β), еритроїдних ліній - 1L-6, моноцитарно-мієлоїдної лінії - 1L-3. Причому ефекти цих факторів на диференціювання ЕСК виявилися строго дозозалежними.

Почався етап пошуку комбінацій ростових факторів, які просували б ЕСК на більш пізні етапи ембріогенезу з утворенням мезодерми (джерело кардіоміоцитів, скелетних м'язів, епітелію ниркових канальців, міелоерітропоеза і гладком'язових клітин), ектодерми (епідерміс, нейрони, сітківка) і ентодерми (епітелій тонкого кишечника і секреторних залоз, пневмоцити). Природа як би змушувала дослідників рухатися вперед по шляху ембріогенезу, повторювати його етапи в чашці Петрі, не даючи можливості відразу і легко отримати бажаний результат. І такі комбінації чинників зростання були знайдені. Активін А в комплексі з ТGF-β виявився потужним стимулятором утворення з ЕСК мезодермальних клітин, блокуючи при цьому розвиток енто- і ектодерми. Ретиноєва кислота і а також комбінація сигналів морфогенетичного білка кісткового мозку (ВМР-4) і епідермального фактора росту (EGF) активують процеси утворення клітин екто- і мезодерми, зупиняючи розвиток ентодерми. Інтенсивне зростання клітин всіх трьох зародкових листків спостерігається при одночасному впливі на ЕСК двох факторів - фактора росту гепатоцитів (НGF) і фактора росту нервових клітин.

Таким чином, для отримання потрібних клітинних ліній слід спочатку переводити ембріональні стовбурові клітини на етап утворення клітин будь-якого зародкового листка, а потім підбирати нову комбінацію ростових факторів, здатну індукувати спрямовану диференціювання екто-, мезо- і ендодерми в спеціалізовані клітини, необхідні для трансплантації хворому. Кількість комбінацій ростових факторів на сьогодні обчислюється тисячами, більшість з них запатентовані, деякі взагалі не розголошуються біотехнологічними фірмами.

Настала черга етапу очищення отриманих клітин від недиференційованих клітинних домішок. Диференційовані в культурі клітини метілісь маркерами зрілих клітинних ліній і пропускалися через високошвидкісний лазерний імунофенотипових сортер. Лазерний промінь знаходив їх в загальному клітинному потоці і направляв по окремому шляху. Отриманий очищений клітинний матеріал першими отримали лабораторні тварини. Прийшов час оцінки ефективності застосування похідних ЕСК на моделях хвороб і патологічних процесів. Однією з таких моделей була експериментальна хвороба Паркінсона, яка добре відтворюється на тварин за допомогою хімічних сполук, що руйнують дофаминергические нейрони. Оскільки в основі захворювання у людини лежить набутий дефіцит дофамінергічних нейронів, застосування замісної клітинної терапії в даному випадку було патогенетично виправданим. У тварин з експериментальним гемипаркинсонизма приживалося близько половини дофамінергічних нейронів, отриманих з ЕСК і введених в структури мозку. Цього виявилося достатньо для значного зменшення клінічних проявів захворювання. Цілком успішними виявилися спроби відновлення функції пошкоджених структур ЦНС при експериментальних інсульті, травмах і навіть розривах спинного мозку.

Однак слід звернути увагу на те, що практично всі випадки успішного застосування диференційованих похідних ЕСК для корекції експериментальної патології робилися в гострому періоді моделюється патологічної ситуації. Віддалені результати лікування не були настільки втішні: через 8-16 місяців позитивний ефект клітинної трансплантації зникав або різко зменшувався. Причини цього цілком зрозумілі. Диференціація трансплантованих клітин in vitro або in loco morbi неминуче призводить до експресії клітинних маркерів генетичної чужорідність, що провокує імунну атаку з боку організму реципієнта. Для вирішення проблеми імунологічної несумісності використовувалася традиційна иммуносупрессия, паралельно якій почалися клінічні випробування по реалізації потенціалу трансдіфференціровка і генетичної корекції не викликають імунного конфлікту аутологічних гемопоетичних і мезенхімальних стовбурових клітин.

Що таке регенеративно-пластична медицина?

Еволюція визначила два основні варіанти завершення життя клітини - некроз і апоптоз, яким на тканинному рівні відповідають процеси проліферації і регенерації. Проліферацію можна розглядати як своєрідну жертву, коли заповнення дефекту пошкодженої тканини відбувається за рахунок його заміщення сполучнотканинними елементами: зберігаючи структурну цілісність, організм частково втрачає функцію ураженого органу, що визначає подальший розвиток компенсаторних реакцій з гіпертрофією або гіперплазію структурно-функціональних елементів, залишилося не пошкодженими. Тривалість періоду компенсації залежить від обсягу структурних уражень, викликаних факторами первинної і вторинної альтерації, після чого в переважній більшості випадків настає декомпенсація, різке погіршення якості і скорочення тривалості життя людини. Регенерація фізіологічна забезпечує процеси ремоделювання, тобто, заміну старіючих і тих, хто гине за механізмами природної клітинної смерті (апоптозу) клітин на нові, що відбуваються зі стовбурових клітинних резервів організму людини. У процесах репаративної регенерації також задіяні клітинні ресурси стовбурових просторів, які, однак, мобілізуються в умовах патологічних, пов'язаних із захворюванням чи пошкодженням тканин, що ініціюють загибель клітин за механізмами некрозу.

Пильна увага вчених, лікарів, преси, телебачення і громадськості до проблеми вивчення біології ембріональної стовбурової клітини (ЕСК) обумовлені, перш за все, високими потенційними можливостями клітинної або, як називаємо її ми, регенеративно-пластичної терапії. В основу розробки методів лікування важких захворювань людини (дегенеративна патологія центральної нервової системи, травми спинного і головного мозку, хвороби Альцгеймера і Паркінсона, розсіяний склероз, інфаркт міокарда, артеріальна гіпертензія, цукровий діабет, аутоімунні захворювання і лейкози, опікова хвороба і неопластичні процеси становлять далеко не повний їх список) закладені унікальні властивості стовбурових клітин, що дозволяють створювати нові тканини замість, як раніше вважалося, необоротно пошкоджених тканинних зо н хворого організму.

Прогрес теоретичних досліджень біології стовбурової клітини за останні 10 років реалізувався спонтанно виникають напрямками зароджується регенеративно-пластичної медицини, методологія якої вже не тільки цілком піддається систематизації, а й потребує такої. Першим і найбільш стрімко розвиваються напрямком практичного використання регенеративного потенціалу стовбурових клітин стала замісна регенеративно-пластична терапія. Її шлях досить легко простежується в науковій літературі - від експериментів на тваринах з некрозом міокарда до робіт останніх років, спрямованих на відновлення постинфарктного дефіциту кардіоміоцитів або ж на заповнення втрат β-клітин підшлункової залози і дофамінергічних нейронів ЦНС.

Клітинна трансплантація

Основою замісної регенеративно-пластичної медицини є клітинна трансплантація. Останню слід визначити як комплекс медичних заходів, при якому протягом короткого або тривалого часу організм пацієнта має безпосередній контакт з життєздатними клітинами ауто-, алло, з- або ксеногенного походження. Засобом клітинної трансплантації є суспензія стовбурових клітин або їх похідних, стандартизована за кількістю трансплантаційних одиниць. Трансплантаційна одиниця - відношення кількості колонієутворюючих одиниць в культурі до загальної кількості трансплантуються клітин. Методи проведення клітинної трансплантації: внутрішньовенне, внутрішньочеревне, підшкірне введення суспензії стовбурових клітин або їх похідних; введення суспензії стовбурових клітин або їх похідних в шлуночки мозку, лімфатичні судини або спинномозкову рідину.

При алло-і аутологічної клітинної трансплантації використовуються два принципово різних методологічних підходу до реалізації плюрі-, мульти- або поліпо- тентной потенціалу стовбурових клітин - in vivo або in vitro. У першому випадку введення стовбурових клітин в хворий організм проводиться без їх попередньої диференціювання, у другому - після розмноження в культурі, спрямованої диференціювання і очищення від недиференційованих елементів. Серед численних методичних прийомів замісної клітинної терапії досить чітко виділяються три групи методів: заміщення клітин кісткового мозку і крові, заміщення клітин органів і м'яких тканин, заміщення жорстких і твердих елементів тіла (хрящ, кістку, сухожилля, клапани серця і судини ємнісного типу). Останній напрям слід визначити як реконструктивно-регенеративную медицину, оскільки потенціал диференціації стовбурових клітин реалізується на матриці - біологічно інертною або розсмоктується конструкції, що має форму заміщає ділянки тіла.

Ще одним способом підвищення інтенсивності регенераційно-пластичних процесів в уражених тканинах є мобілізація власних стовбурових ресурсів організму хворого шляхом використання екзогенних ростових факторів, таких як гранулоцитарний і гранулоцитарно-макрофагальний колониестимулирующие чинники. В цьому випадку розрив стромальних зв'язків призводить до збільшення виходу в загальний кровотік гемопоетичних стовбурових клітин, які в зоні пошкодження тканин забезпечують процеси регенерації за рахунок властивою їм пластичності.

Таким чином, методи регенеративної медицини спрямовані на стимуляцію процесів відновлення втраченої функції - або через мобілізацію власних стовбурових резервів хворого організму, або шляхом введення аллогенного клітинного матеріалу.

Важливий практичний результат відкриття ембріональних стовбурових клітин - терапевтичне клонування, засноване на розумінні пускових механізмів ембріогенезу. Якщо початковим сигналом для початку ембріогенезу є комплекс пре-мРНК, що знаходиться в цитоплазмі ооцита, то введення ядра будь-якої соматичної клітини в енуклеірованную яйцеклітину має запустити програму розвитку ембріона. Сьогодні нам вже відомо, що в реалізації програми ембріогенезу беруть участь близько 15 000 генів. Що відбувається з ними потім, після народження, в періодах зростання, зрілості і старіння? Відповідь на це питання дала овечка Доллі: вони зберігаються. З використанням найсучасніших методів дослідження доведено, що ядра клітин дорослого організму зберігають всі коди, необхідні для утворення ембріональних стовбурових клітин, зародкових листків, органогенезу і рестрикционного дозрівання (виходу в диференціювання і спеціалізацію) клітинних ліній мезенхімального, екто-, ендо- і мезодермального походження . Терапевтичне клонування як напрямок сформувався вже на самих ранніх етапах розвитку клітинної трансплантології і передбачає повернення тотіпотентності власним соматичним клітинам хворої людини для отримання генетично ідентичного трансплантаційного матеріалу.

Відкриття стовбурових клітин почалося "з кінця", оскільки термін, введений в біологію і медицину А. Максимовим, ставився до стовбурових клітин кісткового мозку, які дають початок усім зрілим клітинним елементам периферичної крові. Однак у гемопоетичних стовбурових клітин, як і у клітин всіх тканин дорослого організму, теж є свій, менш диференційований попередник. Загальним же джерелом для всіх соматичних клітин є ембріональна стовбурова клітина. Слід зауважити, що поняття "ембріональні стовбурові клітини" і "стовбурові клітини ембріона" аж ніяк не тотожні. Ембріональні стовбурові клітини були виділені Дж. Томсоном з внутрішньої клітинної маси бластоцисти і переведені в довгоживучі клітинні лінії. Тільки ці клітини мають факсиміле "ЕСК". Лерой Стівенс, який відкрив ембріональні стовбурові клітини в експериментах на мишах, назвав їх "ембріональними плюрипотентними стовбуровими клітинами", маючи на увазі здатність ЕСК диференціюватися в похідні всіх трьох зародкових листків (екто-, мезо- і ентодерми). Але при цьому всі клітини ембріона більш пізніх стадій розвитку теж є стовбуровими, оскільки дають початок величезному числу клітин, що формують організм дорослої людини. Для їх визначення ми пропонуємо термін "ембріональні плюрипотентні прогеніторні клітини".

[4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Види стовбурових клітин

В основу сучасної класифікації стовбурових клітин покладено принцип їх поділу за здатністю (потентності) давати початок клітинним лініях, яка визначається як тоті-, плюрі-, мульти-, полі-, бі- і уніпотентность. Тотипотентностью, тобто, була здатна відтворювати запрограмований генетично організм в цілому, мають клітини зиготи, бластомери і ембріональні стовбурові клітини (клітини внутрішньої маси бластоцисти). Ще одна група тотипотентних клітин, які утворюються на більш пізніх термінах розвитку ембріона, представлена первинними герменатівнимі клітинами ембріональної статевої зони (статевих горбків). Плюріпотентность, під якою подімают здатність диференціюватися в клітини будь-якого органу або тканини, властива ембріональних клітин трьох зародкових листків - екто-, мезо- і ентодерми. Вважається, що мультіпотентность, тобто здатність утворювати будь-які клітини в межах однієї спеціалізованої лінії, властива лише двом типам клітин: так званим мезенхімальних стовбурових клітин, які утворюються в нервовому гребені і є попередниками всіх клітин сполучнотканинної основи організму, в тому числі і клітин нейроглії, а також гемопоетичних кровотворних стовбурних клітин, що дає початок всіх лініях клітин крові. Крім того, виділяють бі- і уніпотентние стовбурові клітини, зокрема клітини-попередники мієлоїдного, лімфоїдного, моноцитарного і мегакариоцитарного кровотворних паростків. Існування уніпо- тентних стовбурових клітин чітко доведено на прикладі клітин печінки - втрата значної частини печінкової тканини компенсується за рахунок інтенсивного поділу диференційованих поліплоїдних гепатоцитів.

В процесі розвитку всі органи і тканини формуються в результаті проліферації і диференціації внутрішньої клітинної маси бластоцисти, клітини якої і є, в строгому сенсі, поліпотентними ембріональними стовбуровими клітинами. Перші роботи по виділенню ембріональних стовбурових клітин були виконані Евансом, який демонстрував невідому, що бластоцисти, імплантовані в мозок мишей, дають початок тератокарциномах, клітини яких при клонуванні формують лінії плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин (первинне найменування цих клітин - embryonal carcinoma cells або в абревіатурі ЕСС - в даний час не застосовується). Ці дані були підтверджені в ряді інших досліджень, в яких ембріональні стовбурові клітини отримували при культивуванні клітин бластоцист мишей і тварин інших видів, а також людини.

В літературі останніх років з'являється все більше повідомлень про пластичності стовбурових клітин, яку розглядають не тільки як здатність останніх диференціюватися в різні типи клітин на різних етапах розвитку, а й піддаватися дедіфференціровка (трансдіфференціровка, ретродіфференціровке). Тобто, допускається принципова можливість повернення соматичної диференційованої клітини на етап ембріонального розвитку з рекапітуляцією (поверненням) плюріпотентності і її реалізації в повторну диференціювання з утворенням клітин іншого типу. Повідомляється, зокрема, що гемопоетичні стовбурові клітини здатні трансдіфференціроваться з утворенням гепатоцитів, кардіоміобластов і ендотеліоцитів.

Наукові дебати щодо поділу стовбурових клітин по їх пластичності тривають, тобто, термінологія і глосарій клітинної трансплантації знаходяться в процесі становлення, що має безпосереднє практичне значення, оскільки саме на використанні пластичних властивостей і здатності стовбурових клітин до диференціювання в різні клітинні лінії засновано більшість методів регенератівнопластіческой медицини.

Кількість публікацій в галузі фундаментальних і прикладних проблем регенеративно-пластичної медицини стрімко зростає. Уже окреслено коло різних методичних підходів, спрямованих на найбільш оптимальне використання регенеративно-пластичного потенціалу стовбурових клітин. Зони своїх насущних інтересів визначили кардіологи і ендокринологи, невропатологи і нейрохірурги, трансплантологи і гематологи. У пластичних можливостях стовбурових клітин шукають вирішення наболілих проблем офтальмологи, фтизіатри, пульмонологи, нефрологи, онкологи, генетики, педіатри, гастроентерологи, терапевти і педіатри, хірурги і акушер-гінекологи - всі представники сучасної медицини сподіваються отримати можливість лікування досі вважалися фатальними захворювань.

Чи є клітинна трансплантація черговий "панацеєю" від усіх бід?

Це питання абсолютно справедливо виникає у всіх вдумливих і аналізують сучасний стан медичної науки лікарів і вчених. Ситуація ускладнюється тим, що на одній стороні поля наукового протистояння знаходяться "здорові консерватори", на іншій - "хворі фанатики" клітинної трансплантології. Очевидно, що істина, як завжди, знаходиться між ними - на "нічийній смузі". Чи не торкаючись поки питань права, етики, релігії і моралі, розглянемо плюси і мінуси позначених напрямів регенеративно-пластичної медицини. "Легкий вітерець" перших наукових повідомлень про терапевтичних можливостях ЕСК вже через рік після їх відкриття перетворився в "шквальний вітер", закрутить в 2003 році в "інформаційне торнадо". Перша серія публікацій стосувалася питань культивування ембріональних стовбурових клітин, їх розмноження і спрямованої диференціювання in vitro.

З'ясувалося, що для необмеженого розмноження ембріональних стовбурових клітин в культурі необхідно строго дотримуватися цілий ряд умов. У кондиційної середовищі обов'язково повинні бути присутніми три фактори: інтерлейкін-6 (IL-6), фактор стовбурових клітин (SCF) і лейкозінгібірующій фактор (LIF). Крім того, ембріональні стовбурові клітини повинні вирощуватися на підкладці (фидерном шарі клітин) з ембріональних фібробластів і в присутності фетальної телячої сироватки. При дотриманні цих умов ЕСК в культурі ростуть клонами і утворюють ембріоідние тільця - агрегати суспензійний клонів кулястих клітин. Найважливішою особливістю клону ЕСК є те, що в культурі ембріоідних тільце припиняє зростання при накопиченні в агрегаті 50-60, максимум 100 клітин. У цей період настає рівноважний стан - швидкість ділення клітин всередині клону дорівнює швидкості апоптозу (програмованої клітинної загибелі) на його периферії. Після досягнення такого динамічної рівноваги периферичні клітини ембріоідних тільця піддаються спонтанної диференціювання (зазвичай з утворенням ентодермальних фрагментів жовткового мішка, ангіобласти і ендотеліоцитів) з втратою тотіпотентності. Тому для отримання достатньої кількості тотипотентність клітинної маси ембріональний тільце необхідно дезагреговані щотижня з пересадкою одиничних ембріональних стовбурових клітин на нову живильне середовище - процес досить трудомісткий.

Відкриття ембріональних стовбурових клітин не дало відповіді на питання про те, що саме і як саме запускає програми ембріогенезу, зашифровані в ДНК зиготи. Залишається неясним, як розгортається програма генома в процесі життя людини. Разом з тим, вивчення ембріональних стовбурових клітин дозволило розробити концепцію щодо механізмів збереження тоті-, плюрі- і мультипотентні стовбурових клітин в процесі їх розподілу. Головною відмінною рисою стовбурової клітини є її здатність до самовідтворення. Це означає, що стовбурова клітина, на відміну від диференційованої, ділиться асиметрично: одна з дочірніх клітин дає початок спеціалізованої клітинної лінії, а друга зберігає тоті-, плюрі- або мультіпотентность генома. Залишалося незрозумілим, чому і як цей процес відбувається на самих ранніх стадіях ембріогенезу, коли ділиться внутрішня клітинна маса бла-стоцісти вся є тотипотентність, а геном ЕСК знаходиться в дормантном (сплячому, загальмованому) стані. Якщо при розподілі звичайної клітини процесу дуплікації обов'язково передує активація і експресія цілого комплексу генів, то при розподілі ЕСК цього не відбувається. Відповідь на питання "чому" був отриманий після відкриття в ЕСК предсуществующих мРНК (пре-мРНК), частина яких утворюється ще в фолікулярних клітинах і зберігається в цитоплазмі яйцеклітини і зиготи. Друге відкриття відповіло на питання "як": в ЕСК були виявлені особливі ферменти, що отримали назву "едітази". Едітази виконують три найважливіші функції. По-перше, вони забезпечують альтернативне епігенетичні (без участі генома) зчитування та дуплікацію пре-мРНК. По-друге, реалізують процес активації пре-мРНК (сплайсинг - вирізання інтронів, тобто, неактивних ділянок РНК, які гальмують процес синтезу білка на мРНК), після чого в клітці починається збірка білкових молекул. По-третє, едітази сприяють утворенню вторинних мРНК, що є репресор механізмів генної експресії, що зберігає щільну упаковку хроматину і неактивний стан генів. Білкові продукти, синтезовані на таких вторинних мРНК і отримали назву білків-сайленсери або зберігачів генома, присутні в яйцеклітинах людини.

Саме так на сьогодні видається механізм утворення безсмертних клітинних ліній ембріональних стовбурових клітин. Простіше кажучи, сигнал до запуску програми ембріогенезу, початкові етапи якого полягають в утворенні тотипотентність клітинної маси, надходить з цитоплазми яйцеклітини. Якщо на цьому етапі внутрішня клітинна маса бластоцисти, тобто ЕСК, буде ізольована від подальших регуляторних сигналів, процес самовідтворення клітин відбувається по замкнутому циклу без участі генів клітинного ядра (епігенетичні). Якщо забезпечити таку клітину живильним матеріалом і ізолювати від зовнішніх сигналів, що сприяють диференціювання клітинної маси, вона буде ділитися і відтворювати собі подібних нескінченно.

Перші результати експериментальних спроб використання тотипотентних клітин для трансплантації виявилися досить вражаючими: введення ембріональних стовбурових клітин в тканини мишей з ослабленою іммунодепрессорамі імунною системою в 100% випадків призводило до розвитку пухлин. Серед клітин неоплазми, джерелом якої були ЕСК, зустрічалися диференційовані похідні тотипотентність екзогенного клітинного матеріалу, зокрема нейрони, однак зростання тератокарціном зводив цінність отриманих результатів нанівець. У той же час, в роботах Л. Стівенса, ЕСК, введені в черевну порожнину, формували великі агрегати, в яких фрагментарно утворювалися ембріональні м'язи, серце, волосся, шкіра, кістки, м'язи і нервова тканина. (Хірургам, розкривають дермоїдна кісти, ця картина повинна бути знайома). Цікаво, що суспендовані клітини мишачого ембріобласта поводяться точно так же: їх введення в тканини дорослих іммуноскомпрометірованних тварин завжди викликає утворення тератокарціном. Але якщо з такою пухлини виділити чисту лінію ЕСК і ввести її в черевну порожнину, то знову-таки утворюються спеціалізовані соматичні деривати всіх трьох зародкових листків без ознак канцерогенезу.

Таким чином, наступна проблема, яку необхідно було вирішити, полягала в очищенні клітинного матеріалу від домішок недиференційованих клітин. Однак навіть при дуже високій ефективності спрямованої клітинної диференціювання до 20% клітин в культурі зберігають свій тотипотентність потенціал, який in vivo, на жаль, реалізується в пухлинний ріст. Ще одна "рогатка" природи - на шальках терезів лікарського ризику гарантія одужання хворого балансує з гарантією його смерті.

Взаємовідносини пухлинних клітин і більш просунутих в розвитку, ніж ЕСК, ембріональних плюрипотентних прогеніторних клітин (ЕППК) вельми неоднозначні. Результати наших досліджень показали, що введення ЕППК в різні перещеплюваних пухлини у щурів може призводити до розпаду пухлинної тканини (Г), швидкому збільшенню маси пухлини (Д), її редукції (Е-3) або ж ніяк не впливає на розміри спонтанного центрального осередкового некрозу неопластической тканини (І, К). Очевидно, що результат взаємодії ЕППК і пухлинних клітин визначається загальною сукупністю цитокінів і факторів росту, які продукуються ними in vivo.

Примітно, що ембріональна стовбурова клітина, відповідаючи канцерогенезом на контакт з тканинами дорослого організму, прекрасно асимілюються з клітинної масою ембріона, вбудовуючись в усі органи зародка. Такі химери, що складаються з власних клітин ембріона і донорських ЕСК, отримали назву аллофенних тварин, хоча, по суті, фенотипическими химерами вони не є. Максимальної клітинної хімерізаціі при введенні ЕСК в ранній ембріон піддається кроветворная система, шкіра, нервова тканина, печінка і тонка кишка. Описані випадки хімерізаціі статевих органів. Єдиною недоторканною для ЕСК зоною виявилися первинні статеві клітини.

Тобто, ембріон зберігає генетичну інформацію своїх батьків, що оберігає чистоту і продовження як роду, так і виду.

В умовах блокади ділення клітин раннього ембріона за допомогою цітоклазіна введення ембріональних стовбурових клітин в бластоцисту призводить до розвитку зародка, у якого первинні статеві клітини, як і всі інші, утворилися з донорських ембріональних стовбурових клітин. Але в цьому випадку і сам ембріон повністю є донорським, генетично чужим для організму сурогатної матері. Механізми такого природного блоку потенційної можливості змішування власної і чужорідної спадкової інформації поки не з'ясовані. Можна припустити, що в цьому випадку реалізується програма апоптозу, детермінанти якої нам ще не відомі.

Слід звернути увагу на те, що ембріогенез тварин різних видів ніколи не узгоджується: при реалізації донорської програми органогенезу в організмі зародка-реципієнта ксеногенних ембріональних стовбурових клітин ембріон гине внутрішньоутробно і резорбується. Тому існування химер "щур-миша", "свиня-корова", "людина-щур" потрібно розуміти як клітинний, але не морфологічний мозаицизм. Іншими словами, при введенні ЕСК одного виду ссавців в бластоцисту іншого виду завжди розвивається потомство материнської видової приналежності, у якого серед власних клітин практично всіх органів виявляються включення, а іноді і скупчення структурно-функціональних одиниць, що складаються з генетично чужорідного матеріалу похідних ЕСК. Не можна сприймати термін "гуманізувати ная свиня "як позначення якогось монстра, наділеного розумом або зовнішніми ознаками людини. Це всього лише тварина, частина клітин організму якого відбувається з введених в бластоцисту свині ЕСК людини.

Перспектива застосування стовбурових клітин

Давно відомо, що захворювання, пов'язані з генопатологіей клітин кровотворної та лімфоїдної ліній, нерідко усуваються після алогенної трансплантації кісткового мозку. Заміна власної кровотворної тканини на генетично нормальні клітини родинного донора призводить до часткового, а іноді і повного одужання пацієнта. Серед генетичних захворювань, які лікуються за допомогою алогенної пересадки кісткового мозку, слід зазначити синдром комбінованого імунодефіциту, Х-пов'язану агаммаглобулінемія, хронічний гранулематоз, синдром Віскотта-Олдріча, хвороби Гоше і Харлер, адренолейкодистрофія, метахроматіческая лейкодистрофією, серповидно-клітинну анемію, таласемії, анемію Фанконі і СНІД. Основна проблема у використанні алогенних трансплантації кісткового мозку при лікуванні цих захворювань пов'язана з підбором НbА-сумісного родинного донора, для успішного пошуку якого в середньому необхідно 100 000 зразків тіпірованних донорської гемопоетичних тканини.

Генотерапія дозволяє коригувати генетичний дефект безпосередньо в стовбурових кровотворних клітинах пацієнта. Теоретично генотерапія надає ті ж переваги в лікуванні генетичних захворювань системи кровотворення, що і алогенна трансплантація кісткового мозку, але без усіх можливих імунологічних ускладнень. Однак для цього потрібна техніка, що дозволяє ефективно переносити повноцінний ген в стовбурові кровотворні клітини і підтримувати необхідний рівень його експресії, який за певних видах спадкової патології може бути і не дуже високим. У цьому випадку навіть незначне заповнення білкового продукту дефіцитного гена дає позитивний клінічний ефект. Зокрема, при гемофілії В для відновлення внутрішнього механізму згортання крові цілком достатньо 10-20% нормального рівня фактора IX. Генетична модифікація аутологічного клітинного матеріалу виявилася успішною при експериментальному гемипаркинсонизма (одностороннє руйнування дофамінергічних нейронів). Трансфекція ембріональних фібробластів пацюки ретровірусних вектором, що містить ген тирозингідроксилази, забезпечила синтез дофаміну в ЦНС: интрацеребрально введення трансфекованих фібробластів різко знижувало інтенсивність клінічних проявів експериментальної моделі хвороби Паркінсона у піддослідних тварин.

Перспектива застосування стовбурових клітин для генотерапіі хвороб людини поставила безліч нових завдань перед клініцистами та експериментаторами. Проблемні аспекти генотерапіі пов'язані з розробкою безпечної та ефективної системи транспорту гена в клітину-мішень. На даний момент ефективність переносу генів в клітини великих ссавців дуже мала (1%). Методично ця проблема вирішується різними способами. Перенесення гена in vitro полягає в трансфекції генетичного матеріалу в клітини пацієнта, що знаходяться в культурі, з подальшим поверненням їх в організм хворого. Цей підхід слід визнати оптимальним при використанні генів, введених в стовбурові клітини кісткового мозку, оскільки методи перенесення кровотворних клітин з організму в культуру і назад досить добре відпрацьовані. Найчастіше для перенесення гена в гемопоетичні клітини in vitro використовуються ретрові-руси. Однак основна маса стовбурових кровотворних клітин знаходиться в стані спокою, що ускладнює транспорт генетичної інформації за допомогою ретровірусів і вимагає пошуку нових шляхів ефективного транспорту генів в дормантние стовбурові клітини. В даний час використовуються такі методи переносу генів, як трансфекція, пряма мікроін'єкція ДНК в клітини, ліпофекція, електропорація, "генное рушницю", механічне поєднання за допомогою скляних бус, трансфецірованіе гепатоцитів рецепторзавісімим з'єднанням ДНК з асіалоглікопротеіном, а також аерозольна введення трансгена в клітини альвеолярного епітелію легких. Ефективність перенесення ДНК цими методами складає 10,0-0,01%. Іншими Cлово, в залежності від методу введення генетичної інформації, успіху можна очікувати у 10 хворих з 100 або у 1 хворого з 10 ТОВ пацієнтів. Очевидно, що ефективний і в той же час безпечний метод перенесення терапевтичних генів ще тільки належить розробити.

Принципово іншим рішенням проблеми відторгнення алогенного клітинного матеріалу в клітинної трансплантології є використання високих доз ембріональних плюрипотентних прогеніторних клітин для досягнення ефекту перевстановлення системи контролю антигенного гомеостазу дорослого організму (ефект Кухарчука-Радченка-Сірмана), сутність якого полягає в індукції імунологічної толерантності шляхом створення нової бази імунокомпетентних клітин при одночасному перепрограммировании системи контролю антигенного Гомі стаза. Після введення великих доз ЕППК останні фіксуються в тканинах тимуса і кісткового мозку. В тимусі ЕППК під впливом специфічного мікрооточення диференціюються в дендритні, інтердігітатние клітини і епітеліально-стромальні елементи. В процесі диференціювання ЕППК в тимусі реципієнта, поряд з власними молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС), експресуються молекули МНС, які генетично детерміновані в донорських клітинах, тобто, встановлюється подвійний стандарт молекул МНС, за яким реалізується позитивна і негативна селекція Т-лімфоцитів.

Таким чином, оновлення ефекторних ланки імунної системи організму реципієнта відбувається за відомими механізмам позитивної і негативної селекції Т-лімфоцитів, але через подвійний стандарт молекул МНС - реципієнта і донорських ЕППК.

Перепрограмування імунної системи за допомогою ЕППК не тільки дозволяє проводити клітинну трансплантацію без подальшого тривалого застосування імунодепресантів, а й відкриває абсолютно нові перспективи в лікуванні аутоімунних захворювань, а також дає точку опори для розвитку нових уявлень про процес старіння людини. Для розуміння механізмів старіння нами запропонована теорія виснаження стовбурових просторів організму. Згідно з основним положенням даної теорії, старіння є перманентне скорочення розмірів стовбурових просторів організму, під якими розуміється пул регіонарних ( "дорослих") стовбурових клітин (мезенхімальні, нейрональні, гемопоетичні стовбурові клітини, прогеніторні клітини шкіри, травного тракту, ендокринного епітелію, пігментні клітини циліарних складок і ін.), який заповнює клітинні втрати відповідної тканини в процесі ремоделювання організму. Ремоделювання організму - це оновлення клітинного складу всіх тканин і органів за рахунок клітин стовбурових просторів, яке триває протягом усього життя багатоклітинного організму. Кількість клітин в стовбурових про мандрівних детерміновано генетично, що визначає обмеженість розмірів (пролиферативного потенціалу) кожного стволового простору. У свою чергу, розміри стовбурових просторів визначають швидкість старіння окремих органів, тканин і систем організму. Після виснаження клітинних резервів стовбурових просторів інтенсивність і швидкість старіння багатоклітинного організму визначається механізмами старіння соматичних диференційованих клітин в межах ліміту Хейфліка.

Отже, на етапі постнатального онтогенезу розширення стовбурових просторів може не тільки значно збільшити тривалість, але і поліпшити якість життя за рахунок відновлення потенціалу ремоделювання організму. Досягти розширення стовбурових просторів можна шляхом введення великих доз алогенних ембріональних плюрипотентних прогеніторних клітин за умови одночасного перепрограмування імунної системи реципієнта, що в експерименті істотно збільшує тривалість життя старих мишей. 

Теорія виснаження стовбурових просторів здатна змінити існуючі уявлення не тільки про механізми старіння, а й про хвороби, а також про наслідки її медікамемтозного лікування. Зокрема, хвороба може розвиватися як результат патології клітин стовбурових просторів (онкопатологія). Виснаження резерву мезенхімальних стовбурових клітин порушує процеси ремоделювання сполучної тканини, що призводить до появи зовнішніх ознак старості (зморшки, в'ялість шкіри, целюліт). Виснаження стволового резерву ендотеліальних клітин викликає розвиток артеріальної гіпертензії і атеросклерозу. Спочатку малі розміри стволового простору тимуса визначають його ранню перманентну вікову інволюцію. Передчасне старіння є наслідком початкового патологічного зменшення розмірів всіх стовбурових просторів організму. Медикаментозна і немедикаментозних стимуляція резервів стовбурових клітин підвищує якість життя за рахунок скорочення її тривалості, оскільки зменшує розміри стовбурових просторів. Низька ефективність сучасних геропротекторов обумовлена їх захисним впливом на старіючу диференційовану соматичну клітину, а не на стовбурові простору організму.

На закінчення ще раз відзначимо, що регенеративно-пластична медицина - новий напрямок в лікуванні хвороб людини, засноване на використанні регенеративно-пластичного потенціалу стовбурових клітин. При цьому під пластичністю розуміється здатність екзо або ендогенних стовбурових клітин імплантуватися і давати початок новим спеціалізованим клітинним паросткам в пошкоджених тканинних зонах хворого організму. Об'єкт регенеративно-пластичної медицини - невиліковні до теперішнього часу смертельні захворювання людини, спадкова патологія, хвороби, при яких методами традиційної медицини досягається тільки симптоматичний ефект, а також анатомічні дефекти тіла, на відновлення яких спрямована реконструктівнопластіческая регенеративна хірургія. Перші спроби відтворення цілісних і при цьому функціонально повноцінних органів зі стовбурових клітин, на наш погляд, ще рано виносити в окрему галузь практичної медицини. Суб'єктом регенеративно-пластичної медицини є стовбурові клітини, які мають, в залежності від джерела їх отримання, різний регенеративно-пластичний потенціал. Методологія регенеративно-пластичної медицини заснована на трансплантації стовбурових клітин або їх похідних.