Стовбурові клітини та регенеративно-пластична медицина

Сьогодні мало хто з практикуючих лікарів знає про розвиток нового напрямку в лікуванні найважчих захворювань, раніше невиліковних традиційною та альтернативною медициною. Йдеться про регенеративно-пластичну медицину, засновану на використанні регенеративного потенціалу стовбурових клітин. Навколо напрямку, що розвивається, виникла безпрецедентна наукова дискусія та псевдонауковий ажіотаж, значною мірою створені завдяки інформаційним гіперболам Всесвітньої мережі. За дуже короткий час лабораторні дослідження терапевтичних можливостей стовбурових клітин вийшли за рамки експерименту та почали активно впроваджуватися в практичну медицину, що породило цілу низку проблем наукового, етичного, релігійного, правового та законодавчого характеру. Державні та громадські установи явно виявилися неготовими до швидкості переходу стовбурових клітин з чашок Петрі на системи для внутрішньовенного введення, що не вигідно ні суспільству в цілому, ні конкретній страждаючій людині. Нелегко зрозуміти неймовірну кількість інформації про можливості стовбурових клітин, як за кількістю, так і за якістю, навіть спеціалістам (яких немає, оскільки кожен намагається самостійно опанувати новий науковий напрямок), не кажучи вже про лікарів, які безпосередньо не займаються регенеративною пластичною медициною.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Навіщо потрібні такі експерименти і чи потрібні вони взагалі?

На перший погляд, створення клітинних міжвидових химер – плід нестримної фантазії фанатичного вченого, який забув про біоетику. Однак саме цей підхід значно розширив наші фундаментальні знання про ембріогенез, оскільки дозволив розрахувати кількість клітин, необхідних для органогенезу (формування печінки, мозку, шкіри та органів імунної системи). Крім того (мабуть, це головне в біології ЕСК), генетики отримали у своє розпорядження унікальний інструмент, за допомогою якого можна встановити функціональне призначення генів під час химеризації ембріонів. Спочатку використовується спеціальна техніка подвійного нокауту, щоб «вимкнути» досліджувану пару генів в ЕСК. Потім такі ЕСК вводяться в бластоцисту та контролюються зміни, що відбуваються в тілі хімерного ембріона, що розвивається. Таким чином було встановлено функції генів sf-1 (розвиток надниркової залози та статевих органів), urt-l (зачатки нирок), muoD (розвиток скелетних м'язів), gata-l-4 (зачатки еритропоезу та лімфопоезу). Крім того, гени людини, які ще не вивчалися, можуть бути введені (трансфектовані) в ембріональні стволові клітини лабораторних тварин для визначення їхньої функції за допомогою химерного ембріона.

Але, як правило, обґрунтування експерименту отриманням нових фундаментальних знань не знаходить підтримки у широкої аудиторії. Наведемо приклад прикладного значення химеризації за допомогою ЕСК. Перш за все, це ксенотрансплантація, тобто трансплантація органів тварин людині. Теоретично, створення химер клітин людини та свині дозволяє отримати тварину, яка за антигенними характеристиками набагато ближча до донора ЕСК, що в різних клінічних ситуаціях (цукровий діабет, цироз печінки) може врятувати життя хворій людині. Правда, для цього спочатку потрібно навчитися повертати властивість тотипотентності геному зрілої соматичної клітини, після чого її можна ввести в ембріон свині, що розвивається.

Сьогодні здатність ембріональних стволових клітин (ЕСК) ділитися майже нескінченно за спеціальних умов культивування використовується для отримання тотипотентної клітинної маси з подальшою її диференціацією у спеціалізовані клітини, такі як дофамінергічні нейрони, які потім пересаджують пацієнту з хворобою Паркінсона. У цьому випадку трансплантації обов'язково передує цілеспрямована диференціація отриманої клітинної маси у спеціалізовані клітини, необхідні для лікування та очищення останніх від недиференційованих клітинних елементів.

Як виявилося пізніше, загроза канцерогенезу була далеко не єдиною перешкодою для трансплантації клітин. Спонтанно ЕСК в ембріональних тільцях диференціюються гетерогенно, тобто утворюють похідні найрізноманітніших клітинних ліній (нейронів, кератиноцитів, фібробластів, ендотеліоцитів). У полі зору мікроскопа в цьому випадку серед клітин різних фенотипів виділяються кардіоміоцити, кожен з яких скорочується у своєму ритмі. Однак для лікування пацієнта необхідно мати чисті клітинні популяції: нейрони – при інсульті, кардіоміоцити – при інфаркті міокарда, β-клітини підшлункової залози – при цукровому діабеті, кератиноцити – при опіках тощо.

Наступний етап розвитку клітинної трансплантології був пов'язаний з розробкою технологій отримання достатньої кількості (мільйони клітин) таких чистих клітинних популяцій. Пошук факторів, що викликають спрямовану диференціацію ЕСК, носив емпіричний характер, оскільки послідовність їх синтезу під час ембріогенезу залишалася невідомою. Спочатку було встановлено, що формування жовткового мішка індукується додаванням цАМФ та ретиноєвої кислоти до культури ЕСК. Лінії гемопоетичних клітин формували у присутності 1L-3, SCF, фактора росту фібробластів (FGH), інсуліноподібного фактора росту (IGF-1), 1L-6 та гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора (G-СSF) у культуральному середовищі. Клітини нервової системи формували з ЕСК після видалення LIF та шару фібробластів, який служив годівницею. Після обробки ретиноєвою кислотою у присутності фетальної сироватки ЕСК почали диференціюватися в нейрони, а кардіоміоцити отримували шляхом додавання диметилсульфоксиду (DMSO), який забезпечує цілеспрямовану доставку гідрофобних сигнальних молекул до ядра клітини. У цьому випадку накопичення активних форм кисню в культуральному середовищі, а також електрична стимуляція сприяли утворенню зрілих скоротливих кардіоміоцитів.

Величезні зусилля та ресурси були витрачені на пошук умов для диференціації ЕСК в інсулін-продукуючі клітини підшлункової залози. Однак незабаром стало зрозуміло, що низка спеціалізованих клітинних ліній (β-клітини підшлункової залози, імунні та ендокринні клітини, адипоцити) не виникає з ЕСК при стимуляції за принципом «один стимулюючий фактор - одна клітинна лінія». Цей принцип виявився справедливим лише для обмеженої кількості клітинних ліній. Зокрема, утворення нейронів може бути індуковано ретиноєвою кислотою, лінією м'язових клітин - трансформуючим фактором росту-β (TCP-β), еритроїдними лініями - 1L-6, моноцитарно-мієлоїдною лінією - 1L-3. Причому вплив цих факторів на диференціацію ЕСК виявився суворо дозозалежним.

Розпочався етап пошуку комбінацій факторів росту, які б просували ЕСК до пізніших стадій ембріогенезу з формуванням мезодерми (джерела кардіоміоцитів, скелетних м'язів, епітелію ниркових канальців, мієлоеритропоезу та гладком'язових клітин), ектодерми (епідерміс, нейрони, сітківка) та ентодерми (епітелій тонкої кишки та секреторних залоз, пневмоцити). Природа ніби змушувала дослідників рухатися вперед шляхом ембріогенезу, повторюючи його етапи в чашці Петрі, не даючи можливості одразу та легко отримати бажаний результат. І такі комбінації факторів росту були знайдені. Активін А в поєднанні з TGF-β виявився потужним стимулятором формування мезодермальних клітин з ЕСК, блокуючи при цьому розвиток ентодерми та ектодерми. Ретиноєва кислота та комбінація сигналів морфогенетичного білка кісткового мозку (BMP-4) та епідермального фактора росту (EGF) активують формування екто- та мезодермальних клітин, зупиняючи розвиток ентодерми. Спостерігається інтенсивний ріст клітин усіх трьох зародкових шарів при одночасному впливі на ЕСК двох факторів – фактора росту гепатоцитів (ФРГ) та фактора росту нервових клітин.

Таким чином, для отримання необхідних клітинних ліній необхідно спочатку перевести ембріональні стовбурові клітини до стадії формування клітин деякого зародкового шару, а потім підібрати нову комбінацію факторів росту, здатних індукувати спрямовану диференціацію екто-, мезо- та ентодерми в спеціалізовані клітини, необхідні для трансплантації пацієнту. Кількість комбінацій факторів росту сьогодні обчислюється тисячами, більшість з них запатентовані, деякі взагалі не розкриваються біотехнологічними компаніями.

Настав час очистити отримані клітини від недиференційованих клітинних домішок. Клітини, диференційовані в культурі, мітили маркерами зрілих клітинних ліній та пропускали через високошвидкісний лазерний імунофенотипічний сортувальник. Лазерний промінь знаходив їх у загальному клітинному потоці та спрямував окремим шляхом. Лабораторні тварини першими отримали отриманий очищений клітинний матеріал. Настав час оцінити ефективність використання похідних ЕСК на моделях захворювань та патологічних процесів. Однією з таких моделей була експериментальна хвороба Паркінсона, яка добре відтворюється у тварин за допомогою хімічних сполук, що руйнують дофамінергічні нейрони. Оскільки в основі захворювання у людей лежить набутий дефіцит дофамінергічних нейронів, використання замісної клітинної терапії в цьому випадку було патогенетично виправданим. У тварин з експериментальним геміпаркінсонізмом прижилося близько половини дофамінергічних нейронів, отриманих з ЕСК та введених у структури мозку. Цього було достатньо для значного зменшення клінічних проявів захворювання. Спроби відновити функцію пошкоджених структур ЦНС при експериментальних інсультах, травмах і навіть розривах спинного мозку виявилися досить успішними.

Однак, слід зазначити, що майже всі випадки успішного використання диференційованих похідних ЕСК для корекції експериментальної патології проводилися в гострий період змодельованої патологічної ситуації. Результати віддаленого лікування були не такими втішними: через 8-16 місяців позитивний ефект від трансплантації клітин зникав або різко знижувався. Причини цього цілком зрозумілі. Диференціація трансплантованих клітин in vitro або in loco morbi неминуче призводить до експресії клітинних маркерів генетичної чужорідності, що провокує імунну атаку з боку організму реципієнта. Для вирішення проблеми імунологічної несумісності використовувалася традиційна імуносупресія, паралельно з якою клінічні випробування почали реалізовувати потенціал трансдиференціації та генетичної корекції аутологічних гемопоетичних та мезенхімальних стовбурових клітин, що не викликають імунного конфлікту.

Що таке регенеративна пластична медицина?

Еволюція визначила два основні варіанти завершення життя клітини – некроз та апоптоз, які на тканинному рівні відповідають процесам проліферації та регенерації. Проліферацію можна розглядати як своєрідне жертвопринесення, коли заповнення дефекту пошкодженої тканини відбувається за рахунок її заміни елементами сполучної тканини: при збереженні структурної цілісності організм частково втрачає функцію ураженого органу, що визначає подальший розвиток компенсаторних реакцій з гіпертрофією або гіперплазією структурних та функціональних елементів, що залишаються неушкодженими. Тривалість періоду компенсації залежить від обсягу структурних уражень, спричинених факторами первинної та вторинної альтерації, після чого в переважній більшості випадків настає декомпенсація, різке погіршення якості та скорочення тривалості життя людини. Фізіологічна регенерація забезпечує процеси ремоделювання, тобто заміщення старіючих та вмираючих клітин за механізмами природної клітинної смерті (апоптозу) новими, що походять із резервів стовбурових клітин організму людини. У процесах репаративної регенерації також задіяні клітинні ресурси стовбурових просторів, які, однак, мобілізуються за патологічних умов, пов'язаних із захворюванням або пошкодженням тканин, ініціюючи клітинну смерть через механізми некрозу.

Пильна увага вчених, лікарів, преси, телебачення та громадськості до проблеми вивчення біології ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) зумовлена, перш за все, високим потенціалом клітинної або, як ми її називаємо, регенеративно-пластичної терапії. Розробка методів лікування найважчих захворювань людини (дегенеративна патологія центральної нервової системи, травми спинного та головного мозку, хвороби Альцгеймера та Паркінсона, розсіяний склероз, інфаркт міокарда, артеріальна гіпертензія, цукровий діабет, аутоімунні захворювання та лейкемія, опікова хвороба та неопластичні процеси складають далеко не повний перелік) базується на унікальних властивостях стовбурових клітин, які дозволяють створювати нові тканини для заміщення, як вважалося раніше, незворотно пошкоджених ділянок тканин хворого організму.

Прогрес теоретичних досліджень біології стовбурових клітин за останні 10 років реалізувався спонтанно виникаючими напрямками регенеративно-пластичної медицини, методологія якої не тільки цілком піддається систематизації, а й вимагає її. Першою та найбільш швидко розвиваючою сферою практичного використання регенеративного потенціалу стовбурових клітин стала замісна регенеративно-пластична терапія. Її шлях досить легко простежується в науковій літературі – від експериментів на тваринах з некрозом міокарда до робіт останніх років, спрямованих на відновлення постінфарктного дефіциту кардіоміоцитів або поповнення втрати β-клітин підшлункової залози та дофамінергічних нейронів центральної нервової системи.

Трансплантація клітин

Основою замісної регенеративно-пластичної медицини є клітинна трансплантація. Останню слід визначити як комплекс медичних заходів, під час яких організм пацієнта має безпосередній контакт з життєздатними клітинами ауто-, ало-, ізо- або ксеногенного походження протягом короткого або тривалого періоду часу. Засобом клітинної трансплантації є суспензія стовбурових клітин або їх похідних, стандартизована за кількістю трансплантаційних одиниць. Трансплантаційна одиниця – це відношення кількості колонієутворюючих одиниць у культурі до загальної кількості трансплантованих клітин. Методи клітинної трансплантації: внутрішньовенне, внутрішньоочеревинне, підшкірне введення суспензії стовбурових клітин або їх похідних; введення суспензії стовбурових клітин або їх похідних у шлуночки головного мозку, лімфатичні судини або спинномозкову рідину.

Ало- та аутологічна трансплантація клітин використовують два принципово різні методологічні підходи до реалізації плюрі-, мульти- або поліпотентного потенціалу стовбурових клітин – in vivo або in vitro. У першому випадку введення стовбурових клітин в організм пацієнта здійснюється без їх попередньої диференціації, у другому – після розмноження в культурі, цілеспрямованої диференціації та очищення від недиференційованих елементів. Серед численних методологічних прийомів замісної клітинної терапії досить чітко виділяються три групи методів: заміщення кісткового мозку та клітин крові, заміщення клітин органів та м’яких тканин, заміщення жорстких та твердих елементів організму (хрящів, кісток, сухожиль, клапанів серця та ємнісних судин). Останній напрямок слід визначити як реконструктивну та регенеративну медицину, оскільки потенціал диференціації стовбурових клітин реалізується на матриці – біологічно інертній або розсмоктувальній структурі, що має форму заміщеної ділянки організму.

Іншим способом підвищення інтенсивності регенеративно-пластичних процесів у пошкоджених тканинах є мобілізація власних стовбурових ресурсів пацієнта шляхом використання екзогенних факторів росту, таких як гранулоцитарні та гранулоцитарно-макрофагальні колонієстимулюючі фактори. У цьому випадку розрив стромальних зв'язків призводить до збільшення вивільнення в загальний кровотік гемопоетичних стовбурових клітин, які в зоні пошкодження тканин забезпечують процеси регенерації завдяки притаманній їм пластичності.

Таким чином, методи регенеративної медицини спрямовані на стимуляцію процесів відновлення втраченої функції – або шляхом мобілізації власних стовбурових резервів пацієнта, або шляхом введення алогенного клітинного матеріалу.

Важливим практичним результатом відкриття ембріональних стовбурових клітин є терапевтичне клонування, засноване на розумінні тригерів ембріогенезу. Якщо початковим сигналом для початку ембріогенезу є комплекс пре-мРНК, розташований у цитоплазмі ооцита, то введення ядра будь-якої соматичної клітини в енуклеовану яйцеклітину має запустити програму розвитку ембріона. Сьогодні ми вже знаємо, що близько 15 000 генів беруть участь у реалізації програми ембріогенезу. Що з ними відбувається пізніше, після народження, в періоди росту, дозрівання та старіння? Відповідь на це питання дала вівця Доллі: вони зберігаються. Використовуючи найсучасніші методи дослідження, було доведено, що ядра дорослих клітин зберігають усі коди, необхідні для формування ембріональних стовбурових клітин, зародкових шарів, органогенезу та рестрикційного дозрівання (виходу до диференціації та спеціалізації) клітинних ліній мезенхімального, екто-, ендо- та мезодермального походження. Терапевтичне клонування як напрямок сформувалося вже на найперших етапах розвитку клітинної трансплантології та передбачає повернення тотипотентності власним соматичним клітинам пацієнта для отримання генетично ідентичного трансплантаційного матеріалу.

Відкриття стовбурових клітин почалося «з кінця», оскільки термін, введений у біологію та медицину А. Максимовим, стосувався стовбурових клітин кісткового мозку, які дають початок усім зрілим клітинним елементам периферичної крові. Однак гемопоетичні стовбурові клітини, як і клітини всіх тканин дорослого організму, також мають свого власного, менш диференційованого попередника. Спільним джерелом для абсолютно всіх соматичних клітин є ембріональна стовбурова клітина. Слід зазначити, що поняття «ембріональні стовбурові клітини» та «ембріональні стовбурові клітини» аж ніяк не тотожні. Ембріональні стовбурові клітини були виділені Дж. Томсоном з внутрішньої клітинної маси бластоцисти та перенесені в довгоживучі клітинні лінії. Тільки ці клітини мають факсиміле «ЕСК». Лерой Стівенс, який відкрив ембріональні стовбурові клітини в експериментах на мишах, назвав їх «ембріональними плюрипотентними стовбуровими клітинами», маючи на увазі здатність ЕСК диференціюватися в похідні всіх трьох зародкових шарів (екто-, мезо- та ентодерми). Однак усі клітини ембріона на пізніших стадіях розвитку також є стовбуровими клітинами, оскільки вони дають початок величезній кількості клітин, що формують організм дорослої людини. Для їх визначення ми пропонуємо термін «ембріональні плюрипотентні клітини-попередники».

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Типи стовбурових клітин

Сучасна класифікація стовбурових клітин базується на принципі їх поділу за здатністю (потенцією) давати початок клітинним лініям, яка визначається як тоті-, плюрі-, мульти-, полі-, бі- та уніпотентність. Тотипотентністю, тобто здатністю відтворювати генетично запрограмований організм як єдине ціле, володіють клітини зиготи, бластомери та ембріональні стовбурові клітини (клітини внутрішньої маси бластоцисти). Інша група тотипотентних клітин, які утворюються на пізніших стадіях ембріонального розвитку, представлена первинними зародковими клітинами ембріональної статевої зони (статеві горбки). Плюрипотентність, яка є здатністю диференціюватися в клітини будь-якого органу чи тканини, притаманна ембріональним клітинам трьох зародкових шарів – екто-, мезо- та ентодерми. Вважається, що мультипотентність, тобто здатність утворювати будь-які клітини в межах однієї спеціалізованої лінії, характерна лише для двох типів клітин: так званих мезенхімальних стовбурових клітин, які формуються в нервовому гребені та є попередниками всіх клітин сполучнотканинної основи організму, включаючи клітини нейроглії, а також гемопоетичних гемопоетичних стовбурових клітин, які дають початок усім лініям клітин крові. Крім того, розрізняють бі- та уніпотентні стовбурові клітини, зокрема, клітини-попередники мієлоїдного, лімфоїдного, моноцитарного та мегакаріоцитарного гемопоетичних паростків. Існування уніпотентних стовбурових клітин чітко доведено на прикладі клітин печінки – втрата значної частини тканини печінки компенсується інтенсивним поділом диференційованих поліплоїдних гепатоцитів.

Під час розвитку всі органи та тканини формуються в результаті проліферації та диференціації внутрішньої клітинної маси бластоцисти, клітини якої є, у строгому сенсі, тотипотентними ембріональними стовбуровими клітинами. Першу роботу з виділення ембріональних стовбурових клітин провів Еванс, який показав, що бластоцисти, імплантовані в мозок мишей, дають початок тератокарциномам, клітини яких при клонуванні утворюють лінії плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин (оригінальна назва цих клітин - ембріональні карциномні клітини або в абревіатурі ECС - наразі не використовується). Ці дані були підтверджені в ряді інших досліджень, в яких ембріональні стовбурові клітини отримували шляхом культивування клітин бластоцисти мишей та інших видів тварин, а також людини.

В останні роки в літературі все частіше повідомляється про пластичність стовбурових клітин, яка розглядається не лише як здатність останніх диференціюватися в різні типи клітин на різних стадіях розвитку, а й зазнавати дедиференціації (трансдиференціації, ретродиференціації). Тобто допускається принципова можливість повернення соматично диференційованої клітини до стадії ембріонального розвитку з рекапітуляцією (поверненням) плюрипотентності та її реалізацією в повторній диференціації з утворенням клітин іншого типу. Зокрема, повідомляється, що гемопоетичні стовбурові клітини здатні до трансдиференціації з утворенням гепатоцитів, кардіоміобластів та ендотеліоцитів.

Наукові дискусії щодо поділу стовбурових клітин за їхньою пластичністю тривають, тобто термінологія та глосарій клітинної трансплантації перебувають у процесі формування, що має пряме практичне значення, оскільки більшість методів регенеративної пластичної медицини базуються на використанні пластичних властивостей та здатності стовбурових клітин диференціюватися в різні клітинні лінії.

Кількість публікацій у галузі фундаментальних та прикладних проблем регенеративно-пластичної медицини стрімко зростає. Вже окреслено спектр різних методологічних підходів, спрямованих на найоптимальніше використання регенеративно-пластичного потенціалу стовбурових клітин. Кардіологи та ендокринологи, неврологи та нейрохірурги, трансплантологи та гематологи визначили свої сфери актуального інтересу. Офтальмологи, фтизіатри, пульмонологи, нефрологи, онкологи, генетики, педіатри, гастроентерологи, терапевти та педіатри, хірурги та акушери-гінекологи шукають вирішення актуальних проблем у пластичних можливостях стовбурових клітин – усі представники сучасної медицини сподіваються отримати можливість лікувати хвороби, які раніше вважалися смертельними.

Чи є трансплантація клітин наступним «панацеєю»?

Це питання цілком справедливо виникає у всіх вдумливих лікарів та науковців, які аналізують сучасний стан медичної науки. Ситуація ускладнюється тим, що по один бік поля наукового протистояння знаходяться «здорові консерватори», по інший – «хворі фанатики» клітинної трансплантології. Очевидно, що істина, як завжди, між ними – на «нічиїй землі». Не торкаючись питань права, етики, релігії та моралі, розглянемо плюси та мінуси позначених напрямків регенеративно-пластичної медицини. «Легкий вітерець» перших наукових повідомлень про терапевтичні можливості ембріональних стовбурових клітин перетворився на «шквальний вітер» через рік після їх відкриття, який закружляв у «інформаційний торнадо» у 2003 році. Перша серія публікацій стосувалася питань культивування ембріональних стовбурових клітин, їх розмноження та спрямованої диференціації in vitro.

Виявилося, що для необмеженого розмноження ембріональних стовбурових клітин у культурі необхідно суворо дотримуватися низки умов. У кондиціонованому середовищі повинні бути присутні три фактори: інтерлейкін-6 (IL-6), фактор стовбурових клітин (SCF) та фактор інгібування лейкази (LIF). Крім того, ембріональні стовбурові клітини повинні вирощуватися на субстраті (живильному шарі клітин) ембріональних фібробластів та у присутності фетальної телячої сироватки. Якщо ці умови дотримані, ЕСК у культурі ростуть як клони та утворюють ембріоїдні тільця – агрегати суспензійних клонів сферичних клітин. Найважливішою особливістю клону ЕСК є те, що в культурі ембріоїдне тіло припиняє ріст, коли в агрегаті накопичується 50-60, максимум 100 клітин. Протягом цього періоду настає рівноважний стан – швидкість поділу клітин всередині клону дорівнює швидкості апоптозу (запрограмованої клітинної смерті) на його периферії. Після досягнення такої динамічної рівноваги периферичні клітини ембріоїдного тіла зазнають спонтанної диференціації (зазвичай з утворенням ендодермальних фрагментів жовткового мішка, ангіобластів та ендотеліоцитів) з втратою тотипотентності. Отже, для отримання достатньої кількості тотипотентної клітинної маси ембріоїдне тіло необхідно щотижня дезагрегувати з пересадкою окремих ембріональних стовбурових клітин на нове живильне середовище – досить трудомісткий процес.

Відкриття ембріональних стовбурових клітин не дало відповіді на питання, що саме і як запускає програми ембріогенезу, зашифровані в ДНК зиготи. Залишається незрозумілим, як розгортається програма геному протягом життя людини. Водночас вивчення ембріональних стовбурових клітин дозволило розробити уявлення про механізми підтримки тоті-, плюрі- та мультипотентності стовбурових клітин під час їх поділу. Головною відмінною рисою стовбурової клітини є її здатність до самовідтворення. Це означає, що стовбурова клітина, на відміну від диференційованої клітини, ділиться асиметрично: одна з дочірніх клітин дає початок спеціалізованій клітинній лінії, а друга зберігає тоті-, плюрі- або мультипотентність геному. Залишалося незрозумілим, чому і як цей процес відбувається на найдавніших стадіях ембріогенезу, коли внутрішня клітинна маса бластоцисти, що ділиться, повністю тотіпотентна, а геном ЕСК знаходиться в дрімлячому (сплячому, загальмованому) стані. Якщо під час поділу звичайної клітини процесу дуплікації обов'язково передує активація та експресія цілого комплексу генів, то під час поділу ЕСК цього не відбувається. Відповідь на питання «чому» була отримана після відкриття вже існуючої мРНК (пре-мРНК) в ЕСК, частина яких утворюється у фолікулярних клітинах і зберігається в цитоплазмі яйцеклітини та зиготи. Друге відкриття відповіло на питання «як»: в ЕСК були знайдені спеціальні ферменти, які називаються «едітазами». Едітази виконують три важливі функції. По-перше, вони забезпечують альтернативне епігенетичне (без участі геному) зчитування та дуплікацію пре-мРНК. По-друге, вони реалізують процес активації пре-мРНК (сплайсинг – вирізання інтронів, тобто неактивних ділянок РНК, що пригнічують процес синтезу білка на мРНК), після чого в клітині починається збірка білкових молекул. По-третє, едітази сприяють утворенню вторинних мРНК, які є репресорами механізмів експресії генів, що підтримує щільну упаковку хроматину та неактивний стан генів. Білкові продукти, синтезовані на таких вторинних мРНК і названі білками-сайленсерами або хранителями геному, присутні в яйцеклітинах людини.

Саме так сьогодні представлений механізм формування безсмертних клітинних ліній ембріональних стовбурових клітин. Простіше кажучи, сигнал до запуску програми ембріогенезу, початкові етапи якої складаються з формування тотипотентної клітинної маси, надходить з цитоплазми яйцеклітини. Якщо на цьому етапі внутрішня клітинна маса бластоцисти, тобто ЕСК, ізольована від подальших регуляторних сигналів, процес самовідтворення клітин відбувається в замкнутому циклі без участі генів клітинного ядра (епігенетично). Якщо таку клітину забезпечити поживним матеріалом та ізолювати від зовнішніх сигналів, що сприяють диференціації клітинної маси, вона буде ділитися та відтворювати собі подібні необмежено довго.

Перші результати експериментальних спроб використання тотипотентних клітин для трансплантації були досить вражаючими: введення ембріональних стовбурових клітин у тканини мишей з імунною системою, ослабленою імуносупресантами, призводило до розвитку пухлин у 100% випадків. Серед клітин новоутворення, джерелом яких були ЕСК, були диференційовані похідні тотипотентного екзогенного клітинного матеріалу, зокрема нейрони, але ріст тератокарцином зводив цінність отриманих результатів нанівець. Водночас, у роботах Л. Стівенса ЕСК, введені в черевну порожнину, утворювали великі агрегати, в яких фрагментарно формувалися ембріональні м'язи, серце, волосся, шкіра, кістки, м'язи та нервова тканина. (Хірурги, які розкривали дермоїдні кісти, повинні бути знайомі з цією картиною). Цікаво, що суспендовані ембріобластні клітини мишей поводяться точно так само: їх введення в тканини дорослих тварин з ослабленим імунітетом завжди викликає утворення тератокарцином. Але якщо з такої пухлини виділити чисту лінію ембріональних стволових клітин (ЕСК) та ввести її в черевну порожнину, то знову ж таки утворюються спеціалізовані соматичні похідні всіх трьох зародкових листків без ознак канцерогенезу.

Отже, наступною проблемою, яку потрібно було вирішити, було очищення клітинного матеріалу від домішок недиференційованих клітин. Однак, навіть за дуже високої ефективності цілеспрямованої клітинної диференціації, до 20% клітин у культурі зберігають свій тотипотентний потенціал, який in vivo, на жаль, реалізується при рості пухлини. Ще одна «рогатка» природи – на шкалі медичного ризику гарантія одужання пацієнта балансує з гарантією його смерті.

Зв'язок між пухлинними клітинами та ембріональними плюрипотентними клітинами-попередниками (ЕПК), які є більш просунутими в розвитку, ніж ЕСК, є досить неоднозначним. Результати наших досліджень показали, що введення ЕПК у різні трансплантовані пухлини у щурів може призвести до розпаду пухлинної тканини (G), швидкого збільшення маси пухлини (D), її зменшення (E-3) або не впливає на розмір спонтанного центрального вогнищевого некрозу неопластичної тканини (I, K). Очевидно, що результат взаємодії ЕПК та пухлинних клітин визначається загальним набором цитокінів та факторів росту, що виробляються ними in vivo.

Примітно, що ембріональні стовбурові клітини, реагуючи канцерогенезом на контакт з тканинами дорослого організму, чудово асимілюються з клітинною масою ембріона, інтегруючись у всі органи ембріона. Такі химери, що складаються з власних клітин ембріона та донорських ЕСК, називаються алофеновими тваринами, хоча насправді вони не є фенотипічними химерами. Кровотворна система, шкіра, нервова тканина, печінка та тонкий кишечник зазнають максимальної клітинної химеризації при введенні ЕСК у ранній ембріон. Описано випадки химеризації статевих органів. Єдиною недоторканною для ЕСК зоною є первинні статеві клітини.

Тобто, ембріон зберігає генетичну інформацію своїх батьків, що захищає чистоту та продовження як роду, так і виду.

За умов блокування поділу клітин раннього ембріона за допомогою цитоклазину, введення ембріональних стовбурових клітин у бластоцисту призводить до розвитку ембріона, первинні статеві клітини якого, як і всі інші, були сформовані з донорських ембріональних стовбурових клітин. Але в цьому випадку сам ембріон є повністю донорським, генетично чужим для організму сурогатної матері. Механізми такого природного блокування потенціалу змішування власної та чужорідної спадкової інформації ще не з'ясовані. Можна припустити, що в цьому випадку реалізується програма апоптозу, детермінанти якої нам поки що не відомі.

Слід зазначити, що ембріогенез тварин різних видів ніколи не буває узгодженим: при реалізації донорської програми органогенезу в організмі ембріона-реципієнта ксеногенних ембріональних стовбурових клітин, ембріон гине внутрішньоутробно та резорбується. Тому існування химер «щур-миша», «свиня-корова», «людина-щур» слід розуміти як клітинний, а не морфологічний мозаїцизм. Іншими словами, при введенні ЕСК одного виду ссавців у бластоцисту іншого виду завжди розвивається потомство материнського виду, у якого серед власних клітин майже всіх органів виявляються включення, а іноді й скупчення структурних та функціональних одиниць, що складаються з генетично чужорідного матеріалу похідних ЕСК. Термін «гуманізована свиня» не можна сприймати як позначення якогось монстра, наділеного інтелектом або зовнішніми характеристиками людини. Це просто тварина, частина клітин тіла якої походить від людських ЕСК, введених у бластоцисту свині.

Перспективи використання стовбурових клітин

Давно відомо, що захворювання, пов'язані з генопатологією клітин гемопоетичного та лімфоїдного ряду, часто усуваються після алогенної трансплантації кісткового мозку. Заміна власної гемопоетичної тканини генетично нормальними клітинами від спорідненого донора призводить до часткового, а іноді й повного одужання пацієнта. Серед генетичних захворювань, які лікуються за допомогою алогенної трансплантації кісткового мозку, варто відзначити синдром комбінованого імунодефіциту, Х-зв'язану агаммаглобулінемію, хронічний гранулематоз, синдром Віскотта-Олдріча, хвороби Гоше та Гурлера, адренолейкодистрофію, метахроматичну лейкодистрофію, серповидноклітинну анемію, таласемію, анемію Фанконі та СНІД. Основна проблема використання алогенної трансплантації кісткового мозку в лікуванні цих захворювань пов'язана з підбором HbA-сумісного спорідненого донора, для успішного пошуку якого потрібно в середньому 100 000 зразків типованої донорської гемопоетичної тканини.

Генна терапія дозволяє виправити генетичний дефект безпосередньо в гемопоетичних стовбурових клітинах пацієнта. Теоретично, генна терапія забезпечує ті ж переваги в лікуванні генетичних захворювань кровотворної системи, що й алогенна трансплантація кісткового мозку, але без усіх можливих імунологічних ускладнень. Однак для цього потрібна методика, яка дозволяє ефективно переносити повноцінний ген у гемопоетичні стовбурові клітини та підтримувати необхідний рівень його експресії, який при певних типах спадкової патології може бути не дуже високим. У цьому випадку навіть незначне поповнення білкового продукту дефіцитного гена дає позитивний клінічний ефект. Зокрема, при гемофілії B 10-20% від нормального рівня фактора IX цілком достатньо для відновлення внутрішнього механізму згортання крові. Генетична модифікація аутологічного клітинного матеріалу довела свою успішність при експериментальному геміпаркінсонізмі (одностороннє руйнування дофамінергічних нейронів). Трансфекція фібробластів ембріонів щурів ретровірусним вектором, що містить ген тирозингідроксилази, забезпечила синтез дофаміну в центральній нервовій системі: внутрішньомозкове введення трансфікованих фібробластів різко знизило інтенсивність клінічних проявів експериментальної моделі хвороби Паркінсона у піддослідних тварин.

Перспектива використання стовбурових клітин для генної терапії захворювань людини поставила багато нових викликів перед клініцистами та експериментаторами. Проблемні аспекти генної терапії пов'язані з розробкою безпечної та ефективної системи транспорту генів у клітину-мішень. Наразі ефективність переносу генів у великі клітини ссавців дуже низька (1%). Методично ця проблема вирішується різними способами. Перенос генів in vitro передбачає трансфекцію генетичного матеріалу в клітини пацієнта в культурі з подальшим поверненням їх в організм пацієнта. Такий підхід слід визнати оптимальним при використанні генів, введених у стовбурові клітини кісткового мозку, оскільки методи переносу гемопоетичних клітин з організму в культуру і назад добре відпрацьовані. Ретровіруси найчастіше використовуються для переносу генів у гемопоетичні клітини in vitro. Однак основна частина гемопоетичних стовбурових клітин знаходиться в стані спокою, що ускладнює транспортування генетичної інформації за допомогою ретровірусів і вимагає пошуку нових шляхів ефективного транспорту генів у сплячі стовбурові клітини. Наразі використовуються такі методи переносу генів, як трансфекція, пряма мікроін'єкція ДНК у клітини, ліпофекція, електропорація, «генна гармата», механічне зчеплення за допомогою скляних кульок, трансфекція гепатоцитів з рецептор-залежним зчепленням ДНК з азіалоглікопротеїном та аерозольне введення трансгену в клітини альвеолярного епітелію легень. Ефективність переносу ДНК цими методами становить 10,0-0,01%. Іншими словами, залежно від методу введення генетичної інформації, успіх можна очікувати у 10 пацієнтів зі 100 або у 1 пацієнта з 10 000 пацієнтів. Очевидно, що ефективний і водночас безпечний метод переносу терапевтичних генів ще не розроблений.

Принципово іншим вирішенням проблеми відторгнення алогенного клітинного матеріалу в клітинній трансплантології є використання високих доз ембріональних плюрипотентних клітин-попередників для досягнення ефекту перевстановлення системи контролю антигенного гомеостазу дорослого організму (ефект Кухарчука-Радченка-Сірмана), суть якого полягає в індукції імунологічної толерантності шляхом створення нової бази імунокомпетентних клітин з одночасним перепрограмуванням системи контролю антигенного гомеостазу. Після введення високих доз ЕПК останні фіксуються в тканинах тимуса та кісткового мозку. У тимусі ЕПК під впливом специфічного мікрооточення диференціюються на дендритні, інтердигітальні клітини та епітеліально-стромальні елементи. Під час диференціації ЕПК у тимусі реципієнта поряд із власними молекулами головного комплексу гістосумісності (ГКГ) реципієнта експресуються молекули ГКГ, генетично детерміновані в клітинах донора, тобто встановлюється подвійний стандарт молекул ГКГ, згідно з яким реалізується позитивна та негативна селекція Т-лімфоцитів.

Таким чином, оновлення ефекторної ланки імунної системи реципієнта відбувається через відомі механізми позитивної та негативної селекції Т-лімфоцитів, але через подвійний стандарт молекул MHC – ЕПК реципієнта та донора.

Репрограмування імунної системи за допомогою EPPC не тільки дозволяє проводити трансплантацію клітин без подальшого тривалого застосування імуносупресантів, але й відкриває абсолютно нові перспективи в лікуванні аутоімунних захворювань, а також забезпечує плацдарм для розвитку нових уявлень про процес старіння людини. Для розуміння механізмів старіння нами запропоновано теорію виснаження стовбурових просторів організму. Згідно з основним положенням цієї теорії, старіння – це постійне зменшення розміру стовбурових просторів організму, під яким розуміється пул регіональних («дорослих») стовбурових клітин (мезенхімальних, нейрональних, гемопоетичних стовбурових клітин, клітин-попередників шкіри, травного тракту, ендокринного епітелію, пігментних клітин війкових складок тощо), що поповнюють клітинні втрати відповідної тканини в процесі ремоделювання організму. Ремоделювання організму – це оновлення клітинного складу всіх тканин і органів за рахунок клітин стовбурових просторів, яке триває протягом усього життя багатоклітинного організму. Кількість клітин у стовбурових просторах визначається генетично, що визначає обмежений розмір (проліферативний потенціал) кожного стовбурового простору. У свою чергу, розмір стовбурових просторів визначає швидкість старіння окремих органів, тканин і систем організму. Після виснаження клітинних резервів стовбурових просторів інтенсивність і швидкість старіння багатоклітинного організму визначаються механізмами старіння соматичних диференційованих клітин у межах ліміту Хейфліка.

Отже, на етапі постнатального онтогенезу розширення стовбурових просторів може не тільки значно збільшити тривалість життя, але й покращити якість життя, відновивши потенціал ремоделювання організму. Розширення стовбурових просторів може бути досягнуто шляхом введення великих доз алогенних ембріональних плюрипотентних клітин-попередників за умови одночасного перепрограмування імунної системи реципієнта, що значно збільшує тривалість життя старих мишей в експерименті.

Теорія виснаження стовбурового простору може змінити існуючі уявлення не лише про механізми старіння, але й про саме захворювання, а також наслідки його медикаментозного лікування. Зокрема, захворювання може розвиватися в результаті патології клітин стовбурового простору (онкопатологія). Виснаження резерву мезенхімальних стовбурових клітин порушує процеси ремоделювання сполучної тканини, що призводить до появи зовнішніх ознак старіння (зморшки, в'ялість шкіри, целюліт). Виснаження резерву стовбурових клітин ендотеліальних клітин спричиняє розвиток артеріальної гіпертензії та атеросклерозу. Спочатку малий розмір стовбурового простору тимуса визначає його ранню постійну вікову інволюцію. Передчасне старіння є наслідком початкового патологічного зменшення розмірів усіх стовбурових просторів організму. Медикаментозна та немедикаментозна стимуляція резервів стовбурових клітин покращує якість життя, скорочуючи його тривалість, оскільки зменшує розміри стовбурових просторів. Низька ефективність сучасних геропротекторів зумовлена їх захисною дією на старіючі диференційовані соматичні клітини, а не на стовбурові простори організму.

На завершення, хочемо ще раз зазначити, що регенеративно-пластична медицина – це новий напрямок у лікуванні захворювань людини, заснований на використанні регенеративно-пластичного потенціалу стовбурових клітин. У цьому випадку під пластичністю розуміють здатність екзогенних або ендогенних стовбурових клітин імплантуватися та давати початок новим спеціалізованим клітинним паросткам у пошкоджених ділянках тканин хворого організму. Об'єктом регенеративно-пластичної медицини є смертельні захворювання людини, які наразі є невиліковними, спадкова патологія, захворювання, при яких методи традиційної медицини досягають лише симптоматичного ефекту, а також анатомічні дефекти організму, відновлення яких є метою реконструктивно-пластичної регенеративної хірургії. На нашу думку, ще зарано розглядати перші спроби відтворення цілих та функціонально повноцінних органів зі стовбурових клітин як окрему галузь практичної медицини. Предметом регенеративно-пластичної медицини є стовбурові клітини, які, залежно від джерела їх отримання, мають різний регенеративно-пластичний потенціал. Методологія регенеративної пластичної медицини базується на трансплантації стовбурових клітин або їх похідних.