Ембріональні стовбурові клітини

Відкриття ембріональних стовбурових клітин виникло не випадково, а з'явилося на підготовленому ґрунті наукових досліджень у галузі біології розвитку. Термін «стовбурова клітина» був введений у медицину в 1908 році на конгресі гематологічного товариства в Берліні Олександром Максимовим стосовно гемопоетичних клітин. Задовго до виділення та отримання стабільних ліній плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин, стовбурові терато-(ембріо-карциномні) клітини використовувалися в дослідженнях процесів раннього розвитку, за допомогою яких вивчалися невідомі механізми ембріогенезу, включаючи послідовність експресії ранніх генів та білкових продуктів їхньої активності.

Але чи втрачається тотипотентність геному людини безповоротно в процесі еволюції? Ні, і ембріогенез є тому доказом. Якщо це так, то коли, в принципі, буде реалізовано другий шлях еволюційного розвитку? Ймовірно, коли людина вийде в космос, де умови навколишнього середовища будуть відносно постійними протягом достатньо тривалого часу. Втрату кісткової тканини (демінералізацію кісток у стані невагомості), яка дуже повільно піддається ремоделюванню та регенерації, можна вважати першим кроком у процесі адаптації людини, як виду, до існування в космічних умовах. Однак ціна за другий шлях еволюційного розвитку буде іншою – ціною за повернення тотипотентності та абсолютної пластичності всім клітинам буде стерильність. Отже, в цьому світі «еволюційних хамелеонів» нам доведеться розмножуватися без мейозу, шляхом брунькування. Але ми будемо жити довго. Теломеразне безсмертя – це безсмертя амеби. У багатоклітинному організмі стовбурові клітини є субстратом кількісного та якісного довголіття.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Джерела ембріональних стовбурових клітин

Сьогодні джерелами ембріональних стовбурових клітин для лабораторних досліджень є лінії тератокарциноми миші (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) та тератокарциноми людини (клон NTERA-2, TERA-2, H-9), а також лінії ембріональних стовбурових клітин Trauneon. Однак наявність детального клітинного паспорта із зазначенням імунного фенотипу, результатів хромосомного аналізу, профілів експресії мРНК, експонованих рецепторів та внутрішньоклітинних сигнальних білків не компенсує суттєвих недоліків ліній ембріональних стовбурових клітин тератокарциноми – швидкої втрати тотипотентності та неможливості їх використання в клінічних випробуваннях, тоді як змішана диференціація в культурі дуже ускладнює виділення чистої спеціалізованої лінії з гетерогенної клітинної популяції. Тому джерелом ліній ембріональних стовбурових клітин, створених для клінічних цілей, зазвичай є внутрішня клітинна маса бластоцисти, окремі бластомери ембріонів 8-клітинної стадії, клітини морули пізніших стадій, а також первинні статеві клітини.

Слід зазначити, що клітини тератокарциноми, хоча й мають властивість плюрипотентності, характеризуються значно нижчим плюрипотентним потенціалом порівняно з ембріональними стволовими клітинами (ЕСК). Їх інтеграція з ембріональними клітинами рідко призводить до утворення химер, які, до того ж, ніколи не утворюють гамет з генотипом клітин тератокарциноми. Вважається, що це пов'язано з частим виникненням хромосомних аномалій під час культивування клітин тератокарциноми: втрата Y-хромосоми, різні трисомії, делеції або транслокації.

Спроби виділити лінію ембріонів людини робилися неодноразово, але це завдання не було вирішено, оскільки нормальні людські бластоцисти важкодоступні. Крім того, частота хромосомних аномалій у людей вища, ніж в ембріогенезі тварин. Переважна більшість ранніх ембріонів людини, отриманих після екстракорпорального запліднення, демонструють хаотичний хромосомний мозаїцизм і часто мають числові та структурні аберації. Навіть пізніше, на стадії бластоцисти, лише 20-25% ембріонів людини складаються з клітин з нормальним каріотипом. Використовувати такі ембріони для створення ембріонів було практично неможливо, оскільки зиготи зазвичай культивували до стадії двох- або чотирьох бластомерів, а потім пересаджували в матку. Лише відносно недавно була розроблена надійна методика культивування запліднених людських яйцеклітин до стадії бластоцисти. Впровадження цієї методики в практику екстракорпорального запліднення не тільки збільшило частоту успішних результатів імплантації, але й зробило нормальні бластоцисти більш доступним об'єктом.

Ще одним джерелом плюрипотентних стовбурових клітин є первинні статеві клітини, які, на відміну від більш розвинених популяцій-попередників зародкового епітелію, не мають бета-інтегрину на своїй поверхні, але експресують високу активність лужної фосфатази. Слід зазначити, що популяції стовбурових клітин, що утворилися з первинних статевих клітин, експериментально вивчаються з 1980-х років. У той час була розроблена методика виділення первинних статевих клітин із зачатка гонади ембріона миші. Перші невдалі результати культивування первинних статевих клітин in vitro свідчили про марність цих спроб, оскільки клітини, хоча й виживали, не проліферували та гинули протягом першої доби. Пізніше було встановлено, що первинні статеві клітини миші розмножуються in vitro лише за наявності розчинних та мембранозв'язаних специфічних поліпептидних факторів росту в культуральному середовищі. Результати численних досліджень показали, що для виживання та проліферації первинних статевих клітин необхідна присутність не тільки LIF, але й мембранозв'язаних та розчинних факторів Стіла (SIF) у культуральному середовищі. Ці пептиди продукуються соматичними клітинами ембріонів, гомозиготних за мутацією Steel, і один з них є лігандом протоонкогена cKit.

Первинні статеві клітини ссавців та людини мають екстрагонадне походження та є джерелом клонального розвитку лінії статевих клітин. Джерелом первинної лінії статевих клітин, а також усіх ембріональних тканин та екстраембріональної мезодерми є епібласт (первинна ектодерма) ранніх ембріонів, який має мозаїчну структурну організацію. За допомогою методу мікрохірургічного видалення різних частин раннього ембріона було встановлено зону локалізації в епібласті клону комітованих попередників первинних статевих клітин. За допомогою родаміндексстрану, який використовувався як клітинний маркер, було встановлено, що попередники первинних статевих клітин локалізуються в проксимальній області епібласту, поблизу екстраембріональної ектодерми. Первинна лінія статевих клітин виникає з 45-клітинного клону, виділення якого відбувається на самому початку гаструляції. Потім клон сегрегує, і під час гаструляції первинні статеві клітини потрапляють у позаембріональну мезодерму та знаходяться біля основи зачатка алантоїса, позаду первинної смужки. Звідти первинні статеві клітини мігрують до вентральної частини ентодерми задньої кишки, а потім активно рухаються вздовж брижі, заселяючи статеві гребені в кінці міграції. Під час міграції, а також у перші 2-3 дні локалізації в зачатку гонади, первинні статеві клітини активно проліферують та проходять вісім реплікативних циклів. Якщо на початку міграції є близько 50 первинних статевих клітин, то в статевих гребенях ембріонів миші дванадцяти днів розвитку кількість первинних статевих клітин перевищує 25 000.

Функціональна подібність ембріональних стволових клітин (ЕСК) та первинних статевих клітин підтверджується повною інтеграцією останніх у бластоцисту із заміщенням внутрішньої клітинної маси та подальшим повноцінним розвитком ембріона, тканини якого складаються лише з нащадків первинних статевих клітин. За іншими властивостями первинні статеві клітини мишей також виявилися ідентичними ЕСК, демонструючи здатність диференціюватися в різних напрямках, формувати ембріоїдні тіла in vitro та формувати тератоми in vivo при підшкірному введенні імунодефіцитним мишам, що нагадує спонтанні тестикулярні тератоми у мишей 129/ter.

Було виявлено, що при додаванні до середовища LIF, мембранозв'язаного та розчинного SIF, ізольовані первинні статеві клітини 8-денних ембріонів миші виживають та розмножуються в культурі протягом 4 днів, але потім гинуть. Більше того, період, коли в культурі спостерігається загибель первинних статевих клітин, збігається зі стадією розвитку ембріонів миші (12,5-13,5 днів), коли жіночі первинні статеві клітини вступають у мейоз у зачатках гонад, а в чоловічих первинних статевих клітинах блокуються мітотичні поділки. Однак, якщо до середовища додають не тільки фактори росту LIF та SIF, але й FGF2, первинні статеві клітини продовжують проліферувати, а в субкультурах утворюються колонії клітин, здатних до розмноження навіть після видалення факторів росту (SIF та FGF) із середовища. Такі клітини можна культивувати протягом тривалого часу на субстраті з ембріональних фібробластів без додавання розчинного фактора росту LIF. Було запропоновано назвати ці стабільні клітинні лінії, отримані з первинних статевих клітин, ембріональними статевими клітинами. Цей термін зовсім не вдалий, оскільки при культивуванні ЕГ-клітин неможливо отримати ембріональні статеві клітини, здатні виконувати наступні стадії оогенезу або сперматогенезу. Це пов'язано з тим, що лінії ЕГ-клітин, хоча й походять від первинних статевих клітин, але, набуваючи властивостей ембріональних плюрипотентних стовбурових клітин у культурі, втрачають здатність до зв'язування з статевими лініями. Іншими словами, первинні статеві клітини при культивуванні втрачають властивості попередників гамет і трансформуються в ЕСК-подібні плюрипотентні клітини.

Було зазначено, що тератоми не виникають, коли EG-клітини вводять імунодефіцитним мишам. Вважається, що втрата здатності людських EG-клітин давати початок тератомам пов'язана з тим, що ці лінії не були створені безпосередньо з культивованих первинних статевих клітин, а були отримані з клітин, виділених з ембріоїдних тілець. Тому можливо, що вони є нащадками плюрипотентних, але вже коммітованих клітин.

Слід зазначити, що існують принципові відмінності між ЕГ-клітинами та первісними статевими клітинами. Останні не дозволяють отримати химерні ембріони миші, що свідчить про відсутність здатності первісних статевих клітин інтегруватися у внутрішню клітинну масу або трофектодерму. Характеристики популяції первісних статевих клітин більше схожі на комітовані лінії соматичних клітин пізніших ембріонів, введення яких у бластоцисту також не призводить до утворення химерних ембріонів.

Модифікація методики культивування ембріоїдних тілець, отриманих шляхом агрегації ЕГ-клітин, дозволила отримати ще одну популяцію плюрипотентних клітин, що отримали назву "клітини, похідні від ембріоїдних тілець" (EBD-клітини), використовуючи селекцію на селективних середовищах. Здатність EBD-клітин до проліферації в культурі протягом тривалого часу дозволила створити стабільні клітинні лінії коммітованих клітин. Були отримані клони клітин, що експресують широкий спектр мРНК та білкових маркерів спеціалізованих клітин. Такий підхід зрештою довів, що первинні статеві клітини людини є плюрипотентними та диференціюються in vitro на різні типи клітин: нейрони, нейроглію, судинний ендотелій, гемопоетичні клітини, м'язові та ендодермальні клітини.

Альтернативні джерела ембріональних стовбурових клітин

Альтернативним джерелом ліній ембріональних стволових клітин людини можуть бути гібридні клітини. Імплантація в матку псевдовагітних корів гетерогенної конструкції, отриманої шляхом злиття електропорацією соматичних клітин людського плода з коров'ячою яйцеклітиною, з якої попередньо видалено пронуклеус, дозволяє отримати внутрішню клітинну масу зі штучного ембріона передімплантаційних стадій розвитку. Для цього на першому етапі з коров'ячої яйцеклітини отримують бластоцисту з пересадженим ядром людської клітини.

На другому етапі з бластоцисти виділяють ембріобласт, а з нього методом Томсона виділяють ЕСК. Примітно, що найкращі результати виділення ліній ЕСК цим методом були отримані з використанням ядер фолікулярних клітин або первинних статевих клітин, які залишаються в організмі людини в стані гібернації. Це пов'язано з тим, що ядра клітин людини, пересаджених у коров'ячу яйцеклітину, повинні мати невкорочені теломери та високу теломеазну активність, що допомагає уникнути передчасного старіння клонів ЕСК, отриманих з гібридної яйцеклітини (Рєпін, 2001). Відомо, що найважливішими внутрішньоклітинними маркерними білками ЕСК є Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, які належать до так званих білків-глушників хроматину. Сайленсери забезпечують особливо компактну упаковку гетерохроматину, що запобігає утворенню еухроматинових петель. Упаковка хроматину, опосередкована цими білками, корелює з тотипотентністю геному ЕСК. На сьогодні встановлено, що зрілі ооцити великої рогатої худоби та людини є єдиним типом спеціалізованих клітин, які містять високі концентрації білків-сайленсерів у цитоплазмі. На цій основі було розроблено метод отримання гібридних ЕСК шляхом перенесення ядер соматичних клітин в енуклейовані ооцити великої рогатої худоби. Попередні дослідження in vitro показали, що цитоплазма ооцитів великої рогатої худоби відновлює тотипотентність геному ядер соматичних клітин людини після 12-24 годин культивування.

Особливий інтерес викликають дані про особливості преімплантаційного розвитку ембріонів людини, що свідчать про пізнішу заміну тотипотентних клітин популяцією плюрипотентних клітин, ніж у мишей. Дослідження клітинних трансформацій показало, що клітини трофобласту також виникають з клітин внутрішньої клітинної маси бластоцист людини, окрім ембріональних стволових клітин (ЕМС), що вказує на їхню загальну потенцію.

Відомо, що на стадії бластоцисти виникають дві різнокоммітовані клітинні популяції. Одна з них утворює зовнішній шар бластоцисти – трофектодерму, похідними якої є клітини трофобласта та інші ембріональні компоненти плаценти. Друга популяція клітин групується в щільну масу, що контактує з внутрішньою поверхнею трофектодерми. Похідними популяції клітин внутрішньої клітинної маси є всі тканини та зачатки органів ембріона. На стадії пізньої бластоцисти з внутрішньої клітинної маси формується позаембріональна ентодерма та формується епібласт (первинна ектодерма). У цьому випадку клітини епібласту зберігають плюрипотентність, тоді як здатність до диференціації клітин позаембріональної ентодерми обмежена.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Отримання ембріональних стовбурових клітин людини

Донедавна вважалося, що отримати ембріональні стволові клітини (ЕСК) з трофобласта неможливо. Однак лінія диплоїдних стовбурових клітин трофектодерми, виділених з бластоцисти, проліферує та трансформується у стовбурові клітини в середовищі, що містить FGF2 та гепарин замість LIF. Якщо FGF2 видалити із середовища, клітини трофектодерми припиняють розмножуватися, у них починається ендоредуплікація хромосом, і клітинні елементи трофектодерми поступово трансформуються в гігантські клітини трофобласта. Ймовірно, LIF не стимулює проліферацію клітин трофектодерми через те, що FGF2 запускає інший механізм транс-сигналізації, оскільки FGF2, зв'язуючись з плазматичним рецептором (FGFR2), активує MAP-кінази в цитоплазмі - ERK1 та ERK2. Отже, коли в клітинах бластоцисти вмикається один сигнальний шлях (LIF - gpl30 - JAK-кіназа - STAT3), клітини внутрішньої клітинної маси трансформуються в плюрипотентні ембріональні стволові клітини (ESC), а коли активується другий механізм трансмембранної передачі сигналу (FGF2 - FGFR2 - MAP-кіназа ERK1/ERK2), у бластоцисті формуються стовбурові клітини трофектодерми. Вибір сигнального шляху, у свою чергу, залежить від активності гена oct4. Цей ген, що належить до домену POU, розташований у t-локусі аутосоми 17 та експресується під час оогенезу, у період дроблення, а також у клітинах внутрішньої клітинної маси бластоцисти та в первинних статевих клітинах. Функціональна роль гена oct4 полягає в кодуванні транскрипційного фактора, необхідного для виникнення плюрипотентних клітин, їх диференціації та дедиференціації.

Експресія гена oct4 в ембріональних стволових клітинах (ЕСК) змінюється залежно від взаємодії цього транскрипційного фактора з кофакторами. Спрямована регуляція експресії oct4 у бластоцистах показала, що при зниженні його активності половина клітин утворює трофектодерму, тоді як при збільшенні індукованої експресії oct4 виникають переважно ЕСК.

В експерименті ЕСК не можуть бути перенесені в лінію під час культивування тотипотентних бластомерів на стадії дроблення, а також на стадії гаструляції та пізніших стадіях ембріонального розвитку. ЕСК мишей зазвичай виділяють на 3,5-4,5-й день вагітності, що відповідає шостій (одношарова бластоциста) та сьомій стадіям (двошарова бластоциста - ранній яйцеподібний циліндр) нормального ембріогенезу. Очевидно, що лише в передімплантаційний період ембріони мишей містять клітинні популяції, здатні трансформуватися в ЕСК. Отже, виділення ліній ЕСК можливе лише на певних стадіях ембріогенезу. Зигота та бластомери, що виникають під час дроблення, є тотипотентними з точки зору можливості розвитку життєздатного ембріона з ембріональними оболонками та плацентою. Втрата загальної потенції статевих клітин починається на пізній стадії морули, коли подальша комітація бластомерів залежить від їх розташування. Ранні бластомери морули зберігають тотипотентність, оскільки експериментальні маніпуляції зі змінами їх локалізації, такі як інверсія їх розташування, не перешкоджають розвитку повноцінного ембріона.

Встановлено, що на ефективність виділення ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) у лінію впливає стан бластоцист на момент їх експлантації. Використання бластоцист після моделювання семиденної діапаузи в репродуктивному тракті мишей, яким видалили яєчники на 3,5-й день вагітності та вводили прогестерон, сприяє більш успішному виділенню ліній ембріональних стовбурових клітин. Вважається, що за таких умов кількість бластомерів, що формують внутрішню клітинну масу, збільшується. Також можливо, що клітинний цикл подовжується, і більшість бластомерів переходять у фазу G0.

Крім того, створення стабільних плюрипотентних ліній ЕСК залежить від генотипу ембріонів: ЕСК досить легко виділяються з бластоцист лінії мишей 129, їх набагато складніше отримати за допомогою мишей CS7BL/6, і практично неможливо виділити лінію ЕСК з бластоцист мишей CBA/Ca. Очевидно, що ранні ембріони мають деякі генетичні особливості, які впливають на розвиток плюрипотентної лінії ЕСК. Тим не менш, при культивуванні ізольованих епібластів, а також шляхом селективного відбору клітин, що диференціюються, лінії ЕСК все ж були виділені з ранніх ембріонів мишей CBA/Ca.

Перевірена стандартна методика отримання ліній ЕСК з бластоцист наведена в лабораторних посібниках з методики експериментів з ранніми ембріонами. Експериментальні лінії ЕСК також можна отримати шляхом культивування ізольованого епібласту (первинної ектодерми) 4,5-денних ембріонів мишей з використанням досить складної мікрохірургічної техніки та модифікованих умов культивування. Трудомісткість цієї процедури виправдана, оскільки частота формування ліній ЕСК у цьому випадку виявилася значно вищою, ніж у роботах з внутрішньою клітинною масою бластоцисти.

Для виділення ліній ЕСК кожен клон переносять у мікролунку, вирощують агрегат із 40-60 клітин, а потім знову диспергують. Багаторазове повторення цієї процедури дозволяє отримати імморталізовану лінію ЕСК з максимальною швидкістю проліферації нормокаріотипних клітин, прикріплених до пластику, які зберігають тотипотентність та високу теломеразну активність після 50-100 пасажувань. У процесі підтримки ліній ЕСК найбільшу небезпеку становить забруднення середовища або сироватки бактеріальними ендотоксинами – навіть слідові концентрації ендотоксину в культуральному середовищі викликають масову загибель незрілих статевих клітин. За ретельного контролю лінійного росту та своєчасного диспергування ЕСК у культурі здатні до симетричного поділу, при якому обидві дочірні клітини залишаються плюрипотентними та здатні виконувати необмежену кількість клітинних циклів, зберігаючи диплоїдний каріотип та загальну потенцію.

Відбір чистої популяції ЕСК людини можна здійснити після трансфекції їх геному рекомбінантними молекулами ДНК, що містять ген, що кодує синтез зеленого флуоресцентного білка (GFP). Експресія GFP зростає, коли ЕСК вирощуються в умовах, що сприяють їх проліферації, тоді як з початком диференціації рівень експресії цього гена знижується, що дозволяє відбирати чисті стабільні плюрипотентні клітинні лінії на селективному середовищі. При культивуванні ЕСК, виділених за допомогою селекції GFP, частота утворення колоній багаторазово зростає, оскільки потужний антипроліферативний ефект диференційованих клітин усувається в умовах селекційних культур.

Трансляцію ембріональних стовбурових клітин людини в лінію здійснюють методом їх виділення з преімплантаційних ембріонів (на стадії 80-120 клітин), що залишаються після процедури екстракорпорального запліднення. Для цього штучно отримані «зайві» ембріони механічно диспергують у середовищі Дельбекко-Ігла. Після мічення клітин селективними моноклональними антитілами з флуоресцентною міткою виділяють клітини ембріобласту. Ембріобласт диспергують на окремі клітини за допомогою суміші диспази-колагенази. Дисоційовані клітини вирощують у спеціальному середовищі (80% середовища Дельбекко + 20% фетальної телячої сироватки у присутності 500 мкг/мл IL-6, LIF та SCF) над живильним моношаром ембріональних фібробластів перших 3 пасажів. У цьому випадку виживання та проліферація стовбурових та прогеніторних клітин підтримується завдяки впливу IL-6, LIF та SCF. У такому середовищі ЕСК ростуть як суспензійні клони неприкріплених згустків клітин, які необхідно дисоціювати м'яким, багаторазовим піпетуванням. Нові клони з'являються у суспендованій культурі на 5-7-й день. Максимальна швидкість росту ЕСК досягається шляхом багаторазової дисоціації клонів на стадії 10-15 клітин. Потім кожен клон переносять у мікролунку та вирощують до скупчення 40-50 клітин. Процедуру повторюють багато разів у пасажах, збільшуючи об'єм культури до щільності 5-10 мільйонів клітин на 6-сантиметрову чашку. Використовуючи таке пасажування, Томсон виділив 10 безсмертних клонів людських ЕСК, які після 100 пасажів зберегли високу теломеразну активність, здатність до енергійного розмноження, мінімальні фенотипічні характеристики та загальну потенцію зі здатністю диференціюватися в будь-яку з 350 спеціалізованих клітинних ліній, що походять від екто-, мезо- та ентодерми. Диференціація людських ембріональних стволових клітин (ЕСК) почалася (після зміни середовища, додавання сироватки та видалення LIF) з прикріплення клітин до субстрату, що свідчить про розвиток цитоскелету та експресію рецепторів адгезії. Важливо, що при необмеженій проліферації людські ембріональні стволові клітини зберігали нормальний каріотип.

Другий метод виділення ліній ембріональних стволових клітин людини базується на використанні первинних статевих клітин. Експериментальні дослідження показали, що лінії Е-клітин можна отримати зі статевих складок 12,5-денних ембріонів мишей. Однак у цих випадках частота утворення ліній клітин-попередників була значно нижчою, ніж в експериментах з більш ранніми ембріонами. Водночас первинні статеві клітини з гонад ембріонів мишей 13,5-денного гестаційного віку взагалі не здатні трансформуватися в лінії.

Перші стабільні лінії плюрипотентних клітин ЕГ людини були отримані з первинних гоноцитів, виділених з гонад 5-9-тижневих ембріонів. Ізольовані клітини культивували на субстраті з інактивованих фібробластів ембріонів миші в середовищі DMEM з фетальною сироваткою, доповненою меркаптоетанолом, форсколіном та рекомбінантними факторами росту людини (FGF та LIF). Через 7-12 днів у культурі з'являлися багатоклітинні колонії, що за морфологічними ознаками та молекулярними маркерами відповідають клітинам ЕГ людини. Після агрегації ці клітини утворювали ембріоїдні тільця, з подальшим розвитком яких з'являлися спеціалізовані клітини, характерні для похідних усіх трьох зародкових шарів. Протягом 10-20 пасажувань лінії клітин ЕГ зберігали нормальний каріотип і не втрачали плюрипотентності.

Також було показано, що спільна дія LIF, мембранозв'язаних та розчинних факторів Стіла, а також TGF-β змінює програму розвитку первинних статевих клітин. Замість того, щоб припинити мітотичні поділки та почати диференціацію в бік оогенезу або сперматогенезу, первинні статеві клітини продовжують проліферувати. Після кількох додаткових мітотичних циклів вони стають подібними до клітин епібласту та, втрачаючи властивості попередників статевих клітин, трансформуються в плюрипотентні ембріональні стовбурові EG-клітини.

Так, у 1998 році з тканини аутопсії плода людини вперше було виділено імморталізовані лінії первинних статевих клітин. В ембріогенезі людини первинні статеві клітини з'являються в жовтковому мішку на 3-му тижні розвитку, а на 4-5-му тижні ці клітини мігрують до зони статевого горбка, де утворюють сплячі популяції первинних гоноцитів. У неактивному стані первинні статеві клітини зберігаються в ембріоні до народження. Лінії первинних статевих клітин виділяють з статевого горбка плода 5-9-тижневих ембріонів, вилучену тканину яких ex tempore обробляють сумішшю колагеназ IV-V типів, гіалуронідази та ДНКази для збільшення кількісного та якісного виходу клітин. Первинні статеві клітини в тканині статевого горбка плода оточені стромальними (мезенхімальними) клітинами Сертолі. Функціональне призначення клітин Сертолі полягає у виробленні антиапоптотичних факторів (Fas-ліганд), мітогенів та імуносупресантів, що захищають статеві клітини від імунної атаки організму. Крім того, стромальний мікрооточення статевого горбка відіграє важливу роль у дозріванні гамет. Ізольовані первинні статеві клітини висаджують у культуру поверх живлячого стромного шару, що складається з фетальних фібробластів перших трьох пасажів. Найбільш ефективною комбінацією мітогенів є комплекс, що складається з LIF, FGF та форсколіну (стимулятор утворення цАМФ). Проліферація первинних статевих клітин in vitro вимагає додавання фетальної сироватки, у присутності якої розмноження первинних гоноцитів у культурі супроводжується утворенням клонів сферичних клітин, не прикріплених до субстрату.

У Національних інститутах охорони здоров'я США на основі узагальнення існуючих даних про методи виділення ліній ЕСК людини з бластоцист було зроблено попередній висновок, що успішне виділення ЕСК найбільш ймовірне при культивуванні бластоцист з добре сформованою внутрішньою клітинною масою (Стовбурові клітини: науковий прогрес та напрямки майбутніх досліджень. Національний інститут охорони здоров'я США). З цієї точки зору, оптимальним джерелом ЕСК для створення ліній є людські бластоцисти на 5-й день розвитку, з яких при виділенні внутрішньої клітинної маси слід обережно видалити трофектодерму. Ізольовану внутрішню клітинну масу, що складається на цій стадії з 30-35 клітин, слід культивувати на субстраті з ембріональних фібробластів миші, що є вирішальною умовою для формування колоній ЕСК у культурі.

Аналіз фенотипових особливостей ембріональних стовбурових клітин

Особливий інтерес представляє міжвидовий порівняльний аналіз фенотипових особливостей ЕСК. Було виявлено, що колонії ЕСК людини являють собою щільні скупчення сплющених, епітеліоподібних клітин, тоді як ембріональні тіла мишей складаються з пухкого конгломерату округлих клітин. У ЕСК людини індекс ядерно-плазмового співвідношення нижчий, ніж у ЕСК мишей. Ембріональні стовбурові клітини мавп утворюють більш плоскі колонії клітин з нерівними краями. Окремі клітини легко помітні в ранніх клонах ЕСК приматів. Проліферуючі ЕСК усіх досліджених видів тварин не експресують молекули MHC класу I та II. Водночас ЕСК людини дають позитивну реакцію на антитіла TERA 1-60 та GCTM-2, що вказує на наявність на їхній поверхні протеогліканів кератин/хондроїтинсульфат, характерних для стовбурових клітин ембріо-(терато)-карциноми. Експресія гена oct4 в ЕСК усіх видів тварин свідчить про те, що, незважаючи на фенотипічні відмінності, в ЕСК людини та миші, очевидно, активується один і той самий набір генів, відповідальних за підтримку плюрипотентності (Peru, 2001). Крім того, лінії ЕСК, виділені з ембріонів щурів, свиней, кроликів, приматів та великої рогатої худоби, мають подібні морфологічні характеристики, подібний набір молекулярних ідентифікаційних маркерів та майже ідентичний молекулярний механізм реалізації програм ембріогенезу, що дозволяє по-новому поглянути на проблему ксенотрансплантації.

На відміну від нормального ембріогенезу in vivo, проліферація ЕСК in vitro не супроводжується формуванням зародкових листків і відбувається на тлі блокування гомеотичних Hox-генів, тобто без органогенезу. Оскільки гени сегментації не функціонують, неможливо відтворити такі періоди ембріогенезу, як закладка сомітів, сегментація ембріона, формування жовткового мішка, алантоїсу та інших провізорних органів і тканин у культурі ЕСК. Культивовані ЕСК ніби завмерли на початку процесу формування 350 рестрикційних ліній спеціалізованих клітин. Таким чином, клон дочірніх клітин-попередників та центрально локалізована ЕСК являють собою лише модель ембріона, під час розвитку якого одночасно формуються різні лінії спеціалізованих клітин у різних тканинних ділянках, які, однак, походять від спільних попередників. Незважаючи на мінімальний рівень рецепторів на поверхні ЕСК, вони зберігають здатність здійснювати примітивні морфогенетичні процеси, імітуючи об'ємні структури раннього ембріона: суспензія ЕСК у культурі агрегується та утворює структури, що нагадують бластоцисти або навіть пізніші ембріони (яйцеві циліндри). Такі суспензійні агрегати називаються відповідно простими та складними ембріоїдними тільцями.

При змішаній диференціації ранні гени ектодерми (oct3, fgf-5, nodal), ентодерми (gata-4), мезодерми (brachyury), кардіогенної мезодерми (pkh-2.5), нервової трубки (msx3) та гемопоезу (elkf) одночасно експресуються в різних клітинах одного ембріоїдного тіла. Використовуючи різні комбінації факторів росту та цитокінів для цілеспрямованої дії на формування клітин зародкового шару in vitro, у ряді випадків вдалося отримати ембріоїдні тіла, в яких переважно експресувалися гени ектодерми або мезодерми, що відкриває шлях до моделювання гаструляції та початкових фаз органогенезу.

Клональний ріст ЕСК є свідченням асиметричного поділу клітин, при якому лише одна ЕСК у центрі клону зберігає необмежений потенціал проліферації, тоді як друга дочірня клітина генерує покоління клітин-попередників, які вже зазнають диференціації. Тому швидкість проліферації клонів на периферії ембріоїдного тіла вища, ніж у центрі. Крайові клітини зростаючого клону зазнають спонтанної невпорядкованої диференціації, мігрують або гинуть за допомогою апоптотичних механізмів. Ці події визначають долю клону: якщо швидкість проліферації перевищує швидкість міграції та апоптотичної загибелі клітин, клон продовжує збільшуватися в розмірах, стабілізація відбувається, коли швидкість апоптозу та швидкість утворення нових клітин рівні, а регресія відбувається, коли співвідношення цих процесів обернене. Клітини-попередники діляться симетрично, тобто обидві дочірні клітини згодом диференціюються в зрілі спеціалізовані клітинні лінії. Співвідношення ЕСК до клітин-попередників варіюється, але кількість ЕСК завжди становить лише частку відсотка від популяції клітин-попередників. Тому лише ретельне піпетування та своєчасна дезагрегація клонів можуть збільшити кількість ЕСК у культурі. Дезагрегація клонів на стадії 10-12 клітин виявилася найефективнішою для отримання максимального виходу ембріональних стволових клітин (ЕСК). Напрямок та ступінь диференціації клітин в ембріональному тілі залежать від їхнього розташування. Зовнішні клітини ембріонального тіла не експресують ген oct4 та диференціюються в клітини первинної ентодерми, з яких згодом формуються епітеліоподібні клітини парієтальної та вісцеральної екстраембріональної ентодерми. Внутрішні клітини ембріонального тіла експресують ген oct4 та зберігають плюрипотентність протягом 48 годин культивування. Однак потім культура морфологічно перебудовується в епітеліальний моношар та починається експресія генів, що контролюють розвиток первинної ектодерми. Далі починається процес тотальної невпорядкованої цитодиференціації з появою різних типів клітин, що є похідними всіх трьох зародкових шарів. У процесі спонтанної диференціації клітин ембріонального тіла першими з'являються агрегати з маркерами ентодерми у вигляді фрагментів (цист) жовткового мішка. Потім у цих структурах з'являються ангіобласти та ендотеліальні клітини капілярів, що ростуть. На завершальних стадіях спонтанної диференціації з внутрішніх клітин ембріоїдного тіла розвиваються різні термінально диференційовані клітини, включаючи нейрони, гліальні елементи, кардіоміоцити, макрофаги та еритроцити. Певною мірою (враховуючи просторову інверсію формування шарів зародкової тканини), використовуючи ембріоїдні тільця, можна вивчати морфогенетичні процеси in vitro та аналізувати молекулярні механізми початкових періодів ембріональної цитодиференціації,а також встановити роль конкретних генів у здійсненні цих процесів.

Таким чином, у межах клону є клітини, в яких виявлено різні програми генетичного розвитку – ЕСК, ранні прогенітори та диференціюючі популяції прогеніторів. Культивування ЕСК методом висячої краплі або масового культивування без шару-годівниці та без додавання LIF до середовища неминуче призводить до утворення ембріоїдних тілець. Морфологія клітин зовнішнього та внутрішнього шарів ембріоїдних тілець відрізняється. Зовнішній шар складається з великих, розгалужених клітин. Їх поверхня, звернена до навколишнього середовища, покрита численними мікроворсинками. Зовнішній шар клітин відділений від внутрішнього шару базальною мембраною, що нагадує мембрану Райхерта, тоді як клітини внутрішнього шару ембріоїдних тілець являють собою циліндричний епітелій. Морфологічно внутрішній шар, хоча й містить багато клітин, що діляться, більше нагадує недиференційовані колонії ЕСК.

Характеристики ембріональних стовбурових клітин людини

Відсутність паренхіматозно-мезенхімальних сигнальних взаємодій на тлі блокування генів гомеозису призводить до порушення росту ЕСК у культурі, оскільки це порушує формування та розвиток інфраструктури провізорних органів. Неорганізований ріст та порушення спонтанної диференціації ЕСК у культурі зумовлені відсутністю мезенхімального маркування стромального каркасу майбутніх органів: in vitro цілком можливо сформувати мільйони гепатоцитів, але неможливо отримати єдину часточку печінки, яка включає такі структурні та функціональні елементи, як синуси, простори Діссе та клітини Купфера.

Вважається, що плюрипотентність ЕСК реалізується виключно в ембріогенезі з формуванням тканин та органів ембріона, тоді як плацента та пуповина є похідними трофобласта. ЕСК, укладені в трофектодермальну мембрану, послідовно генерують клони провізорних клітин, що реалізують програму розвитку через комбінаторну мРНК об'ємної топографічної матриці Нохтейова, які зумовлюють просторове розташування, форму та розміри, кількість клітин провізорних та дефінітивних органів, а також складання паренхіми в структурні та функціональні одиниці. Водночас ЕСК залишаються єдиним типом клітин, у яких молекулярний механізм реалізації їхніх потенцій повністю відключений від генетичної програми розвитку, а самі ЕСК позбавлені можливості взаємодіяти з іншими клітинами через блокування як рецепторних сприйняттів, так і транссигнальних систем. Однак адекватна активація ЕСК призводить до поетапного розвитку програми ембріогенезу, що завершується народженням повністю сформованого організму, що складається з мільярдів клітин, готових до позаутробного життя. На цьому короткостроковому, але неймовірно довгостроковому шляху в клітинному просторі неминуче виникають помилки як у молекулярних механізмах, що забезпечують життєдіяльність клітин, так і в програмах, що контролюють їх проліферацію, диференціацію та спеціалізацію. Тому в сучасній фармакогеноміці захворювання молекулярної структури та захворювання клітинного програмування розглядаються окремо. Більше того, дія більшості нових препаратів спрямована на корекцію програм диференціації, проліферації та органогенезу, а також регенерацію органів і тканин. У дорослому організмі ЕСК дозволяють контролювати поведінку стовбурових/прогениторних клітин, трансплантованих у мозок, печінку, селезінку, кістковий мозок та інші органи людини, для відновлення пошкодженої паренхіми органів реципієнта шляхом диференціації та спеціалізації донорських клітин на збереженому мезенхімальному матриксі. По суті, програма тотипотентності починає реалізовуватися на рівні геномів ооцита, зиготи та бластомера; однак ці клітини ще не клоновані та не пасажовані в кількостях, необхідних для потреб експериментальної та практичної медицини. Таким чином, ембріональні стволові клітини (ЕСК) залишаються унікальним джерелом генетичної інформації, що містить коди для тривимірної карти ембріона та коди для лінійної рестрикції спеціалізованих клітинних ліній під час гаструляції.

Практично безмежний регенеративний потенціал ЕСК зумовлений тим, що їхній геном, на відміну від генетичного апарату диференційованих соматичних клітин, зберігає плюрипотентність. Одним із проявів сплячого стану генетичної інформації, закладеної в ЕСК, є так званий мінімальний фенотип – на поверхні ЕСК експресується обмежена кількість рецепторів, і, відповідно, розгортається дуже мало транссигнальних програм для взаємодії ядерного апарату клітини з її мікрооточенням. На тлі гібернації генів, відповідальних за рестрикцію спеціалізованих клітинних ліній та диференціацію клітин, активуються лише близько 30 з 500 генів, продукти яких забезпечують зв'язок клітини з навколишнім мікрооточенням. За допомогою методу серійного аналізу експресії генів було показано, що при спільній роботі основних функціональних коробок геному, що регулюють енергетику та метаболізм у соматичних клітинах та ЕСК, останні мають дуже низький рівень мРНК рецепторів, G-білків, вторинних месенджерів, транскриптаз, кофакторів експресії та репресії, тобто всієї системи трансмембранної передачі регуляторного сигналу до клітини. Це пов'язано з відсутністю або дуже низькою експресією транссигнальних генів. У період індукованої диференціації в геномі ЕСК синхронно припиняють роботу 18 функціонуючих генів на тлі активації 61 транссигнального гена, що контролюють синтез рецепторів клітинної адгезії, компонентів позаклітинного матриксу, рестрикційних транскриптаз та мессенджерних елементів системи передачі сигналів до ядерного апарату від рецепторів плазматичної мембрани клітини. Водночас блокується експресія генів, відповідальних за синтез білків-сайленсерів, а також коінгібіторів експресії генів, що забезпечують тотипотентність геному ЕСК.

Генні маркери були знайдені для клітин усіх трьох зародкових шарів. Ідентифікація ектодермального клітинного шару здійснюється за експресією генів nodal, oct3 та fgf-5, мезодермальних клітин - за генами brachyury, zeta-globin, ентодермальних - за експресією гена gata-4. У нормальному ембріогенезі в період гаструляції спостерігається активна міграція незрілих популяцій стовбурових та прогениторних клітин, що локально маркують зони розвитку лицьових кісток черепа, деяких відділів мозку, периферичної нервової системи, провідної системи серця та тимуса, тканини яких утворюються з клонів клітин-мігрантів. Маркування клітин ранніми генами зародкових шарів полегшує завдання топографічного аналізу процесів міграції клітин-попередників у ембріоні, що розвивається. Зокрема, встановлено, що в агрегатах клітин ембріокарциноми P19 експресія першого гена мезодерми брахіури починається в період зниженої експресії генів тканинного активатора плазміногену, α-фетопротеїну, кератину 8 та кератину 19, які є маркерами перших мігруючих популяцій мезодерми. Отже, формування тканин мезодермального походження починається лише після завершення процесу точкової міграції та розсіювання мезодермальних клітин-попередників.

Незважаючи на надзвичайно обмежені фенотипічні особливості та відсутність більшості транс-сигнальних одиниць, ЕСК все ж експресують деякі рецепторні молекули, які можна використовувати для їх ідентифікації. Примітно, що маркерні антигени ЕСК у людей та приматів виявилися поширеними. Найчастіше для мічення ЕСК використовуються мічені антитіла до мембранозв'язаних антигенів SSEA-3, SSEA-4 (унікальні ліпідні антигени, що представляють собою комплекс гліколіпіду GL7 із сіаловою кислотою), а також високополімерні глікопротеїни TRA-1-81, TRA-1-60. Крім того, ЕСК експресують специфічний ембріональний антиген SSEA-1 та ендогенну лужну фосфатазу, а також специфічний транскрипційний фактор Oct4. Останній необхідний для підтримки механізмів проліферації ЕСК - специфічний транскрипційний фактор Oct4 активує експресію гена фактора росту фібробластів 4 та стабілізує експресію коробки генів, відповідальних за необмежену реплікацію ДНК у незрілих клітинах. Найважливішими внутрішньоклітинними маркерними білками є Oct3, Oct4, Tcf та Groucho, які споріднені з білками-глушителями хроматину.

Майже одразу після того, як багато років спроб культивування ЕСК поза організмом увінчалися успіхом і були отримані перші культури стовбурових клітин, виділених з бластоцист мишей, та культури первинних статевих клітин, розпочався етап дослідження плюрипотентного потенціалу ЕСК, коли їх вводили в ембріони на ранніх стадіях розвитку. Було показано, що на стадіях морули та бластоцисти ЕСК здатні утворювати химерні ембріони, в яких нащадки донорських ЕСК виявляються у всіх соматичних тканинах і навіть у гаметах. Таким чином, у біології розвитку з використанням ЕСК було встановлено «місток» між експериментальними дослідженнями in vivo та in vitro, що значно розширило можливості вивчення процесів закладення первинних тканин та органів, їх диференціації та ембріонального органогенезу.

Чітко встановлено, що in vivo під час ембріогенезу ЕСК інтегруються в клітинну масу раннього ембріона, а їх похідні знаходяться в усіх органах і тканинах. ЕСК колонізують лінію статевих клітин у химерному ембріоні, нащадки яких утворюють повноцінні яйцеклітини та сперматозоїди. Ембріональні стовбурові клітини є клоногенними – одна ЕСК здатна створити генетично ідентичну колонію клітин з молекулярними маркерами, до яких належать експресія гена oct4 та лужної фосфатази, висока активність теломерази та експресія певних ембріональних антигенів.

Для вивчення механізмів ембріогенезу за допомогою ЕСК розроблено метод химеризації морули шляхом створення біологічної конструкції, зовні якої знаходиться шар тетраплоїдних бластомерів реципієнта, а всередину вводяться ЕСК донора. Таким чином, з нащадків тетраплоїдних бластомерів реципієнта формується трофобласт, який забезпечує імплантацію та плацентацію, а ЕСК донора виступають як внутрішня клітинна маса, з якої формується тіло життєздатного ембріона та лінія первинних статевих клітин-попередників. Дослідницька цінність ЕСК полягає не лише в тому, що плюрипотентність зберігається під час маніпуляцій з їх геномом in vitro, але й у тому, що зберігається здатність ЕСК брати участь у формуванні первинних статевих клітин химерного ембріона. Показано, що нащадки лише однієї генетично модифікованої ЕСК заселяють усі первинні зачатки та тканини, що розвиваються, химерного ембріона, отриманого шляхом агрегації або кокультивування цієї клітини з 8-клітинним ембріоном. Коли ЕСК, трансфіковані геном зеленого флуоресцентного білка, були пересаджені в морулу мишей, флуоресцентні нащадки цієї клітини були виявлені в усіх досліджених тканинах ембріона, що розвивається (Shimada, 1999). Трансплантація ЕСК в морулу дозволяє створювати життєздатних мишей, організм яких складається лише з нащадків ЕСК донора, що відкриває перспективи для різних варіантів терапевтичного клонування. Цей методологічний підхід зараз успішно використовується для вивчення проблем біології розвитку, зокрема, його застосовують для аналізу механізмів генетичної інактивації Х-хромосоми або епігенетичної нестабільності ЕСК. Трансплантація ЕСК в ранній ембріон також використовується в сільськогосподарській біотехнології, а також в експериментах з генної терапії.

Трансплантація генетично модифікованих ЕСК використовується для тестування клітин-мішеней мутантних генів. ЕСК, культивовані in vitro, використовуються в біотехнології для створення нокаутних мишей. Для цього ген, що досліджується, видаляється з ЕСК шляхом гомологічної рекомбінації (нокауту), і клітини, що не мають цього гена, виділяються на селективних середовищах. Потім нокаутні ЕСК вводяться в бластоцисту або агрегуються з бластомерами морули. Отримані таким чином химерні ранні ембріони трансплантують реципієнтним самкам, і з числа новонароджених мишей відбирають особин з гаметами, нулізиготними за даним геном. Ця технологія була використана для створення багатьох ліній нокаутних мишей, які широко використовуються в експериментальній біології та експериментальній медицині. Такі біологічні моделі використовуються для вивчення значення певних генів в ембріональному розвитку, а також їхньої ролі в механізмах захворювань і патологічних станів людини. Крім того, лінії нокаутних тварин використовуються в доклінічних випробуваннях нових методів генної терапії. Наприклад, шляхом трансфекції нормального алеля мутантного гена в геном ЕСК можна ефективно виправити мутацію, що впливає на кровотворну систему. Введення чужорідних генів у ЕСК дозволяє швидко створювати лінії гомозиготних трансгенних лабораторних тварин. Однак слід зазначити, що техніка цілеспрямованої рекомбінаційної делеції генів поки що була надійно розроблена лише стосовно ЕСК мишей. За допомогою подвійно нокаутованих ЕСК мишей було встановлено функціональну роль області генного кластера на 7-й хромосомі (копія геномної області на 19-й хромосомі людини) та проксимальної області 11-ї хромосоми (копія 5g-хромосоми людини) – делеція цих генів у ЕСК мишей дозволила оцінити функцію їх аналогів у людини.

Розширилися можливості вивчення функції генів ембріогенезу людини, трансфекція яких у геном ЕСК лабораторних тварин дозволила, зокрема, з'ясувати роль криптогена у формуванні та розвитку кардіогенної мезодерми, гена pax-6 – в ембріогенезі ока. Складаються перші карти експресії генів у незрілих проліферуючих ЕСК тератокарциноми та бластоцист мишей, а також підтверджено супресивну репресію транссигнальних генів в ЕСК. Поєднання 60-80 мутантних ЕСК та 20-30 клітин нормальних преімплантаційних ембріонів мишей призводить до розвитку химерних ембріонів, у яких зачатки органів складаються з клітин-донорів та реципієнтів, що дозволяє з'ясувати роль невідомих генів у гаструляції та органогенезі. Функціональна карта генів ембріонів мишей, що розвиваються, була доповнена інформацією про роль гена sf-1 у формуванні надниркової залози та гонад, гена wt-1 у формуванні нирки, генів родини myoD у формуванні скелетних м'язів та генів родини gata-1-4 у рестрикційному дозріванні зачатків еритропоезу та лімфопоезу.

Спрямоване вимкнення материнських та батьківських алелів генів в ЕСК за допомогою векторних рекомбіназ дозволило уточнити функції різних генів у ранньому періоді ембріогенезу, а технологія спрямованого перенесення невідомих генів людини в ЕСК миші сприяє відкриттю нових мутантних генів, відповідальних за розвиток тяжкої спадкової патології. За допомогою методу нокауту було визначено обов'язкове значення деяких генів для формування ембріональних тканин: gata-4 - для міокарда, gata-1 - для еритроїдного ряду кровотворної тканини, myoD - для скелетних м'язів, brachyury - для мезодерми, рестрикційних транскриптаз hnf3 та hnf4 - для стовбурових клітин печінки, rag-2 - для формування клонів Т- та В-лімфоцитів (Рєпін, 2001). Подвійна делеція генів в ЕСК відкрила доступ до вивчення функціональної ролі генів зародкового шару, сегментації та гомеозису, а трансплантація ЕСК дозволила отримати життєздатні міжвидові гібридні ембріони. Використовуючи вдосконалену методику трансплантації одноклітинної ембріональної стволової клітини (ЕСК) одного донора у 8-клітинний ембріон, доведено факт химеризації на клітинному рівні багатьох органів ембріона-реципієнта. Слід зазначити, що в органах мишей-реципієнтів після введення гемопоетичних стовбурових клітин людини в бластоцисту були виявлені клітинні паростки тканини людини. Встановлено, що плюрипотентні ЕСК циркулюють у крові ембріонів мишей у період формування органів. Можливо, їх біологічна функція полягає в ембріональній організації майбутньої імунної системи. За допомогою ЕСК у лабораторних умовах відтворено адекватні моделі генетичної патології людини: подвійний нокаут гена дистрофіну моделює м'язову дистрофію Дюшена у мишей, а вимкнення гена atm (контроль синтезу сигнальної кінази хроматину) - атаксію-телеангіектазію. При цьому фатальному спадковому захворюванні у дітей розвивається дегенерація клітин Пуркіньє в мозочку через дефекти репарації ДНК, що супроводжується інволюцією тимуса внаслідок загибелі проліферуючих клітин. Клінічна картина, патофізіологія та патоморфологія атаксії-телеангіектазії, відтвореної шляхом введення патологічної генетичної інформації в ЕСК, у химерних мишей відповідають таким у людини. Окрім атаксії-телеангіектазії, з використанням ЕСК та нокаутних мишей розроблено експериментальні моделі деяких спадкових гомозиготних захворювань людини, пов'язаних з патологією вуглеводного та ліпідного обміну, катаболізму амінокислот, екскреції міді та білірубіну, що значно розширило можливості експериментальної медицини на етапі доклінічних випробувань нових методів лікування відповідних захворювань людини.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Використання цитогібридів стовбурових клітин

Гібридні клітини, отримані шляхом злиття ЕСК із соматичними клітинами, є адекватною та перспективною моделлю для вивчення плюрипотентності стовбурових клітин та репрограмування хромосом диференційованих клітин. Цитогібриди, отримані шляхом злиття ЕСК з диференційованими клітинами дорослої тварини, дозволяють вивчати взаємозв'язки між геномами різного «віку»: виникає унікальна ситуація, коли гомологічні хромосоми, що походять з клітин на різних стадіях диференціації та різного ступеня зрілості, розташовані в одному ядрі, де вони можуть легко обмінюватися транс-активними регуляторними сигналами. Важко передбачити, як цисрегуляторні епігенетичні системи гомологічних хромосом, що утворюються під час індивідуального розвитку, реагуватимуть на вплив транс-активних сигналів, що виходять від ембріонально споріднених геномів. Крім того, в гібридних клітинах відбувається сегрегація батьківських хромосом, що дозволяє вивчати взаємодію геномів на рівні окремих хромосом, тобто потенційно ідентифікувати участь конкретних хромосом у підтримці плюрипотентності або, навпаки, виході до диференціації.

Цитогібриди, отримані шляхом злиття плюрипотентних тератокарциномних та диференційованих соматичних клітин, були використані як перша експериментальна модель для вивчення взаємодії геномів з різними «історіями розвитку». У деяких випадках такі гібридні клітини зберігали плюрипотентні властивості на досить високому рівні. Зокрема, in vivo гібридні клітини тератокарциноми-соматики індукували розвиток справжніх тератом, що містять похідні всіх трьох зародкових шарів, а in vitro в суспензійних культурах вони утворювали ембріоїдні тільця. Навіть у міжвидових цитогібридах цього типу відзначалася присутність ембріональних антигенів у випадках, коли соматичними партнерами у злитті з клітинами тератокарциноми були лімфоцити або тимоцити. Примітно, що цитогібриди, створені шляхом злиття клітин тератокарциноми з фібробластами, відповідали фібробластам за фенотипом.

Найважливішим встановленим фактом є те, що в гібридних клітинах тератокарциноми-соматики з'явилися ознаки репрограмування геному диференційованих клітин, що характеризувалося реактивацією або окремих генів, або неактивної Х-хромосоми соматичного партнера. Таким чином, результати досліджень цитогібридів клітинного типу тератокарциноми-соматики свідчать про те, що в гібридних клітинах часто зберігається плюрипотентність та є ознаки репрограмування геному соматичного партнера.

В експериментах з отримання внутрішньовидових ембріональних гібридних клітин шляхом злиття ембріональних стволових клітин миші з дорослими спленоцитами вивчали характеристики таких цитогібридів, аналізували сегрегацію батьківських хромосом та оцінювали плюрипотентність гібридного геному. Внутрішньовидові гібридні клітини, отримані шляхом злиття клітин тератокарциноми із соматичними клітинами, зазвичай характеризуються низьким рівнем сегрегації хромосом з тетраплоїдним або майже тетраплоїдним каріотипом. Подібний хромосомний склад спостерігався у цитогібридів під час злиття первинних статевих клітин з лімфоцитами. Водночас міжвидові гібридні клітини, отримані шляхом злиття клітин тератокарциноми миші з лімфоцитами норки, демонстрували інтенсивну сегрегацію хромосом соматичного партнера.

Якісно новий етап у вивченні сегрегації батьківських хромосом у внутрішньовидових гібридів розпочався після розробки методу аналізу мікросателітів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, завдяки якому було знайдено кілька сотень маркерів для кожної хромосоми миші, що дозволяє надійно розрізняти будь-яку пару гомологічних хромосом у гібридних клітинах.

Шляхом злиття ЕСК (клітини HM-1 з дефіцитом активності гіпоксантинфосфорибозилтрансферази, 2n = 40, XY, виділені з бластоцист мишей 129/01a) зі спленоцитами конгенних мишей DD/c, вдалося отримати набір гібридних клонів, морфологічно подібних до ЕСК. Всі клони були виділені на селективному середовищі, в якому можуть рости лише клітини з активною гіпоксантинфосфорибозилтрансферазою. Електрофоретичний аналіз показав, що всі клони мали алельний варіант гіпоксантинфосфорибозилтрансферази, характерний для мишей DD/c. Цитогенетичний аналіз показав, що три з чотирьох гібридних клонів мали майже диплоїдний набір хромосом. Один майже тетраплоїдний клон містив дві популяції гібридних клітин, одна з яких була тетраплоїдною, а друга, менша, – диплоїдною.

Мікросателітний аналіз, який дозволяє розрізняти будь-яку пару гомологічних хромосом мишей 129/01a та DD/c, у гібридних клонах з майже диплоїдним набором показав, що у двох клонах спостерігалася чітка переважна елімінація аутосом соматичного партнера. Більшість аутосом у клонах HESS2 та HESS3 мали маркери лінії 129/01a, тобто плюрипотентного партнера. Винятком були хромосоми 1 та I: у клонах HESS2 та HESS3, поряд з маркерами клітин HM-1, маркери соматичного партнера були присутні в невеликих кількостях. Такі результати можуть відображати неповну сегрегацію хромосом 1 та I соматичного партнера та узгоджуються з цитогенетичними даними про те, що трисомія за цими хромосомами спостерігається у 30-40% клітин клонів HESS2 та HESS3. Клон HESS4 суттєво відрізнявся за своїм хромосомним складом: багато аутосом у цьому клоні походять з геному ЕСК (хромосоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 та 17), але хромосоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 та 19 були представлені гомологами обох батьків. Кількісне співвідношення мікросателітів, що маркують ці гомологічні хромосоми, становило приблизно 1:1. Це дозволило авторам припустити, що один гомолог походить з геному ЕСК, а інший - з диференційованих клітин. У деяких субклонах клону HESS4 були присутні лише маркери хромосом 18 та 19 соматичного партнера. Отримані результати свідчать про те, що в клітинах клону HESS4, окрім сегрегації хромосом соматичного партнера, відбулося елімінування одного або обох гомологів перерахованих вище хромосом плюрипотентного геному, тобто мала місце двостороння сегрегація хромосом обох батьків – дуже незвичайне явище, оскільки сегрегація хромосом лише одного з батьків характерна для цитогібридів.

Крім того, після 20-го пасажу всі клони гібридних клітин містили лише маркери Х-хромосоми соматичного партнера, тобто у клонах ЕСК-Хромосома була замінена Х-хромосомою соматичного партнера. Цей важливий факт підтверджується даними гібридизації in situ з використанням FITC-міченого зонда, специфічного для Х-хромосоми миші: позитивний сигнал був виявлений лише на одній хромосомі. Слід зазначити, що на ранніх етапах культивування (до 15-го пасажу), згідно з цитогенетичними даними, багато клітин містили дві Х-хромосоми. Отже, використання селективних середовищ дозволяє маніпулювати хромосомним складом гібридних клітин та вибірково відбирати клони, що несуть поодинокі хромосоми соматичного партнера, на тлі геному ЕСК.

Оскільки унікальною особливістю цитогібридного геному є локалізація батьківських геномів в одному ядрі, природно виникає питання про збереження плюрипотентних властивостей ембріонального геному в гібридах ЕСК-соматичних клітин за умов його тісного контакту з геномом диференційованої клітини. Морфологічно цитогібриди ЕСК та соматичних клітин були подібні до батьківської лінії ЕСК. Оцінка плюрипотентності показала, що всі клони з майже диплоїдним набором хромосом були здатні утворювати ембріоїдні тіла в суспензійних культурах, в яких були присутні похідні трьох зародкових шарів.

Більшість гібридних клітин містили антиген ECMA-7, маркер, характерний для ранніх ембріонів мишей, а також мали високу активність лужної фосфатази. Найбільш переконливі дані про високі плюрипотентні властивості гібридних клітин були отримані в експериментах з отримання серії ін'єкційних химер за участю гібридних клітин клону HESS2. Аналіз біохімічних маркерів показав, що нащадки донорських гібридних клітин були присутні в більшості тканин химер. Отже, гібридні клітини, отримані шляхом злиття ЕСК та соматично диференційованих клітин, зберігають плюрипотентність на високому рівні, включаючи здатність утворювати химери при ін'єкції в порожнину бластоцисти.

Клони HESS2 та HESS4 суттєво відрізнялися складом батьківських хромосом, але мали подібні плюрипотентні властивості. Можна було б припустити, що плюрипотентність у гібридному геномі проявляється як домінантна ознака, але можливо, що не всі хромосоми ембріонального геному беруть участь у процесі підтримки плюрипотентності. Якщо це припущення правильне, то можна очікувати, що елімінація деяких хромосом плюрипотентного партнера з геному гібридних клітин не супроводжуватиметься зміною їх плюрипотентного статусу. У цьому випадку аналіз сегрегації батьківських хромосом в ембріональних гібридних клітинах дозволив би нам ближче підійти до ідентифікації хромосом, відповідальних за контроль плюрипотентності ембріональних клітин.

О. Сєров та ін. (2001) не виявили жодного потомства серед 50 нащадків, отриманих шляхом схрещування химер з нормальними мишами, які мали генотип миші 129/01a та несли Х-хромосому мишей DD. Автори вважають, що це пов'язано зі зниженням плюрипотентності в гібридних клітинах під впливом соматичного геному. Альтернативним поясненням може бути негативний вплив трисомії на деякі аутосоми та дисбаланс статевих хромосом (XXY спостерігалися в клітинах до 15-го пасажу) у гібридних клітинах під час мейозу. Відомо, що клітини XXY не здатні піддаватися мейозу та утворювати гамети. Трисомія також може спричиняти зниження проліферативної активності гібридних клітин, внаслідок чого селективна перевага в розвитку химер може належати клітинам ембріона-реципієнта. Звідси випливає, що для адекватної оцінки плюрипотентного потенціалу гібридних клітин необхідно отримати гібридні клони з нормальним диплоїдним набором хромосом.

В експериментах О. Сєрова та співавторів (2001) вперше було продемонстровано можливість репрограмування Х-хромосоми соматичної клітини в геномі гібридних клітин. Цей висновок авторів випливає з аналізу експресії гена hprt (маркера Х-хромосоми) у химер: наявність алельного варіанта hprt мишей DD/c була виявлена у всіх аналізованих химерних тканинах. Доречно наголосити, що після введення гібридних клітин у порожнину бластоцисти цитогібриди потрапляють у неселективні умови, і збереження Х-хромосоми в геномі гібридних клітин означає, що вона стала його облігатним компонентом, і геном не дискримінує її від Y-хромосоми плюрипотентного партнера.

Підсумовуючи результати аналізу взаємодії соматичного та плюрипотентного геномів у гібридних ембріональних клітинах, автори роблять висновок, що у деяких цитогібридів плюрипотентність проявляється як домінантна ознака. Гібридний геном здатний до перепрограмування окремих хромосом диференційованих клітин, що, однак, не виключає можливості зворотного впливу соматичного геному на плюрипотентність ембріонального геному. При культивуванні гібридних клітин індукція диференціації відбувається значно частіше, ніж у вихідній батьківській лінії ЕСК HM-1. Подібний ефект спостерігається під час формування первинних колоній: багато первинних колоній ембріональних гібридних клітин диференціюються на ранніх стадіях формування з великими втратами клонів під час їх відбору та розмноження.

Таким чином, цитогібриди, створені шляхом злиття ембріональних стволових клітин (ЕСК) із соматичними клітинами, незважаючи на тісний контакт з геномом диференційованих клітин, зберігають плюрипотентність як унікальну властивість ембріонального геному. Більше того, в таких гібридних клітинах можливе перепрограмування окремих хромосом, що походять з диференційованих клітин. Залишається незрозумілим, якою мірою плюрипотентні властивості ембріонального геному зберігаються в гібридних клітинах, зокрема, їхня здатність брати участь у формуванні зародкової лінії у химер. Це вимагає отримання ембріональних гібридних клітин з нормальним каріотипом. У будь-якому випадку, плюрипотентні ембріональні гібридні клітини можуть стати реальною генетичною моделлю для ідентифікації хромосом, що беруть участь у підтримці плюрипотентності або її контролі, оскільки двостороння сегрегація батьківських хромосом потенційно надає таку можливість.

Не менш привабливим є вивчення феномену, який О. Сєров та ін. (2001) визначають як «хромосомну пам'ять». У гібридному геномі гомологічні хромосоми знаходяться у двох альтернативних конфігураціях: гомологи соматичного партнера вже колись зазнали диференціації, тоді як у гомологів плюрипотентного партнера цей процес тільки починається. Отже, збереження високих плюрипотентних властивостей гібридними клітинами свідчить про те, що «плюрипотентна» конфігурація гомологів ЕСК є достатньо стабільною в гібридному геномі, незважаючи на вплив трансакційних факторів, що виходять від соматичного партнера. Описані вище ознаки репрограмування гомологічних хромосом диференційованого геному під час розвитку химер не виключають можливості того, що на перших етапах формування та культивування цитогібридів in vitro вони зберігають свій статус, набутий під час диференціації in vivo. Згідно з нещодавно отриманими даними, при перенесенні ембріональних гібридних клітин у неселективне середовище вони демонструють інтенсивну елімінацію хромосом лише соматичного партнера, тобто геном гібридних клітин легко дискримінує гомологи після культивування in vitro протягом 10-15 пасажів. Таким чином, ембріональні гібридні клітини являють собою перспективну експериментальну модель для вивчення не лише такої фундаментальної властивості ембріонального геному, як плюрипотентність, але й її альтернативи – ембріональної диференціації.

Терапевтична ефективність трансплантації ембріональних стовбурових клітин

Перш ніж аналізувати терапевтичну ефективність трансплантації ЕСК та їх похідних, підсумуємо вищевикладений матеріал. Можливості ЕСК щодо повноцінного здійснення ембріогенезу in vitro недостатні, оскільки дефекти розвитку в цьому випадку зумовлені відсутністю мезенхімальних стовбурових клітин, які виникають в організмі автономно та незалежно від ЕСК. Генетичний потенціал ЕСК менший за генетичний потенціал зиготи, тому ЕСК не використовуються безпосередньо для клонування ембріонів. Унікальний біологічний потенціал ЕСК як єдиних клітин, в яких програми розвитку повністю розгорнуті в послідовній реалізації, використовується в дослідженнях функції генів. За допомогою ЕСК декодуються перші комбінації сигналів, що активують експресію ранніх та пізніх генів, що кодують розвиток трьох зародкових шарів. Збереження плюрипотентності геному ЕСК in vitro робить їх унікальним інструментом для репаративної регенерації, здатним автоматично поповнювати клітинні втрати у разі пошкодження органів і тканин. В ідеальному гіпотетичному сценарії можна припустити, що «... під час трансплантації донорських ембріональних стволових клітин (ЕСК) в організм реципієнта переносяться компактно упаковані програми, які за сприятливих умов реалізуються в побудові нової тканини»7, здатної «... ефективно інтегруватися в організм реципієнта як на морфологічному, так і на функціональному рівнях».

Природно, що після розробки методів монодиференціації ЕСК розпочалося дослідження in vivo функціональної активності клітин, отриманих in vitro з одного спеціалізованого клону. Проліферуючий клон ЕСК генерує популяції мігруючих клітин-попередників, які дійсно здатні активно інтегруватися в ділянки пошкодження тканин реципієнта, що використовується в регенеративно-пластичній медицині. Встановлено, що трансплантація ДОФА-нейронів у чорну субстанцію зменшує клінічні прояви при експериментальному геміпаркінсонізмі. Регіональні трансплантати донорських нейронних стовбурових клітин знижують ступінь рухових порушень, спричинених травмою або забоєм спинного та головного мозку. Також отримано перші позитивні результати трансплантації стовбурових клітин при демієлінізуючих захворюваннях. Здавалося б, регенеративно-пластичний потенціал ЕСК відкриває необмежені можливості для використання клітинної трансплантації в практичній медицині. Однак при пересадці в ектопічні зони ЕСК неминуче трансформуються в пухлини. Тератоми утворюються при підшкірному введенні ЕСК імунодефіцитним мишам. При пересадці суспензій ЕСК під капсулу яєчка у сингенних мишей також утворюються тератоми, що складаються з різних тканин, клітини яких є похідними всіх трьох зародкових листків. У таких тератомах процеси зниженого органогенезу зустрічаються вкрай рідко.

Низка досліджень надає інформацію про позитивні результати трансплантації ранніх похідних ЕСК тваринам з експериментальною патологією. Клітинна нейротрансплантація з використанням похідних ЕСК отримує подальший розвиток в експериментах та перших клінічних випробуваннях для корекції функціональних порушень при травмах головного та спинного мозку, а також для лікування сирингомієлії та розсіяного склерозу (Рєпін, 2001). З появою техніки нейрогенезу in vitro з ЕСК, замість використання ембріональної тканини мозку, розробляються методи трансплантації похідних нейросфер, отриманих з ембріональних культур нервової тканини. Такі суспензії трансплантатів є значно більш однорідними та містять комітовані попередники нейронів та нейроглії.

При регулярному додаванні ретиноєвої кислоти в дозі 10 мкг/мл до культурального середовища протягом 6 тижнів у лінії ембріо-(терато)-карциноми людини NTERA-2 формується понад 80% постмітотичних нейронів. Повна однорідність нейронної популяції досягається шляхом потокового сортування зрілих нейронів, мічених імунофенотипічними маркерами, що дозволяє позбутися залишків тератокарциноми та незрілих клітин. Після трансплантації в різні ділянки мозку експериментальних тварин такі нейрони не тільки виживають, але й інтегруються в регіональні нейронні мережі. У тварин з експериментальними моделями локальних дефектів ЦНС нейротрансплантація зменшує клінічні прояви таких патологій людини, як наслідки черепно-мозкової травми, інсульту, демієлінізуючих захворювань, спадкових дефектів розвитку мозочка, захворювань відкладення ліпідів та полісахаридів.

Для оптимізації процесів регенерації при дегенеративних захворюваннях центральної нервової системи розробляються технології отримання мієлін-продукуючих олігодендроцитів з ЕСК. Перший етап традиційно включає проліферацію ЕСК з відтворенням кількості клітин, необхідної для трансплантації. На другому етапі здійснюється цілеспрямована диференціація клітин у популяцію мієлін-продукуючих олігодендроцитів-попередників, яка контролюється селективними маркерними антигенами.

Певні перспективи відкриваються для використання похідних ЕСК для розробки методів корекції імунодефіцитів, спричинених генетичними дефектами дозрівання тимуса. У дослідженнях на нокаутних (rag 1) мишах з індукованим дефектом гена – порушенням механізму рекомбінації V(D)J локусів генів TCR, що призводить до втрати функції Т-лімфоцитів, трансплантація ранніх похідних ЕСК у тимус тварин відновлює дозрівання нормальних популяцій імунних клонів, відповідальних за клітинний імунітет. Клінічні випробування трансплантації преформованих ЕСК in vitro для лікування фатальних спадкових анемій у дітей тривають.

Заперечення проти швидкого впровадження трансплантації стовбурових клітин у клініку ґрунтуються на обмеженій кількості стабільних ліній ембріональних стовбурових клітин людини та необхідності їх стандартизації. Для підвищення чистоти стандартизованих ліній ЕСК, а також дорослих стовбурових клітин людини пропонується використовувати метод відбору ліній, заснований на молекулярно-генетичному аналізі коротких тандемних повторів ДНК. Також необхідно тестувати лінії ЕСК на наявність невеликих хромосомних перебудов та генетичних мутацій, потенціал виникнення яких в умовах культивування клітин є досить високим. Висувається теза про обов'язкове тестування властивостей усіх типів ЕСК та регіональних плюрипотентних стовбурових клітин, оскільки їх розмноження in vitro може призвести до появи нових характеристик, не властивих ембріональним стовбуровим клітинам або дефінітивним тканинам. Зокрема, передбачається, що тривале культивування в середовищах з цитокінами наближає лінії ЕСК до пухлинних клітин, оскільки вони зазнають подібних змін у шляхах регуляції клітинного циклу з набуттям здатності здійснювати необмежену кількість клітинних поділів. Деякі автори, виходячи з потенціалу розвитку пухлини, вважають трансплантацію ранніх похідних ембріональних стовбурових клітин людині необачною. На їхню думку, набагато безпечніше використовувати комітовані нащадки ембріональних стволових клітин (ЕСК), тобто лінії диференційованих клітин-попередників. Однак наразі надійної методики отримання стабільних ліній клітин людини, що диференціюються в бажаному напрямку, ще не розроблено.

Таким чином, у літературі з'являється все більше даних про позитивний терапевтичний ефект трансплантації похідних ембріональних стовбурових клітин людини. Однак багато з цих досліджень піддаються перегляду та критиці. Деякі дослідники вважають, що результати ранніх клінічних випробувань носять попередній характер і лише вказують на те, що стовбурові клітини здатні чинити сприятливий вплив на клінічний перебіг певного захворювання. Тому необхідно отримати дані про віддалені результати клітинної трансплантації. Як аргумент наводяться етапи розвитку клінічної нейротрансплантології. Дійсно, спочатку в літературі переважали публікації про високу ефективність трансплантації ембріональних фрагментів мозку при хворобі Паркінсона, але потім почали з'являтися повідомлення, що заперечують терапевтичну ефективність ембріональної або фетальної нервової тканини, пересадженої в мозок пацієнтів.

Перші клінічні випробування були проведені для оцінки безпеки трансплантації нейробластів, отриманих з ембріональних стволових клітин (ЕСК) тератокарциноми NTERA-2, незрілі клітини яких піддавали проліферації в культурі до накопичення 100 мільйонів клітинної маси. Частина отриманих таким чином клітин була використана для характеристики фенотипу та визначення клітинних домішок, а також для перевірки на можливе забруднення вірусами та бактеріями. LIF та шар-годівницю фетальних стромальних клітин видаляли з культурального середовища, створюючи умови для цілеспрямованої диференціації ЕСК у нейробласти за допомогою комбінації цитокінів та факторів росту. Потім нейробласти очищали від незрілих клітин тератокарциноми на проточному сортувальнику клітин. Після вторинного очищення та фенотипової характеристики трансплантованих клітин суспензію нейробластів (10-12 мільйонів) вводили в базальне ядро мозку пацієнтів (на сьомому місяці після геморагічного інсульту) за допомогою спеціальної мікроканюлі та шприца під стереотаксичним та комп'ютерним томографічним контролем. Річний посттрансплантаційний скринінг наслідків трансплантації нейронів у зону інсульту не виявив жодних побічних або небажаних ефектів. У половини пацієнтів спостерігалося покращення рухової функції в період від 6 до 12 місяців після трансплантації. Позитивні клінічні зміни супроводжувалися посиленням кровопостачання зони інсульту після трансплантації клітин: середнє збільшення поглинання флуоресцентно міченої 2-дезоксиглюкози, за даними позитронно-емісійної томографії, досягало 18%, а у деяких пацієнтів – 35%.

Однак Національні інститути охорони здоров'я США провели незалежне дослідження клінічної ефективності нейротрансплантації у пацієнтів з паркінсонізмом. Пацієнтам першої групи були трансплантовані ділянки ембріональної нервової тканини, що виробляють дофамін, тоді як другій групі пацієнтів було проведено фіктивну операцію. Результати вказують на нульову клінічну ефективність такої нейротрансплантації, незважаючи на те, що ембріональні нейрони, що виробляють дофамін, вижили в мозку реципієнтів. Більше того, через 2 роки після трансплантації ембріональної нервової тканини у 15% пацієнтів розвинулася стійка дискінезія, яка була відсутня у пацієнтів групи плацебо (Стовбурові клітини: науковий прогрес та напрямки майбутніх досліджень. Національний інститут охорони здоров'я. США). Спостереження за подальшим розвитком захворювання у цих пацієнтів тривають.

Деякі автори пов'язують суперечливі дані літератури щодо оцінки клінічної ефективності нейротрансплантації з різними підходами до відбору груп пацієнтів, неадекватним вибором методів об'єктивної оцінки їхнього стану, а головне – різними періодами розвитку ембріональної нервової тканини та різними ділянками мозку, з яких цю тканину було отримано, різними розмірами трансплантатів та методологічними особливостями хірургічного втручання.

Слід зазначити, що спроби прямої трансплантації плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин у стріатумну область мозку щурів з експериментальним геміпаркінсонізмом супроводжувалися проліферацією ЕСК та їх диференціацією в дофамінергічні нейрони. Слід припустити, що новоутворені нейрони ефективно інтегрувалися в нейронні мережі, оскільки після трансплантації ЕСК спостерігалася корекція поведінкових аномалій та рухової асиметрії в апоморфіновому тесті. Водночас деякі тварини гинули внаслідок трансформації трансплантованих ЕСК у пухлини мозку.

Експерти Національної та Медичної академій США, фахівці Національного інституту охорони здоров'я США вважають, що клінічний потенціал ембріональних стволових клітин (ЕСК) заслуговує на найсерйознішу увагу, але наполягають на необхідності детального вивчення їх властивостей, ймовірності ускладнень та довгострокових наслідків в експериментах на адекватних біологічних моделях захворювань людини (Стовбурові клітини та майбутня регенеративна медицина Національної академії преси; Стовбурові клітини та майбутні напрямки досліджень. Національний інститут охорони здоров'я США).

З цієї точки зору важливо, що порівняльний гістологічний аналіз експериментальних тератом, отриманих шляхом трансплантації суспензії ЕСК у яєчко, з тератомами, утвореними в результаті трансплантації раннього ембріона, який також містить ЕСК, показав, що ЕСК, незалежно від їхнього джерела походження чи взаємодії з певними навколишніми клітинами, реалізують свій пухлинний потенціал однаково. Було доведено, що такі тератоми мають клональне походження, оскільки пухлини, що складаються з похідних усіх трьох зародкових шарів, можуть виникати з одного ЕСК (Rega, 2001). Примітно, що при трансплантації клонованих ЕСК з нормальним каріотипом імунодефіцитним мишам також утворювалися тератоми, що складаються з різних типів диференційованих соматичних клітин. Ці експериментальні дані є бездоганним доказом клонального походження тератом. З точки зору біології розвитку вони вказують на те, що джерелом диференційованих похідних усіх трьох зародкових шарів, що складають тератому, виступають не множинні коммітовані клітини-попередники, а одна плюрипотентна стовбурова клітина. Однак на шляху до практичної клітинної трансплантації результати цих досліджень є якщо не заборонним, то попереджувальним знаком потенційної небезпеки, оскільки інокуляція ЕСК або первинних статевих клітин у різні тканини дорослих імунодефіцитних мишей неминуче спричиняє розвиток пухлин з пересаджених стовбурових клітин. Неопластична дегенерація ектопічно пересаджених ЕСК супроводжується появою сателітних популяцій диференційованих клітин – внаслідок часткової диференціації ЕСК та клонів-попередників у спеціалізовані лінії. Цікаво, що при пересадці ЕСК у скелетні м’язи нейрони найчастіше утворюються поруч із клітинами тератокарциноми. Однак введення ЕСК у яйцеклітину, що ділиться, або бластоцисту супроводжується повною інтеграцією клітин у ембріон без утворення неопластичних елементів. У цьому випадку ЕСК інтегруються практично у всі органи та тканини ембріона, включаючи генітальний зачаток. Такі алофенові тварини вперше були отримані шляхом введення клітин тератокарциноми 129 у ранні ембріони на стадіях 8-100 клітин. У алофенових мишей популяції гетерогенних клітин, отриманих з ембріональних стволових клітин донорів, інтегруються в тканини кісткового мозку, кишечника, шкіри, печінки та статевих органів, що дозволяє створювати навіть міжвидові клітинні химери в експерименті. Чим коротший період розвитку раннього ембріона, тим вищий відсоток химеризації клітин, причому найвищий ступінь химеризації спостерігається в кровотворній системі, шкірі, нервовій системі, печінці та тонкому кишечнику алофенового ембріона. У дорослому організмі тканини, захищені від імунної системи реципієнта гістогематичними бар'єрами, схильні до химеризації:Трансплантація первинних статевих клітин у паренхіму яєчка супроводжується включенням донорських стовбурових клітин у шар зародкової тканини реципієнта. Однак, при трансплантації ЕСК у бластоцисту формування химерних зачатків статевих органів з генерацією донорських первинних статевих клітин не відбувається. Плюрипотентність ЕСК, за створення спеціальних умов, також може бути використана для клонування: трансплантація мишачих ЕСК у 8-16-клітинний ембріон миші, у якого клітинні мітози блокуються цитокальсином, сприяє здійсненню нормального ембріогенезу з розвитком ембріона з донорських ЕСК.

Отже, альтернативою алогенній трансплантації ЕСК є терапевтичне клонування, засноване на трансплантації ядер соматичних клітин в енуклеовану яйцеклітину для створення бластоцисти, з внутрішньої клітинної маси якої потім виділяють лінії ЕСК, генетично ідентичні донору соматичного ядра. Технічно ця ідея цілком здійсненна, оскільки можливість створення ліній ЕСК з бластоцист, отриманих після трансплантації соматичних ядер в енуклеовані яйцеклітини, була неодноразово доведена в експериментах на лабораторних тваринах (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Зокрема, у мишей, гомозиготних за мутацією гена rag2, як донори ядер використовували фібробласти, отримані шляхом культивування клітин субепідермальної тканини, які пересаджували в енуклеовані ооцити. Після активації ооцитів «зиготу» культивували до утворення бластоцисти, з внутрішньої клітинної маси якої виділяли ЕСК та переносили в лінію клітин, нулізиготних за мутантним геном (rag2~/~). Мутацію одного алельного гена в таких ЕСК було виправлено методом гомологічної рекомбінації. У першій серії експериментів ембріональні тільця отримували з ЕСК з рекомбінантним відновленим геном, їхні клітини трансфікували рекомбінантним ретровірусом (HoxB4i/GFP) та після розмноження вводили у вену мишей rag2~/~. У другій серії тетраплоїдні бластомери агрегували з генетично модифікованими ЕСК та трансплантували самокам-реципієнтам. Отримані імунокомпетентні миші служили донорами кісткового мозку для трансплантації мишам-мутантам rag2~/~. В обох серіях результат був позитивним: через 3-4 тижні у всіх мишей були виявлені зрілі нормальні мієлоїдні та лімфоїдні клітини, здатні продукувати імуноглобуліни. Таким чином, трансплантація ядер соматичних клітин в ооцити може бути використана не тільки для отримання ліній ЕСК, але й для цитогенотерапії - корекції спадкових аномалій, використовуючи ЕСК як вектор для транспорту коригувальної генетичної інформації. Але цей напрямок клітинної трансплантації, крім біоетичних проблем, має свої обмеження. Незрозуміло, наскільки безпечною буде трансплантація терапевтично клонованих клітин з генотипом, ідентичним генотипу конкретного пацієнта, оскільки такі клітини можуть вносити мутації, що створюють схильність до інших захворювань. Звичайні людські яйцеклітини залишаються важкодоступним об'єктом, тоді як навіть при трансплантації соматичних ядер в енуклеовані яйцеклітини тварин лише 15-25% сконструйованих «зигот» розвиваються до стадії бластоцисти. Поки що не визначено, скільки бластоцист потрібно для отримання однієї лінії плюрипотентних клонованих ембріональних стволових клітин (ЕСК). Варто також зазначити високий рівень фінансових витрат, пов'язаних зі складністю методології терапевтичного клонування.

На завершення слід зазначити, що в ЕСК плюрипотентність геному з гіпометильованою ДНК поєднується з високою теломеразною активністю та короткою C^ фазою клітинного циклу, що забезпечує їх інтенсивне та потенційно нескінченне розмноження, під час якого ЕСК зберігають диплоїдний набір хромосом та «ювенільний» набір фенотипових характеристик. Клональний ріст ЕСК у культурі не перешкоджає їх диференціації в будь-яку спеціалізовану клітинну лінію організму при зупинці проліферації та додаванні відповідних регуляторних сигналів. Рестрикційна диференціація ЕСК у соматичні клітинні лінії in vitro реалізується без участі мезенхіми, минаючи Нохтеї, поза органогенезом та без формування ембріона. Ектопічне введення ЕСК in vivo неминуче призводить до формування тератокарцином. Трансплантація ЕСК у бластоцисту або ранній ембріон супроводжується їх інтеграцією з тканинами ембріона та стабільною химеризацією його органів.

Регенеративно-пластичні технології, засновані на трансплантації клітин, є точкою перетину інтересів представників клітинної біології, біології розвитку, експериментальної генетики, імунології, неврології, кардіології, гематології та багатьох інших галузей експериментальної та практичної медицини. Найважливіші результати експериментальних досліджень доводять можливість репрограмування стовбурових клітин з цілеспрямованою зміною їх властивостей, що відкриває перспективи для контролю процесів цитодиференціації за допомогою факторів росту – для регенерації міокарда, відновлення уражень ЦНС та нормалізації функції острівцевого апарату підшлункової залози. Однак для широкого впровадження трансплантації похідних ЕСК у практичну медицину необхідно більш детально вивчити властивості стовбурових клітин людини та продовжити експерименти з ЕСК на експериментальних моделях захворювань.

Біоетичні питання та проблема відторгнення алогенного клітинного трансплантата могли б бути вирішені завдяки виявленій пластичності геному регіональних стовбурових клітин дорослого організму. Однак початкова інформація про те, що при пересадці ізольованих та ретельно охарактеризованих гемопоетичних аутологічних клітин у печінку, з яких походять нові гепатоцити, що інтегруються в часточки печінки, зараз переглядається та критикується. Проте, опубліковані дані про те, що трансплантація нервових стовбурових клітин у тимус викликає утворення нових донорських паростків Т- та В-лімфоцитів, а трансплантація нервових стовбурових клітин мозку в кістковий мозок призводить до утворення гемопоетичних паростків з тривалим донорським мієло- та еритропоезом. Отже, плюрипотентні стовбурові клітини, здатні перепрограмувати геном до потенціалу ембріональних стволових клітин (ЕСК), можуть персистувати в органах дорослого організму.

Джерелом отримання ЕСК для медичних цілей залишається людський ембріон, що зумовлює неминучість нового перетину моральних, етичних, правових та релігійних питань у точці зародження людського життя. Відкриття ЕСК дало потужний поштовх до відновлення жорстких дискусій про те, де проходить межа між живими клітинами та матерією, буттям та особистістю. Водночас, універсальних норм, правил та законів щодо використання ЕСК у медицині не існує, незважаючи на неодноразові спроби їх створення та прийняття. Кожна держава, в рамках свого законодавства, вирішує цю проблему самостійно. Зі свого боку, лікарі всього світу продовжують намагатися вивести регенеративно-пластичну медицину за рамки таких дискусій, насамперед шляхом використання резервів дорослих стовбурових клітин, а не ембріональних стовбурових клітин.

Трохи з історії виділення ембріональних стовбурових клітин

Клітини терато(ембріо)карциноми були виділені зі спонтанно виниклих тератом яєчок мишей 129/ter-Sv, спонтанних тератом яєчників мишей Lt/Sv та з тератом, отриманих з ектопічно трансплантованих ембріональних клітин або тканин. Серед стабільних ліній клітин терато(ембріо)карциноми мишей, отриманих таким чином, деякі були плюрипотентними, інші диференціювалися лише в один специфічний тип клітин, а деякі були повністю нездатними до цитодиференціації.

Свого часу основна увага була зосереджена на дослідженнях, результати яких вказували на можливість повернення клітин терато-(ембріо)-карциноми до нормального фенотипу після їх введення в тканини ембріона, що розвивається, а також на роботах зі створення in vitro генетично модифікованих клітин терато-(ембріо)-карциноми, за допомогою яких були отримані мутантні миші для біологічного моделювання спадкової патології людини.

Для виділення клітинних ліній терато-(ембріо)-карциноми було використано кондиціоноване суспензійне культивування. У культурі клітини терато-(ембріо)-карциноми, подібно до ембріо-стволових клітин (ЕСК), ростуть з утворенням ембріоїдних тілець і потребують обов'язкової дисоціації для перенесення лінії, збереження плюрипотентності на шарі-годівниці ембріональних фібробластів або під час суспензійного культивування в кондиціонованому середовищі. Клітини плюрипотентних ліній терато-(ембріо)-карциноми великі, сферичні, характеризуються високою активністю лужної фосфатази, утворюють агрегати та здатні до багатонаправленої диференціації. При введенні в бластоцисту вони агрегують з морулою, що призводить до утворення химерних ембріонів, у складі різних органів і тканин яких знаходяться похідні клітин терато-(ембріо)-карциноми. Однак переважна більшість таких химерних ембріонів гине внутрішньоутробно, а в органах новонароджених химер, що вижили, чужорідні клітини виявляються рідко та мають низьку щільність. Водночас різко зростає частота виникнення пухлин (фібросаркома, рабдоміосаркома, інші види злоякісних пухлин та аденома підшлункової залози), причому пухлинне переродження часто відбувається в період внутрішньоутробного розвитку химерних ембріонів.

Більшість клітин терато-(ембріо)-карциноми в мікрооточенні нормальних ембріональних клітин майже природно набувають злоякісних неопластичних характеристик. Вважається, що незворотна злоякісність зумовлена активацією протоонкогенів у процесі структурних перебудов. Одним із винятків є клітини лінії ембріокарциноми SST3, отримані з тератом яєчок миші (лінія 129/Sv-ter), які демонструють високу здатність до інтеграції в тканини та органи ембріона без подальшого утворення пухлини у химерних мишей. Похідні клітинних ліній терато-(ембріо)-карциноми у химерних мишей практично не беруть участі в утворенні первинних гоноцитів. Очевидно, це пов'язано з високою частотою хромосомних аберацій, характерних для більшості ліній терато-(ембріо)-карциноми, в клітинах яких спостерігаються як анеуплоїдія, так і хромосомні аномалії.

У лабораторних умовах було отримано кілька стабільних ліній клітин терато-(ембріо)-карциноми людини, що характеризуються плюрипотентністю, високою проліферативною активністю та здатністю до диференціації під час росту в культурах. Зокрема, лінія клітин терато-(ембріо)-карциноми людини NTERA-2 була використана для вивчення механізмів нейральної цитодиференціації. Після трансплантації клітин цієї лінії в субшлуночкову область переднього мозку новонароджених щурів спостерігалася їх міграція та нейрогенез. Були навіть спроби трансплантації нейронів, отриманих шляхом культивування клітин лінії терато-(ембріо)-карциноми NTERA-2, пацієнтам з інсультами, що, за даними авторів, призвело до покращення клінічного перебігу захворювання. Водночас не було зареєстровано випадків малігнізації трансплантованих клітин лінії терато-(ембріо)-карциноми NTERA-2 у пацієнтів з інсультом.

Перші лінії недиференційованих плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин миші були отримані на початку 1980-х років Евансом та Мартіном, які виділили їх з внутрішньої клітинної маси бластоцисти – ембріобласта. Ізольовані лінії ЕСК тривалий час зберігали плюрипотентність та здатність диференціюватися в різні типи клітин під впливом факторів у спеціальному культуральному середовищі.

Сам термін «ембріональна плюрипотентна стовбурова клітина» належить Лерою Стівенсу, який, вивчаючи вплив тютюнового дьогтю на частоту розвитку пухлини, звернув увагу на спонтанне виникнення тератокарциноми яєчок у лінійних (129/v) мишей контрольної групи. Клітини тератокарциноми яєчок характеризувалися високою швидкістю проліферації, а за наявності рідини з черевної порожнини вони спонтанно диференціювалися з утворенням нейронів, кератиноцитів, хондроцитів, кардіоміоцитів, а також фрагментів волосся та кісток, але без будь-яких ознак упорядкованої цитоархітектури відповідної тканини. При розміщенні в культурі клітини тератокарциноми росли як плюрипотентні клони, не прикріплені до субстрату, та утворювали ембріоїдні тільця, після чого припиняли поділ та зазнавали спонтанної невпорядкованої диференціації на нейрони, глію, м'язові клітини та кардіоміоцити. Стівенс виявив, що тератокарцинома миші 129/v містить менше 1% клітин, здатних диференціюватися в різноманітні спеціалізовані соматичні лінії, а сама диференціація залежить від факторів, які на них впливають (склад перитонеальної рідини, продукти зрілих клітин або тканин, доданих до культури). Гіпотеза Лероя Стівенсона про наявність ембріональних клітин-попередників зародкової лінії серед клітин тератокарциноми була підтверджена: суспензія клітин ембріобластів з преімплантаційних ембріонів у тканинах дорослих мишей утворювала тератокарциноми, а чисті клітинні лінії, виділені з них після внутрішньочеревного введення тваринам-реципієнтам, диференціювалися на нейрони, кардіоміоцити та інші соматичні клітини, отримані з усіх трьох зародкових шарів. В експериментах in vivo трансплантація ембріональних стволових клітин (отриманих з ембріобласта, але не трофобласта) ембріонам мишей іншої лінії на стадіях бластомерів 8-32 призводила до народження химерних тварин (без розвитку пухлин), в органах яких були виявлені паростки донорської тканини. Химеризм спостерігався навіть у лінії зародкових клітин.

Первинні статеві клітини-попередники, виділені з статевого зачатка ембріона миші, за морфологією, імунологічним фенотипом та функціональними характеристиками відповідали ембріональним стволовим клітинам (ЕСК), отриманим Стівенсоном з тератокарциноми та ембріобласта. У химер, народжених після введення ЕСК у бластоцисту, алофеновий морфогенез органів характеризувався мозаїчним чергуванням донорських та реципієнтних структурних та функціональних одиниць печінки, легень та нирок. У деяких випадках спостерігалося формування кишкових крипт або печінкових часточок, що складаються як з клітин реципієнта, так і з клітин донора. Однак морфогенез завжди реалізувався відповідно до генетичної програми виду, до якого належав реципієнт, а химеризм обмежувався виключно клітинним рівнем.

Тоді було встановлено, що проліферація ЕСК без цитодиференціації на шарі-живильнику клітин, отриманих з мезенхіми (фетальних фібробластів), відбувається за обов'язкової присутності LIF у селективних поживних середовищах, які вибірково забезпечують виживання лише стовбурових та клітин-попередників, тоді як переважна більшість спеціалізованих клітинних елементів гине. Використовуючи такі методи, у 1998 році Джеймс Томсон виділив п'ять імморталізованих ліній ембріональних стовбурових клітин із внутрішньої клітинної маси бластоцисти людини. У тому ж році Джон Герхарт розробив метод виділення безсмертних ліній ЕСК із генітального горбка чотири-п'ятитижневих ембріонів людини. Завдяки своїм унікальним властивостям, лише через два роки ембріональні стовбурові клітини та стовбурові клітини дефінітивних тканин почали використовуватися в практиці регенеративної медицини та генної терапії.