Мезенхімальні стовбурові клітини

Серед регіональних стовбурових клітин особливе місце займають мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), похідні яких складають стромальний матрикс усіх органів і тканин людського організму. Пріоритет у дослідженнях МСК належить представникам російської біологічної науки.

У середині минулого століття в лабораторії А. Фріденштейна вперше було виділено гомогенну культуру мультипотентних стромальних стовбурових клітин кісткового мозку. Мезенхімальні стовбурові клітини, прикріплені до субстрату, тривалий час зберігали високу інтенсивність проліферації, а в культурах з низькою щільністю посіву після фіксації на субстраті утворювали клони фібробластоподібних клітин, які не мали фагоцитарної активності. Припинення проліферації МСК завершувалося їх спонтанною диференціацією in vitro в клітини кісткової, жирової, хрящової, м'язової або сполучної тканини. Подальші дослідження дозволили встановити остеогенний потенціал фібробластоподібних клітин строми кісткового мозку різних видів ссавців, а також їх колонієутворюючу активність. Експерименти in vivo показали, що як гетеро-, так і ортотопічна трансплантація колонієутворюючих фібробластоподібних клітин призводить до утворення кісткової, хрящової, фіброзної та жирової тканини. Оскільки стромальні стовбурові клітини кісткового мозку характеризуються високою здатністю до самооновлення та багатогранною диференціацією в межах однієї клітинної лінії, їх називають мультипотентними мезенхімальними клітинами-попередниками.

Слід зазначити, що за 45 років фундаментальних досліджень мезенхімальних стовбурових клітин створені реальні умови для використання їх похідних у клінічній практиці.

Сьогодні немає сумнівів, що всі тканини людського організму формуються зі стовбурових клітин різних клітинних ліній в результаті процесів проліферації, міграції, диференціації та дозрівання. Однак донедавна вважалося, що стовбурові клітини в дорослому організмі є тканинноспецифічними, тобто здатні продукувати лінії спеціалізованих клітин лише тих тканин, в яких вони знаходяться. Це концептуальне положення було спростовано фактами трансформації гемопоетичних стовбурових клітин не лише в клітинні елементи периферичної крові, але й в овальні клітини печінки. Крім того, нейронні стовбурові клітини виявилися здатними давати початок як нейронам, так і гліальним елементам, а також ранньо коммітованим лініям гемопоетичних клітин-попередників. У свою чергу, мезенхімальні стовбурові клітини, які зазвичай продукують клітинні елементи кісткової, хрящової та жирової тканини, здатні трансформуватися в нейронні стовбурові клітини. Передбачається, що в процесі росту, фізіологічної та репаративної регенерації тканин некомітовані клітини-попередники генеруються з тканинно-неспецифічних стовбурових резервів. Наприклад, відновлення м'язової тканини може бути здійснене завдяки міграції мезенхімальних стовбурових клітин з кісткового мозку до скелетних м'язів.

Хоча така перехресна взаємозамінність стовбурових клітин визнається не всіма дослідниками, можливість клінічного використання мезенхімальних стовбурових клітин як джерела для клітинної трансплантації та клітинного вектора генетичної інформації вже ніким не заперечується, як і мультипотентність стромальних стовбурових клітин кісткового мозку, які можна відносно легко виділити та розмножити в культурі in vitro. Водночас у науковій літературі продовжують з'являтися повідомлення про потенційну плюрипотентність стромальних стовбурових клітин кісткового мозку. Як доказ наводяться протоколи досліджень, у яких під впливом специфічних індукторів трансдиференціації МСК трансформуються в нервові клітини, кардіоміоцити та гепатоцити. Однак деякі вчені мають серйозні сумніви щодо можливості повторної активації та експресії генів з періоду раннього ембріогенезу. Водночас усім зрозуміло, що якщо будуть знайдені умови для розширення мультипотентності мезенхімальних стовбурових клітин до плюрипотентності ЕСК, багато етичних, моральних, релігійних та правових проблем у регенеративній пластичній медицині будуть автоматично вирішені. Крім того, оскільки в цьому випадку джерелом регенеративного стовбурового потенціалу стають аутологічні стромальні клітини пацієнта, вирішується також проблема імунного відторгнення клітинного трансплантата. Найближче майбутнє покаже, наскільки реалістичними є ці перспективи.

[ 1 ], [ 2 ]

Використання мезенхімальних стовбурових клітин у медицині

У клініці використання похідних мезенхімальних стовбурових клітин пов'язане, перш за все, з відновленням дефектів тканин, що виникають при великих та глибоких термічних ураженнях шкіри. На доклінічному етапі було проведено експериментальну оцінку доцільності використання алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин для лікування глибоких опіків. Було показано, що фібробластоподібні мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку утворюють моношар у культурі, що дає можливість проводити їх трансплантацію для оптимізації процесів регенерації глибоких опікових ран. Автори зазначають, що ембріональні фібробласти мають подібну властивість, але їх клінічне використання обмежене існуючими етичними та правовими проблемами. Глибокий термічний опік з пошкодженням усіх шарів шкіри було змодельовано на щурах Вістар. Площа опіку становила 18-20% від загальної поверхні шкіри. Першу експериментальну групу склали щури з глибоким термічним опіком та трансплантацією алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин. Другу групу склали тварини з глибоким термічним опіком та трансплантацією алогенних ембріональних фібробластів. Третю групу представляли контрольні щури з глибоким термічним опіком, які не зазнали клітинної терапії. Суспензію фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин та ембріональних фібробластів наносили на поверхню опікової рани за допомогою піпетки в кількості 2 x 10⁴ ^.клітини на 2-й день після моделювання опіку та видалення утвореного некротичного струпа. Після трансплантації клітин поверхню опіку накривали марлевою серветкою, змоченою ізотонічним розчином натрію хлориду з гентаміцином. Клітини кісткового мозку збирали для отримання МСК з подальшою їх індукцією в лінію фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин дорослих щурів Вістар зі стегнових кісток. Ембріональні фібробласти отримували з легень 14-17-денних ембріонів. Ембріональні фібробласти та клітини кісткового мозку для отримання МСК попередньо культивували в чашках Петрі при температурі 37°C в CO2-інкубаторі, в атмосфері з 5% CO2 при 95% вологості. Ембріональні фібробласти культивували протягом 4-6 днів, тоді як для формування моношару МСК потрібно було від 14 до 17 днів. Згодом МСК були кріоконсервовані як вихідний матеріал для фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин, які отримували шляхом розморожування та культивування МСК протягом 4 днів. Кількість утворених фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин була більш ніж у 3 рази більшою, ніж кількість ембріональних фібробластів, утворених протягом того ж періоду культивування. Для ідентифікації трансплантованих клітин в опікових ранах на етапі культивування їх геном мічили за допомогою вірусного човникового вектора на основі рекомбінантного аденовірусу типу V, що несе ген 1ac-2, що кодує β-галактозидазу E. coli. Живі клітини в різні терміни після трансплантації виявляли імуногістохімічно в кріозрізах з додаванням субстрату X-Gal, що дає характерне синьо-зелене забарвлення. В результаті динамічної візуальної, планіметричної та гістологічної оцінки стану опікової рани було встановлено, що вже на 3-й день після трансплантації клітин у відібраних групах з'являються суттєві відмінності в перебігу ранового процесу. Ця різниця стала особливо виразною на 7-й день після трансплантації клітин. У тварин першої групи, яким було пересаджено фібробластоподібні мезенхімальні стовбурові клітини, рана набула рівномірного інтенсивного рожевого кольору, грануляційна тканина розросла по всій її площі до рівня епідермісу, а поверхня опіку значно зменшилася в розмірах. Колагенова плівка, що утворилася на поверхні рани, дещо стоншилася, але продовжувала покривати всю площу опіку. У тварин другої групи, яким було пересаджено ембріональні фібробласти, грануляційна тканина піднялася до рівня епідермісу країв рани, але лише місцями, при цьому плазморея з рани була інтенсивнішою, ніж у 1-й групі, а початково утворена колагенова плівка практично зникла. У тварин, які не отримували клітинної терапії, на 7-й день опікова рана була блідою, ямковою, некротичною тканиною, покритою фібрином. Плазморея відзначалася по всій поверхні опіку. Гістологічно у тварин 1-ї та 2-ї груп спостерігалося зменшення клітинної інфільтрації та розвиток судинної мережі,і ці ознаки починаючогося регенеративного процесу були більш виражені у щурів 1-ї групи. У контрольній групі спостерігалися ознаки клітинної інфільтрації рани, гістологічна картина новоутворених судин була відсутня. На 15-30-й день спостереження площа поверхні опіку у тварин 1-ї групи була значно меншою, ніж у щурів інших груп, а гранулююча поверхня була більш розвиненою. У тварин 2-ї групи площа поверхні опіку також зменшилася порівняно з розмірами опікових ран у щурів контрольної групи, що сталося внаслідок крайової епітелізації. У контрольній групі поверхня опіку залишалася місцями блідою з рідкісними грануляціями, на ній з'являлися судинні зірочки, були острівці фібринозного нальоту, помірна плазморея продовжувалася по всій поверхні опіку, а місцями залишався струп, який важко відділявся. Загалом у тварин 3-ї групи розмір рани також зменшився, але краї рани залишалися підритими.

Таким чином, під час порівняльного дослідження швидкості загоєння ран з використанням фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин та ембріональних фібробластів, а також без застосування клітинної терапії, було відзначено прискорення швидкості загоєння поверхні опіку в результаті трансплантації фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин та ембріональних фібробластів. Однак у випадку використання алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин швидкість загоєння ран була вищою, ніж при трансплантації ембріональних фібробластів. Це виражалося в прискоренні зміни фаз регенеративного процесу - скорочувалися терміни клітинної інфільтрації, збільшувалася швидкість росту судинної мережі, а також утворення грануляційної тканини.

Результати динамічної планіметрії свідчать про те, що швидкість спонтанного загоєння опікової рани (без застосування клітинної терапії) була найнижчою. На 15-й та 30-й дні після трансплантації алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин швидкість загоєння рани була вищою, ніж при трансплантації ембріональних фібробластів. Гістохімічний метод виявлення бета-галактозидази показав, що після трансплантації фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин та ембріональних фібробластів трансплантовані клітини залишаються життєздатними на поверхні та в глибині регенеруючих ран протягом усього періоду спостереження. Автори вважають, що вища швидкість регенерації опікової рани з використанням фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин зумовлена вивільненням біологічно активних факторів росту цими клітинами в процесі дозрівання.

Трансплантація ауто- або алогенних кератиноцитів та алогенних фібробластів для лікування опікових ран також знайшла застосування в клінічній практиці. Слід зазначити, що хірургічне лікування дітей з великими глибокими опіками є складним завданням через високу травматичність та багаторазові хірургічні втручання, значну крововтрату та різні реакції на використовувані інфузійні середовища. Основні труднощі у проведенні шкірно-пластичних операцій при великих глибоких опіках, площею понад 40% поверхні тіла, пов'язані з тяжкістю стану постраждалих та відсутністю донорських шкірних ресурсів. Використання сітчастих трансплантатів з високим коефіцієнтом перфорації не вирішує проблему, оскільки клітини, що утворюються після перфорації, епітелізуються дуже повільно, а самі шкірні клапті часто лізуються або висихають. Такі покриття опікових ран, як ксеношкіра, трупні алотрансплантати, синтетичні плівкові покриття, не завжди достатньо ефективні, тому розробляються нові методи покриття поверхонь опіків шарами культивованих кератиноцитів та фібробластів. Зокрема, запропоновано метод покриття опікових поверхонь за допомогою культивованих алофібробластів, які при пересадці мають виражений стимулюючий вплив на проліферацію епідермоцитів, що збереглися в рані при прикордонних опіках, а також кератиноцитів у перегородках сітчастих трансплантатів. У роботі Л. Будкевич та співавторів (2000) представлені результати використання цього методу для лікування опіків у дітей. У дослідженні взяли участь 31 дитина з термічною травмою віком від 1 року до 14 років. У трьох дітей загальна площа опікових ран IIIA-B - IV ступенів становила 40%, у 25 - 50-70%, ще у трьох - 71-85% поверхні тіла. Рання хірургічна некректомія поєднувалася з пересадкою культивованих алофібробластів та аутодермопластикою. Перший етап лікування включав видалення некротичних тканин, другий етап – трансплантацію культивованих алофібробластів на плівки-носії, а третій етап (через 48 годин після трансплантації культивованих алофібробластів) – видалення матриксу та аутодермопластику шкірними клаптями зі співвідношенням перфорації 1:4. Трьом пацієнтам, які надійшли до клініки з тяжкою опіковою хворобою, культивовані алофібробласти були пересаджені на гранулюючі рани. Трансплантацію культивованих алофібробластів проводили один раз у 18 дітей, двічі у 11 дітей та тричі у двох пацієнтів. Площа поверхні рани, покритої клітинною культурою, коливалася від 30 до 3500 см2. Ефективність культивованих алофібробластів оцінювали за загальним відсотком приживлення шкірного трансплантата, часом загоєння опіків та кількістю летальних випадків від тяжкої термічної травми. Приживлення трансплантата було повним у 86% пацієнтів. Часткове неприживлення шкірних трансплантатів відзначалося у 14% випадків. Незважаючи на лікування, шестеро (19,3%) дітей померли. Загальна площа ураження шкіри у них коливалася від 40 до 70% поверхні тіла.Трансплантація культивованих алофібробластів не була пов'язана зі смертністю при опіковій травмі у жодного пацієнта.

Аналізуючи результати лікування, автори зазначають, що раніше глибокі термічні пошкодження шкіри, що охоплювали 35-40% поверхні тіла, вважалися несумісними з життям (для дітей молодшого віку – до 3 років – критичними є глибокі опіки, що охоплювали 30% поверхні тіла, для дітей старшого віку – понад 40% поверхні тіла). При проведенні хірургічної некректомії з трансплантацією культивованих алофібробластів та подальшою аутодермопластикою шкірними клаптями з високим коефіцієнтом перфорації опіки IIIB – IV ступеня залишаються критичними, але наразі є перспективи порятунку життя навіть таких постраждалих у багатьох випадках. Хірургічна некректомія в поєднанні з трансплантацією культивованих алофібробластів та аутодермопластикою у дітей з глибокими опіками виявилася особливо ефективною у пацієнтів з поширеними ураженнями шкіри з дефіцитом донорських ділянок. Активна хірургічна тактика та трансплантація культивованих алофібробластів сприяють швидкій стабілізації загального стану таких пацієнтів, зменшенню кількості інфекційних ускладнень опікової хвороби, створенню сприятливих умов для приживлення трансплантатів, скороченню часу відновлення втраченої шкіри та тривалості стаціонарного лікування, зменшенню частоти летальних випадків у постраждалих з обширними опіками. Таким чином, трансплантація культивованих алофібробластів з подальшою аутодермопластикою шкірними клаптями дозволяє досягти одужання у дітей з важкими опіками, яких раніше вважали приреченими.

Загальновизнано, що першочерговим завданням лікування опікової хвороби є максимально повне та швидке відновлення пошкодженої шкіри для запобігання токсичній дії, інфекційним ускладненням та зневодненню. Результати використання культивованих клітин значною мірою залежать від готовності самої опікової рани до трансплантації. У випадках трансплантації культивованих кератиноцитів на поверхню рани після хірургічної некректомії приживається в середньому 55% (за площею) пересаджених клітин, тоді як при гранулюючих ранах коефіцієнт приживлення знижується до 15%. Тому успішне лікування великих глибоких опіків шкіри вимагає, перш за все, активної хірургічної тактики. За наявності опікових ран IIIB-IV ступеня поверхню опіку негайно звільняють від некротичної тканини, щоб зменшити інтоксикацію та зменшити кількість ускладнень опікової хвороби. Використання такої тактики є запорукою скорочення часу від моменту отримання опіку до закриття ран та тривалості перебування пацієнтів з великими опіками в стаціонарі, а також значно зменшує кількість летальних наслідків.

Перші повідомлення про успішне використання культивованих кератиноцитів для покриття опікових поверхонь з'явилися на початку 1980-х років. Згодом цю маніпуляцію проводили з використанням шарів культивованих кератиноцитів, найчастіше отриманих з аутоклітин, значно рідше з алокератиноцитів. Однак технологія аутокератиноцитопластики не дозволяє створити банк клітин, тоді як час, необхідний для виготовлення трансплантата кератиноцитів достатньої площі, є тривалим і становить 3-4 тижні. У цей період різко зростає ризик розвитку інфекційних та інших ускладнень опікової хвороби, що значно подовжує загальний час перебування пацієнтів у стаціонарі. Крім того, аутокератиноцити практично не приживаються при пересадці на гранулюючі опікові рани, а висока вартість спеціальних ростових середовищ та біологічно активних стимуляторів росту кератиноцитів значно обмежує їх клінічне використання. Інші біотехнологічні методи, такі як колагенопластика, трансплантація кріоконсервованої ксеношкіри та використання різних біополімерних покриттів, підвищують ефективність лікування великих поверхневих, але не глибоких опіків. Метод покриття поверхні рани культивованими фібробластами принципово відрізняється тим, що як основний компонент шару культивованих клітин використовуються саме фібробласти, а не кератиноцити.

Передумовою для розробки методу стали дані про те, що перицити, що оточують дрібні судини, є прогениторними мезенхімальними клітинами, здатними трансформуватися у фібробласти, що продукують багато факторів росту та забезпечують загоєння ран завдяки сильному стимулюючому впливу на проліферацію та адгезію кератиноцитів. Використання культивованих фібробластів для закриття ранових поверхонь одразу виявило ряд суттєвих переваг цього методу порівняно з використанням культивованих кератиноцитів. Зокрема, отримання фібробластів у культурі не потребує використання спеціальних поживних середовищ та стимуляторів росту, що знижує вартість трансплантата більш ніж у 10 разів порівняно з вартістю отримання кератиноцитів. Фібробласти легко пасивуються, під час чого вони частково втрачають поверхневі антигени гістосумісності, що, у свою чергу, відкриває можливість використання алогенних клітин для виготовлення трансплантатів та створення їх банків. Час, необхідний для отримання трансплантатів, готових до використання в клініці, скорочується з 3 тижнів (для кератиноцитів) до 1-2 днів (для фібробластів). Первинну культуру фібробластів можна отримати шляхом культивування клітин з фрагментів шкіри, взятих під час аутодермопластики, а щільність посіву клітин для отримання субкультур фібробластів людини становить лише 20 x 10³ ^на 1 ^см².

З метою вивчення впливу фібробластів та їх регуляторних білків на проліферацію та диференціацію кератиноцитів було проведено порівняльний аналіз морфології та проліферації кератиноцитів на субстратах колагену I та III типів, а також фібронектину у спільній культурі з людськими фібробластами. Людські кератиноцити були виділені з фрагментів шкіри пацієнтів з опіками, взятих під час аутодермопластики. Щільність посіву кератиноцитів становила 50 x 10³ клітин на 1 см². Клінічну ефективність трансплантації культивованих фібробластів оцінювали у 517 пацієнтів. Всіх пацієнтів розділили на дві групи: 1 група - дорослі постраждалі з опіками IIA, B - IV ступеня; 2 група - діти з глибокими опіками IIIB - IV ступеня. Оцінка динаміки структурно-функціональної організації моношарових культуральних фібробластів з урахуванням ролі глікозаміногліканів, фібронектину та колагену в процесах регенерації дозволила авторам визначити 3-тю добу як найсприятливіший період для використання культур фібробластів для виготовлення трансплантатів. Дослідження впливу фібробластів на проліферацію та диференціацію кератиноцитів показало, що фібробласти in vitro мають виражений стимулюючий ефект, перш за все, на процеси адгезії кератиноцитів, збільшуючи кількість прикріплених клітин та швидкість їх фіксації більш ніж у 2 рази. Стимуляція процесів адгезії супроводжується збільшенням інтенсивності синтезу ДНК та рівня проліферації кератиноцитів. Крім того, виявилося, що наявність фібробластів та утвореного ними позаклітинного матриксу є необхідною умовою для формування тонофібрилярного апарату кератиноцитів, міжклітинних зв'язків і, зрештою, для диференціації кератиноцитів та формування базальної мембрани. При лікуванні дітей з глибокими опіками встановлено високу клінічну ефективність трансплантації культури алофібробластів, особливо в групі пацієнтів з обширними ураженнями шкіри в умовах дефіциту донорської ділянки. Комплексне морфофункціональне дослідження показало, що фібробласти трансплантата характеризуються активним синтезом ДНК, а також колагену, фібронектину та глікозаміногліканів, які входять до складу позаклітинного матриксу, утвореного клітинами. Автори вказують на високий відсоток приживлення трансплантованих фібробластів (до 96%), різке скорочення часу їх отримання (протягом 24-48 годин замість 2-3 тижнів у випадку використання кератиноцитів), значне прискорення епітелізації поверхні опіку, а також значне зниження вартості (у 10 разів) технології вирощування трансплантата з фібробластів порівняно з трансплантацією кератиноцитів. Використання трансплантації культивованих алофібробластів дає змогу рятувати життя дітей з критичними опіками – термічним пошкодженням понад 50% поверхні тіла,що раніше вважалося несумісним з життям. Слід зазначити, що за допомогою трансплантації алогенних ембріональних фібробластів переконливо доведено не лише швидшу регенерацію ран та одужання пацієнтів з різним ступенем та площею опіків, але й значне зниження їхньої смертності.

Аутологічні фібробласти також використовуються в такій складній галузі пластичної хірургії, як реконструктивна корекція пошкоджень голосових зв'язок. Для цієї мети зазвичай використовується бичачий колаген, тривалість дії якого обмежена його імуногенністю. Будучи чужорідним білком, бичачий колаген чутливий до колагенази реципієнта та може викликати імунні реакції, для зменшення ризику яких були розроблені технології отримання колагенових препаратів, зшитих глутаральдегідом. Їх перевага полягає в більшій стабільності та меншій імуногенності, що знайшло практичне застосування в усуненні дефектів та атрофії голосових зв'язок. Ін'єкції аутологічного колагену вперше були застосовані в 1995 році. Методика забезпечила збереження первинної структури аутологічних колагенових волокон, включаючи внутрішньомолекулярні ферментативно каталізовані зшивання. Річ у тім, що природні колагенові волокна більш стійкі до руйнування протеазами, ніж відновлений колаген, в якому телопептиди розрізані. Цілісність телопептидів важлива для четвертинної структури колагенових волокон та утворення зшивок між сусідніми молекулами колагену. На відміну від препаратів бичачого колагену, аутологічний колаген не викликає імунних реакцій у реципієнта, але він недостатньо ефективний як поповнювальний агент. Стабільної корекції можна досягти шляхом локального вироблення колагену шляхом трансплантації аутологічних фібробластів. Однак під час дослідження ефективності аутологічної трансплантації фібробластів у клініці були виявлені певні труднощі. У ранньому періоді після трансплантації фібробластів клінічний ефект був слабшим порівняно з таким після введення бичачого колагену. При культивуванні аутологічних фібробластів не можна виключати можливість трансформації нормальних фібробластів у патологічні, так звані міофібробласти, відповідальні за розвиток фіброзу та утворення рубців, про що свідчить скорочення колагенового гелю, спричинене специфічною взаємодією фібробластів та колагенових фібрил. Крім того, після серійного пасажування in vitro фібробласти втрачають здатність синтезувати білки позаклітинного матриксу.

Однак, зараз експериментально розроблено метод культивування аутологічних фібробластів людини, який усуває вищезазначені недоліки та не призводить до онкогенної трансформації нормальних фібробластів. Аутологічні фібробласти, отримані за допомогою цього методу, використовуються для відновлення дефектів м’яких тканин обличчя. У дослідженні Г. Келлера та ін. (2000) було проведено лікування 20 пацієнтів віком від 37 до 61 року зі зморшками та атрофічними рубцями. Біопсії шкіри (4 мм) з ретроаурикулярної області транспортували до лабораторії у стерильних пробірках, що містили 10 мл живильного середовища (середовище Ігла з антибіотиком, мікосептиком, піруватом та фетальною телячою сироваткою). Матеріал поміщали всередину 3-5 культуральних чашок діаметром 60 мм та інкубували в термостаті з атмосферою, що містить 5% CO2. Через 1 тиждень клітини видаляли з чашок трипсинізацією та поміщали у флакони об’ємом 25 см2. Клітини вводили пацієнтам у кількості 4 x 107. Значний та стійкий клінічний ефект спостерігався у пацієнтів під час корекції носогубних складок, а також у пацієнтів зі шрамами через 7 та 12 місяців після третьої трансплантації аутологічних фібробластів. За даними проточної цитометрії, культивовані фібробласти продукували велику кількість колагену I типу. Дослідження in vitro показали нормальну скоротливість введених фібробластів. Через два місяці після підшкірного введення культивованих фібробластів у дозі 4 x 107 клітин у голих мишей пухлини не виявлено. Введені фібробласти не викликали рубцювання або дифузного фіброзу у пацієнтів. За словами автора, приживлені аутологічні фібробласти здатні постійно виробляти колаген, що забезпечить косметичний ефект омолодження. Водночас, оскільки термін життя диференційованих клітин обмежений, фібробласти, взяті у молодого пацієнта, є більш ефективними, ніж ті, що отримані у людей похилого віку. У майбутньому передбачається можливість кріоконсервації культури фібробластів, взятих у молодого донора, для подальшої пересадки власних молодих клітин пацієнту похилого віку. На завершення, не зовсім коректно робити висновок, що аутологічні фібробласти, за умови їх функціональної збереженості, є ідеальним засобом корекції дефектів м’яких тканин обличчя. Водночас сам автор зазначає, що під час дослідження виникали деякі проблемні ситуації, пов’язані з використанням аутологічної системи фібробласт-колаген. Клінічний ефект часто був слабшим, ніж при використанні бичачого колагену, що викликало розчарування у пацієнтів.

Загалом, дані літератури щодо перспектив клінічного використання мезенхімальних стовбурових клітин виглядають досить оптимістичними. Здійснюються спроби використання аутологічних мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку для лікування дегенеративних уражень суглобів. Проводяться перші клінічні випробування використання культивованих мезенхімальних клітин-попередників у лікуванні складних переломів кісток. Ауто- та алогенні мезенхімальні стромальні клітини кісткового мозку використовуються для створення хрящової тканини для трансплантації при корекції дефектів суглобового хряща внаслідок травм або аутоімунних уражень. Розробляються методи клінічного використання мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників для усунення дефектів кісток у дітей з тяжкою формою неповного остеогенезу, спричиненого мутаціями в гені колагену I типу. Після мієлоабляції дітям-реципієнтам трансплантують кістковий мозок від HLA-сумісних здорових донорів, оскільки нефракціонований кістковий мозок може містити достатню кількість мезенхімальних стовбурових клітин для компенсації тяжкого дефекту кістки. Після трансплантації алогенного кісткового мозку у таких дітей спостерігаються позитивні гістологічні зміни трабекулярних кісток, збільшення темпів росту та зменшення частоти переломів кісток. У деяких випадках позитивний клінічний результат досягається шляхом трансплантації близькоспоріднених алогенних кісткових мозків та остеобластів. Трансплантація МСК також використовується для лікування вродженої крихкості кісток, спричиненої дисбалансом остеобластів та остеокластів у кістковій тканині. У цьому випадку відновлення кісткоутворення досягається шляхом химеризації пулу стовбурових та прогениторних стромальних клітин у кістковій тканині пацієнтів.

Продовжується вдосконалення методів генетичної модифікації донорських мезенхімальних стовбурових клітин з метою корекції генетичних дефектів стромальних тканин. Передбачається, що найближчим часом мезенхімальні клітини-попередники будуть використовуватися в неврології для цілеспрямованої химеризації клітин мозку та створення здорового пулу клітин, здатних генерувати дефіцитний фермент або фактор, відповідальний за клінічні прояви захворювання. Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин може бути використана для відновлення строми кісткового мозку у онкологічних хворих після променевої та хіміотерапії, а в поєднанні з клітинами кісткового мозку - для відновлення кровотворення. Розвитку замісної терапії, спрямованої на усунення дефектів опорно-рухового апарату за допомогою МСК, сприяють інженерні розробки в галузі проектування матричних біоматеріалів або біоміметиків, що утворюють каркаси, заселені потомством мезенхімальних стовбурових клітин.

Джерела мезенхімальних стовбурових клітин

Основним джерелом мезенхімальних стовбурових клітин є кістковий мозок, гемопоетичні стовбурові клітини якого в організмі ссавців постійно диференціюються в клітини крові та імунної системи, тоді як мезенхімальні стовбурові клітини представлені невеликою популяцією фібробластоподібних клітин строми кісткового мозку та сприяють збереженню недиференційованого стану гемопоетичних стовбурових клітин. За певних умов мезенхімальні стовбурові клітини диференціюються в клітини хрящової та кісткової тканин. При посіві на культуральне середовище в умовах низької щільності посіву мононуклеарні стромальні клітини кісткового мозку утворюють колонії адгезивних клітин, які, по суті, є фібробластоподібними мультипотентними мезенхімальними клітинами-попередниками. Деякі автори вважають, що в кістковому мозку відкладаються некоммітовані мезенхімальні стовбурові клітини, які завдяки своїй здатності до самооновлення та високому потенціалу диференціації забезпечують усі тканини організму мезенхімальними попередниками стромальних елементів протягом усього життя організму ссавців.

У кістковому мозку стромальні клітинні елементи утворюють мережу, що заповнює простір між синусоїдами та кістковою тканиною. Вміст сплячих МСК у кістковому мозку дорослої людини порівнянний з кількістю гемопоетичних стовбурових клітин і не перевищує 0,01-0,001%. Мезенхімальні стовбурові клітини, виділені з кісткового мозку та не піддані культивуванню, позбавлені молекул адгезії. Такі МСК не експресують CD34, ICAM, VCAM, колаген I та III типів, CD44 та CD29. Отже, in vitro на культуральному субстраті фіксуються не мезенхімальні стовбурові клітини, а більш досконалі прогениторні похідні мезенхімальних стовбурових клітин, які вже сформували компоненти цитоскелету та рецепторний апарат молекул клітинної адгезії. Стромальні клітини з фенотипом CD34 виявляються навіть у периферичній крові, хоча в кістковому мозку їх значно менше, ніж CD34-позитивних мононуклеарних клітин. CD34-клітини, виділені з крові та перенесені в культуру, прикріплюються до субстрату та утворюють колонії фібробластоподібних клітин.

Відомо, що в ембріональному періоді стромальна основа всіх органів і тканин ссавців і людини виникає із спільного пулу мезенхімальних стовбурових клітин до та на стадії органогенезу. Тому вважається, що у зрілому організмі більшість мезенхімальних стовбурових клітин повинна знаходитися у сполучній та кістковій тканині. Встановлено, що основна частина клітинних елементів строми пухкої сполучної та кісткової тканини представлена коммітованими клітинами-попередниками, які, однак, зберігають здатність до проліферації та утворення клонів in vitro. При введенні таких клітин у загальний кровотік понад 20% мезенхімальних клітин-попередників імплантуються серед стромальних елементів кровотворної тканини та паренхіматозних органів.

Потенційним джерелом мезенхімальних стовбурових клітин є жирова тканина, серед стовбурових клітин якої виявлено адипоцити-попередники, коммітовані різною мірою. Найменш зрілими прогениторними елементами жирової тканини є стромально-судинні клітини, які, подібно до мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку, здатні диференціюватися в адипоцити під впливом глюкокортикоїдів, інсуліноподібного фактора росту та інсуліну. У культурі стромально-судинні клітини диференціюються в адипоцити та хондроцити, а в жировій тканині кістковомозкового походження є клітини, що утворюють адипоцити та остеобласти.

Стромальні стовбурові клітини також були виявлені в м'язах. У первинній культурі клітин, виділених зі скелетних м'язів людини, виявляються зірчасті клітини та багатоядерні міотуби. У присутності кінської сироватки крові зірчасті клітини проліферують in vitro без ознак цитодиференціації, а після додавання дексаметазону до живильного середовища їх диференціація характеризується появою клітинних елементів з фенотипом клітин скелетних та гладких м'язів, кісткової, хрящової та жирової тканин. Отже, в м'язовій тканині людини присутні як коммітовані, так і некомітовані мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники. Було показано, що популяція клітин-попередників, присутніх у скелетних м'язах, походить від некомітованих мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку та відрізняється від міогенних клітин-сателітів.

У міокарді новонароджених щурів також були виявлені адгезивні зірчасті клітини, що відповідають мультипотентним мезенхімальних клітинам-попередникам за потенціалом диференціації, оскільки під впливом дексаметазону вони диференціюються в адипоцити, остеобласти, хондроцити, гладком'язові клітини, міотуби скелетних м'язів та кардіоміоцити. Було показано, що гладком'язові клітини судин (перицити) є похідними недиференційованих периваскулярних мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників. У культурі периваскулярні мезенхімальні стовбурові клітини експресують α-актин гладких м'язів та рецептор тромбоцитарного фактора росту і здатні диференціюватися принаймні в гладком'язові клітини.

Особливе місце, з точки зору резервів стовбура, займає хрящова тканина, надзвичайно низький репаративний потенціал якої, як вважають, зумовлений дефіцитом мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників або факторів диференціації та росту. Передбачається, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники, попередньо задіяні в хондро- та остеогенезі, потрапляють у хрящову тканину з інших тканинних джерел.

Тканинне походження та умови фіксації мезенхімальних клітин-попередників у сухожиллях також не встановлені. Експериментальні спостереження свідчать про те, що в ранньому постнатальному періоді клітини ахіллового сухожилля кроликів у первинних культурах та при першому пасажі зберігають експресію колагену I типу та декорину, але при подальшому культивуванні втрачають маркери диференціації теноцитів.

Слід зазначити, що відповідь на питання, чи мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники, локалізовані в різних тканинах, насправді постійно присутні в їхній стромі, чи тканинний пул мезенхімальних стовбурових клітин поповнюється за рахунок міграції стромальних стовбурових клітин кісткового мозку, досі не отримана.

Окрім кісткового мозку та інших зон мезенхімальної тканини дорослого організму, пуповинна кров може бути ще одним джерелом МСК. Показано, що кров з пуповинної вени містить клітини, які мають подібні морфологічні та антигенні характеристики з мультипотентними мезенхімальними клітинами-попередниками, здатні до адгезії та не поступаються мультипотентним мезенхімальним клітинам-попередникам кістковомозкового походження за потенціалом диференціації. У культурах мезенхімальних стовбурових клітин пуповинної крові було виявлено від 5 до 10% некоммітованих мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників. Виявилося, що їх кількість у пуповинній крові обернено пропорційна гестаційному віку, що опосередковано вказує на міграцію мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників до різних тканин під час внутрішньоутробного розвитку. З'явилася перша інформація про клінічне використання мезенхімальних стовбурових клітин, виділених з пуповинної крові, а також отриманих з ембріонального біоматеріалу, що базується на відомій здатності фетальних стовбурових клітин до інтеграції, приживлення та функціонування в органах і тканинних системах дорослих реципієнтів.

Пошук нових джерел мезенхімальних стовбурових клітин

Використання мезенхімальних стовбурових клітин ембріонального походження, як і інших фетальних клітин, створює низку етичних, правових, судових та законодавчих проблем. Тому пошук позаембріонального донорського клітинного матеріалу триває. Спроба клінічного використання фібробластів шкіри людини виявилася невдалою, що було зумовлено не лише високою фінансовою спроможністю технології, але й швидкою диференціацією фібробластів у фіброцити, які мають значно нижчий проліфераційний потенціал та продукують обмежену кількість факторів росту. Подальший прогрес у вивченні біології МСК та мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку дозволив розробити стратегію клінічного використання аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин. Технологія їх виділення, культивування, розмноження ex vivo та цілеспрямованої диференціації вимагала, перш за все, вивчення спектру молекулярних маркерів МСК. Їх аналіз показав, що первинні культури кісткової тканини людини містять кілька типів мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників. Фенотип проостеобластів було виявлено в клітинах, що експресують маркер стромальних клітин-попередників STRO-1, але не несуть маркера остеобластів – лужної фосфатази. Такі клітини характеризуються низькою здатністю до формування мінералізованої кісткової матриці, а також відсутністю експресії остеопонтину та рецепторів паратиреоїдного гормону. Похідні STRO-1-позитивних клітин, що не експресують лужну фосфатазу, представлені проміжно та повністю диференційованими остеобластами. Було виявлено, що клітинні елементи клонованих ліній STRO-1-позитивних клітин трабекулярної кістки людини здатні диференціюватися в зрілі остеоцити та адипоцити. Напрямок диференціації цих клітин залежить від впливу поліненасичених жирних кислот, прозапальних цитокінів – IL-1b та фактора некрозу пухлини a (TNF-a), а також протизапального та імуносупресивного TGF-b.

Пізніше було виявлено, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники не мають специфічного фенотипу, властивого лише їм, але експресують комплекс маркерів, характерних для мезенхімальних, ендотеліальних, епітеліальних та м'язових клітин за відсутності експресії імунофенотипових антигенів гемопоетичних клітин – CD45, CD34 та CD14. Крім того, мезенхімальні стовбурові клітини конститутивно та індуцибельно продукують гемопоетичні та негемопоетичні фактори росту, інтерлейкіни та хемокіни, а рецептори для деяких цитокінів та факторів росту експресуються на мультипотентних мезенхімальних клітинах-попередниках. Серед клітин стромального матриксу організму людини виявлені сплячі, або клітини, що перебувають у стані спокою, з імунофенотипом, майже ідентичним антигенному профілю мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників, необроблених 5-фторурацилом – обидві клітини експресують CD117, що позначає «дорослі» стовбурові клітини.

Таким чином, клітинний маркер, унікальний для мезенхімальних стовбурових клітин, ще не ідентифікований. Вважається, що спокійні клітини являють собою популяцію некоммітованих мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників, оскільки вони не експресують маркери клітин, коммітованих до остео- (Cbfa-1) або адипогенезу (PPAR-γ-2). Тривалий вплив фетальної бичачої сироватки на повільно проліферуючі спокійні клітини призводить до утворення термінально диференціюютьсячих коммітованих клітин-попередників, що характеризуються швидким ростом. Клональна експансія таких мезенхімальних стовбурових клітин підтримується FGF2. Здається, що геном стромальних стовбурових клітин досить щільно «закритий». Є повідомлення про відсутність спонтанної диференціації в МСК – без спеціальних умов для коммітації вони не трансформуються навіть у клітини мезенхімального ряду.

Для вивчення популяційної структури похідних мезенхімальних стовбурових клітин проводиться пошук маркерних білків диференціації на стромальних клітинних лініях та в первинних культурах. Клональний аналіз колонієутворюючих клітин кісткового мозку in vitro показав, що EGF збільшує середній розмір колонії та зменшує клональну експресію лужної фосфатази при нанесенні на первинні культури, тоді як додавання гідрокортизону активує експресію лужної фосфатази, яка є маркером остеогенного напрямку диференціації МСК. Моноклональні антитіла до STRO-1 дозволили відокремити та вивчити популяцію STRO-1-позитивних адгезивних клітин у гетерогенній системі культур Декстера. Визначено спектр цитокінів, які регулюють не тільки проліферацію та диференціацію гемопоетичних та лімфоїдних клітин, але й беруть участь у формуванні, формуванні та резорбції тканин скелета через пара-, ауто- та ендокринні механізми. Рецептор-опосередковане вивільнення таких вторинних месенджерів, як цАМФ, діацилгліцерол, інозитолтрифосфат та Ca2+, також використовується для маркерного аналізу різних категорій клітин стромальної тканини, що експресують відповідні рецептори. Використання моноклональних антитіл як маркерів дозволило встановити приналежність ретикулярних клітин строми лімфоїдних органів до Т- та В-залежних зон.

Протягом деякого часу тривали наукові дебати навколо питання про можливість походження МСК з гемопоетичної стовбурової клітини. Дійсно, коли суспензії клітин кісткового мозку експлантуються в моношарові культури, в них ростуть окремі колонії фібробластів. Однак було показано, що наявність попередників колоній фібробластів та різних паростків диференціації гемопоетичної тканини в кістковому мозку не є доказом їх спільного походження з гемопоетичної стовбурової клітини. За допомогою дискримінантного аналізу стовбурових клітин кісткового мозку було встановлено, що мікрооточення під час гетеротопічної трансплантації кісткового мозку не переноситься гемопоетичними клітинами, що доводить існування популяції МСК у кістковому мозку, яка є гістогенетично незалежною від гемопоетичних клітин.

Крім того, метод селективного клонування дозволив ідентифікувати нову категорію стромальних клітин-попередників у моношарових культурах клітин кісткового мозку, визначити їх кількість та вивчити їхні властивості, проліферативний та диференціюючий потенціали. Виявилося, що стромальні фібробластоподібні клітини проліферують in vitro та утворюють диплоїдні колонії, які при пересадці назад в організм забезпечують формування нових кровотворних органів. Результати дослідження окремих клонів свідчать про те, що серед стромальних клітин-попередників існує популяція клітин, які за своїм проліферативним та диференціюючим потенціалом можуть претендувати на роль стовбурових клітин стромальної тканини, гістогенетично незалежних від гемопоетичних стовбурових клітин. Клітини цієї популяції характеризуються самопідтримуваним ростом та диференціюються в клітинні елементи-попередники кісткової, хрящової та ретикулярної тканини кісткового мозку.

Великий інтерес представляють результати досліджень Р. Чайлахяна та співавторів (1997-2001), які культивували стромальні клітини-попередники кісткового мозку кроликів, морських свинок та мишей на поживному середовищі a-MEM з додаванням фетальної телячої сироватки. Автори проводили експлантацію з початковою щільністю 2-4 x 10³ клітин кісткового мозку на 1 см2. Гомологічні або гетерологічні радіаційно інактивовані клітини кісткового мозку використовували як живильник у дозі, яка зберігала ефект живильника, але повністю блокувала їх проліферацію. Двотижневі первинні дискретні колонії фібробластів трипсинізували для отримання моноклональних штамів. Докази клонального походження колоній були отримані за допомогою хромосомного маркера у змішаних культурах кісткового мозку самців та самок морських свинок, покадрової фотозйомки живих культур та у змішаних культурах сингенного кісткового мозку мишей CBA та CBAT6T6. Трансплантацію суспензії свіжовиділених клітин кісткового мозку або вирощених in vitro стромальних фібробластів під капсулу нирки проводили в пористі каркаси з івалону або желатину, а також в інактивовану губчасту кісткову матрицю кролика. Для трансплантації клонів у кісткову піхву стегнові кістки морських свинок очищали від м'яких тканин та окістя, обрізали епіфізи, а кістковий мозок ретельно промивали. Кістку розрізали на фрагменти (3-5 мм), сушили та опромінювали в дозі 60 Гр. Окремі колонії фібробластів поміщали в кісткові піхви та імплантували внутрішньом'язово. Для внутрішньочеревної трансплантації стромальних фібробластів, вирощених in vitro, використовували дифузійні камери типів А (V=0,015 см3, h=0,1 мм) та О (V=0,15 см3, h=2 мм).

Вивчаючи динаміку росту клональних штамів, Р. Чайлахян та ін. (2001) виявили, що окремі клітини, що утворюють колонії фібробластів, а також їхні нащадки, мають величезний проліферативний потенціал. До 10-го пасажу кількість фібробластів у деяких штамах становила 1,2-7,2 x 109 ^клітин. Протягом свого розвитку вони здійснювали до 31-34 подвоєння клітин. У цьому випадку гетеротопічна трансплантація штамів, отриманих з кісткового мозку, утворених стромальними попередниками кількох десятків клонів, призвела до перенесення мікрооточення кісткового мозку та формування нового кровотворного органу в зоні трансплантації. Автори поставили питання, чи здатні окремі клони переносити мікрооточення кісткового мозку стромальних клітин, чи для цього потрібна кооперація кількох різних клоногенних стромальних попередників? І якщо окремі клони здатні переносити мікрооточення, чи буде воно повним для всіх трьох кровотворних паростків, чи різні клони забезпечують формування мікрооточення для різних кровотворних паростків? Для вирішення цих питань була розроблена технологія культивування стромальних клітин-попередників на колагеновому гелі, що дозволяє видаляти вирощені колонії фібробластів з поверхні для подальшої гетеротопічної трансплантації. Окремі клони стромальних фібробластів, вирощених з клітин кісткового мозку мишей лінії CBA та морських свинок, висікали разом з фрагментом гелевого покриття та гетеротопічно пересаджували – під капсулу нирки сингенних мишей або в черевний м'яз аутологічних морських свинок. При пересадці в м'яз колонії на гелі розміщували в кісткових піхвах.

Автори виявили, що через 50-90 днів після трансплантації колоній фібробластів кісткового мозку у 20% випадків у зоні трансплантації спостерігався розвиток кісткової або кісткової та кровотворної тканини. У 5% тварин-реципієнтів утворені вогнища кісткової тканини містили порожнину, заповнену кістковим мозком. Усередині кісткових циліндрів такі вогнища мали округлу форму та капсулу, побудовану з кісткової тканини з остеоцитами та добре розвиненим остеобластним шаром. Порожнина кісткового мозку містила ретикулярну тканину з мієлоїдними та еритроїдними клітинами, пропорційне співвідношення яких не відрізнялося від такого в нормальному кістковому мозку. У нирці трансплантат був типовим органом кісткового мозку, утвореним під час трансплантації нативного кісткового мозку, причому кісткова капсула покривала порожнину кісткового мозку лише з боку ниркової капсули. Кровотворна тканина включала мієлоїдні, еритроїдні та мегакаріоцитарні елементи. Строма порожнини кісткового мозку мала добре розвинену синусову систему та містила типові жирові клітини. Водночас у зоні трансплантації деяких колоній під капсулою нирки виявлено кісткову тканину без ознак кровотворення. Вивчення проліферативного та диференціювального потенціалів окремих клонів було продовжено на моноклональних штамах кісткового мозку кроликів, клітини яких ресуспендували в живильному середовищі та в окремій губці івалону масою 1-2 мг пересаджували під ниркову капсулу донора кісткового мозку кролика. Клітини 21 моноклонального штаму піддали такій аутотрансплантації. Результати враховували через 2-3 місяці. Автори виявили, що у 14% випадків пересаджені моноклональні штами утворили орган кісткового мозку, що складається з кісткової тканини та порожнини кісткового мозку, заповненої кровотворними клітинами. У 33% випадків пересаджені штами утворили компактну кістку різного розміру з остеоцитами, замурованими в порожнинах, та розвиненим остеобластним шаром. У деяких випадках у губках з пересадженими клонами розвивалася ретикулярна тканина без кісткових або кровотворних елементів. Іноді утворювалася ретикулярна строма з добре розвиненою мережею синусоїдів, але не заселена кровотворними клітинами. Таким чином, отримані результати були подібними до даних, отриманих під час трансплантації клонів на колагеновий гель. Однак, якщо трансплантація клонів, вирощених на субстраті, призвела до утворення тканини кісткового мозку у 5% випадків, кісткової тканини – у 15% та ретикулярної тканини – у 80% випадків, то при трансплантації моноклональних штамів утворення елементів кісткового мозку спостерігалося у 14% випадків, кісткової тканини – у 53% та ретикулярної тканини – у 53% випадків. На думку авторів, це свідчить про те, що умови для реалізації проліферативного та диференціюючого потенціалу стромальних фібробластів під час трансплантації на пористі каркаси були більш оптимальними, ніж під час їх трансплантації в кісткові піхви та на колагеновий субстрат.Можливо, що використання більш досконалих методів культивування та зворотної трансплантації клонів може покращити умови для реалізації клонами їхнього диференціаційного потенціалу та змінити ці співвідношення. Так чи інакше, але головне значення проведених досліджень полягає в тому, що деякі клони стромальних клітин здатні формувати кісткову тканину та одночасно забезпечувати стромальний гемопоетичний мікросередовище одразу для трьох паростків кістковомозкового кровотворення: еритроїдного, мієлоїдного та мегакаріоцитарного, створюючи досить великі платформи гемопоетичної тканини та певної кісткової маси.

Далі автори розглянули питання здатності окремих клоногенних стромальних клітин-попередників зазнавати цих типів клітинної диференціації в замкнутій системі дифузійних камер. Крім того, необхідно було визначити, чи володіють окремі клони поліпотентністю, чи для прояву потенціалу диференціації потрібна кооперативна взаємодія кількох клонів з фіксованою ознакою цитодиференціації, різні співвідношення яких визначають переважне формування кісткової, ретикулярної або хрящової тканини. Поєднуючи два методологічні підходи – отримання моноклональних штамів стромальних клітин-попередників кісткового мозку та пересадку їх у дифузійні камери – Р. Чайлахян та співавтори (2001) отримали результати, які дозволили їм наблизитися до розуміння структурної організації строми кісткового мозку. Трансплантація моноклональних штамів стромальних клітин-попередників у камери О-типу призвела до формування як кісткової, так і хрящової тканини, що свідчить про здатність нащадків однієї стромальної колонієутворюючої клітини одночасно формувати кісткову та хрящову тканини. Припущення про те, що кісткова та хрящова тканини походять від спільної стромальної клітини-попередника, висувалося неодноразово. Однак ця гіпотеза не мала правильного експериментального підтвердження. Утворення кістки та хряща в дифузійних камерах було необхідним доказом існування спільної клітини-попередника для цих двох типів тканин серед стромальних стовбурових клітин кісткового мозку.

Потім 29 клональних штамів другого-третього пасажів, отриманих з первинних культур кісткового мозку кролів, були поміщені в дифузійні камери та імплантовані внутрішньочеревно гомологічним тваринам. Дослідження показали, що 45% моноклональних штамів кісткового мозку мають остеогенний потенціал. Дев'ять камер містили виключно ретикулярну тканину, але вона була присутня разом з кістковою та хрящовою тканинами ще в 13 камерах, що становило 76% усіх штамів. У камерах типу О, де була можлива диференціація як кісткової, так і хрящової тканини, досліджували 16 штамів. У чотирьох камерах (25%) формувалася як кісткова, так і хрящова тканини. Слід ще раз зазначити, що в дослідженнях Р. Чайлахяна та ін. (2001) окремі клітини-попередники зазнавали від 31 до 34 подвоєнь у межах клітинного штаму, а їх потомство складало 0,9-2,0 x 109 ^клітин. Кількість мітозів, які зазнали клітини-попередники поліклональних штамів, була практично ідентичною кількості мітозів у моноклональних штамів. Швидкість розвитку поліклональних штамів, особливо на першій фазі їх формування, значною мірою залежала від кількості колоній, що використовувалися для ініціації штамів. Диплоїдні штами ембріональних фібробластів людини (WI-38) при реклонуванні на 12-15-му рівнях подвоєння також утворювали колонії, що відрізнялися діаметром та вмістом клітин. Великі колонії, що містили понад 103 клітин, становили лише 5-10%. Зі збільшенням кількості поділів відсоток великих колоній зменшувався. Моно- та поліклональні штами стромальних фібробластів кісткового мозку зберігали диплоїдний набір хромосом після 20 і більше подвоєннь, а тенденція їх розвитку була порівнянна з динамікою розвитку диплоїдних штамів ембріональних фібробластів. Аналіз потенціалу диференціації окремих стромальних клітин-попередників кісткового мозку, проведений шляхом пересадки моноклональних штамів у дифузійні камери, показав, що половина з них були остеогенними. Великі колонії становили 10% від їх загальної кількості. Отже, кількість остеогенних колонієутворюючих клітин відповідала приблизно 5% від їхньої загальної популяції. Загальна маса остеогенних клітин-попередників, ідентифікованих авторами, включала клітини, здатні одночасно формувати кісткову та хрящову тканини. Більше того, вперше було встановлено, що ці два типи тканин у дорослому організмі мають спільну клітину-попередницю: 25% протестованих клонів були створені такими клітинами, а їх кількість серед загальної популяції клітин-попередників становила щонайменше 2,5%.

Таким чином, гетеротопна трансплантація окремих клонів фібробластів кісткового мозку виявила нові аспекти структурної організації популяції мезенхімальних клітин-попередників. Виявлено стромальні клітини-попередники, здатні переносити специфічне мікрооточення для всіх гемопоетичних паростків одночасно, кількість яких серед досліджених великих клонів у різних моделях коливається від 5 до 15% (0,5-1,5% від загальної кількості виявлених клітин-попередників). Поряд з клонами, що переносять повне мікрооточення кісткового мозку, існують клітини-попередники, визначені лише до остеогенезу, які при перенесенні у відкриту систему утворюють кісткову тканину, що не підтримує розвиток кровотворення. Їх кількість від загальної кількості клітин-попередників становить 1,5-3%. Деякі з цих клітин здатні утворювати кісткову тканину з обмеженим періодом самопідтримки. Отже, популяція стромальних клітин-попередників є неоднорідною за своїм потенціалом диференціації. Серед них є категорія клітин, які претендують на звання стромальних стовбурових клітин, здатних диференціюватися в усіх трьох напрямках, характерних для стромальної тканини кісткового мозку, формуючи кісткову, хрящову та ретикулярну тканини. Представлені дані дозволяють сподіватися, що, використовуючи різні клітинні маркери, можна буде визначити внесок кожного типу стромальних клітин в організацію специфічного мікрооточення та підтримку кровотворення в культурах Декстера.

Особливості мезенхімальних стовбурових клітин

В останні роки було встановлено, що в стаціонарних культурах кісткового мозку мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники представлені обмеженою популяцією малих агранулярних клітин (клітини RS-1), що характеризуються низькою колонієутворювальною здатністю та відсутністю експресії антигену Ki-67, специфічного для проліферуючих клітин. Антигенні параметри сплячих клітин RS-1 відрізняються від спектру антигенів швидко проліферуючих коммітованих стромальних клітин-попередників. Встановлено, що висока швидкість проліферації коммітованих клітин-попередників спостерігається лише за наявності клітин RS-1. У свою чергу, клітини RS-1 збільшують швидкість свого росту під впливом факторів, що секретуються найбільш зрілими похідними мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників. Схоже, що клітини RS-1 є підкласом некомітованих МСК, здатних до рециркуляції. In vitro 5-фторурацилоррезистентні стромальні клітини-попередники кісткового мозку характеризуються низьким вмістом РНК та високою експресією гена орнітиндекарбоксилази, маркера непроліферуючих клітин.

Інтенсивна проліферація стромальних клітин-попередників починається після їх фіксації на субстраті. У цьому випадку експресується маркерний профіль погано диференційованих клітин: SH2 (рецептор TGF-(3)), SH3 (сигнальний білковий домен), колаген I та III типів, фібронектин, рецептори адгезії VCAM-1 (CD106) та ICAM (CD54), кадгерин-11, CD44, CD71 (рецептор трансферину), CD90, CD120a та CD124, але без експресії характерних маркерів гемопоетичних стовбурових клітин (CD34, CD14, CD45). Клональний ріст дає змогу багаторазово пасажувати мезенхімальні стовбурові клітини з утворенням у культурі численних генетично однорідних плюрипотентних стромальних клітин-попередників. Після 2-3 пасажувань їх кількість досягає 50-300 мільйонів. У культурі достатньої щільності, після зупинки проліферації, стромальні клітини-попередники, на відміну від фібробластів гемопоетичної тканини, диференціюються в адипоцити, міоцити, хрящові та кісткові клітини. Комбінація трьох сигналів регуляторної диференціації, включаючи 1-метилізобутилксантин (індуктор внутрішньоклітинного утворення цАМФ), дексаметазон (інгібітор фосфоліпаз А та С) та індометацин (інгібітор циклооксигенази, який також знижує активність тромбоксансинтази), перетворює до 95% мезенхімальних клітин-попередників на адипоцити. Утворення адипоцитів з незрілих стромальних елементів підтверджується експресією гена ліпопротеїнліпази, гістохімічним виявленням аполіпопротеїнів та пероксисомних рецепторів. Клітини одного клону під впливом TGF-b у безсиворотковому середовищі створюють гомогенну популяцію хондроцитів. Багатошарова культура клітин цієї хрящової тканини характеризується розвиненим міжклітинним матриксом, що складається з протеоглікану та колагену II типу. У поживному середовищі з 10% Вплив сигнального комплексу диференціації, що складається з b-гліцерофосфату (неорганічного донора фосфату), аскорбінової кислоти та дексаметазону в одній культурі стромальних клітин-попередників, призводить до утворення клітинних агрегатів. У таких клітинах спостерігається прогресуюче збільшення активності лужної фосфатази та рівня остеопонтину, що свідчить про формування кісткової тканини, мінералізація клітин якої підтверджується прогресуючим збільшенням внутрішньоклітинного вмісту кальцію.

Згідно з деякими даними, здатність мезенхімальних стовбурових клітин до необмеженого поділу та розмноження різних типів клітин мезенхімальної лінії диференціації поєднується з високим ступенем пластичності. При введенні в шлуночки або білу речовину мозку мезенхімальні стовбурові клітини мігрують до паренхіми нервової тканини та диференціюються в похідні гліальної або нейрональної клітинної лінії. Крім того, є інформація про трансдиференціацію МСК у гемопоетичні стовбурові клітини як in vitro, так і in vivo. Більш поглиблений аналіз у деяких дослідженнях визначив винятково високу пластичність МСК, яка проявляється в їхній здатності диференціюватися в астроцити, олігодендроцити, нейрони, кардіоміоцити, гладком'язові клітини та клітини скелетних м'язів. Ряд досліджень трансдиференціаційного потенціалу МСК in vitro та in vivo встановив, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники кістковомозкового походження термінально диференціюються в клітинні лінії, що утворюють кісткову, хрящову, м'язову, нервову та жирову тканини, а також сухожилля та строму, що підтримують кровотворення.

Однак, інші дослідження не виявили жодних ознак обмеження плюрипотентності геному мезенхімальних стовбурових клітин та популяцій прогениторних стромальних клітин, хоча для перевірки можливої плюрипотентності стромальних клітин було досліджено понад 200 клонів МСК, виділених з однієї первинної культури. Переважна більшість клонів in vitro зберегли здатність диференціюватися в остеогенному, хондрогенному та адипогенному напрямках. При виключенні ймовірності міграції клітин-реципієнтів шляхом пересадки мезенхімальних стовбурових клітин під капсулу нирки або в дифузійні камери виявилося, що стромальні клітини-попередники in situ зберігають гетерогенний фенотип, що вказує або на відсутність факторів рестрикції в зоні трансплантації, або на відсутність плюрипотентності МСК як такої. Водночас допускається існування рідкісного типу соматичних плюрипотентних стовбурових клітин, які є спільними попередниками всіх дорослих стовбурових клітин.

Мульти-, але не плюрипотентність, справжніх мезенхімальних стовбурових клітин, які становлять дуже невелику частку клітин кісткового мозку та здатні проліферувати за певних умов під час культивування in vitro без диференціації, підтверджується їх індукованою зв'язкою з клітинами кісткової, хрящової, жирової, м'язової тканин, а також теноцитами та стромальними елементами, що підтримують кровотворення. Як правило, тривалий вплив культурального середовища з фетальною телячою сироваткою провокує вивільнення МСК у комітовані стромальні клітини-попередники, потомство яких зазнає спонтанної термінальної диференціації. In vitro можна досягти цілеспрямованого формування остеобластів, додаючи до кондиціонуючого середовища дексаметазон, ß-гліцерофосфат та аскорбінову кислоту, тоді як комбінація сигналів диференціації дексаметазону та інсуліну індукує формування адипоцитів.

Встановлено, що перед вступом у стадію термінальної диференціації, МСК кісткового мозку спочатку диференціюються у фібробластоподібні мезенхімальні стовбурові клітини за певних умов культивування. Похідні цих клітин in vivo беруть участь у формуванні кісток, хрящів, сухожиль, жирової та м'язової тканини, а також строми, що підтримує кровотворення. Багато авторів розуміють під терміном «мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники» як самі МСК, так і комітовані стромальні клітини-попередники кісткового мозку та мезенхімальних тканин. Клональний аналіз мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників кістковомозкового походження показав, що трохи більше третини всіх клонів диференціюються в остео-, хондро- та адипоцити, тоді як клітини решти клонів мають лише остеогенний потенціал і утворюють лише хондро- та остеоцити. Клон мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників, таких як BMC-9, за відповідних умов мікросередовища диференціюється в клітини з фенотипом та функціональними характеристиками не лише остеобластів, хондроцитів та адипоцитів, але й стромальних клітин, що підтримують кровотворення. Клон клітин RCJ3.1, виділених з кісткового мозку плодів щурів, диференціюється в мезенхімальні клітини різних фенотипів. Під спільною дією аскорбінової кислоти, b-гліцерофосфату та дексаметазону клітинні елементи цього клону спочатку утворюють багатоядерні міоцити, а потім, послідовно, адипоцити, хондроцити та острівці мінералізованої кісткової тканини. Популяція гранулярних клітин з окістя плодів щурів відповідає некоммітованим мультипотентним мезенхімальних клітин-попередників, оскільки характеризується низькою швидкістю проліферації, не експресує маркери диференціації та в умовах культивування диференціюється з утворенням хондро-, остео- та адипоцитів, а також гладком'язових клітин.

Таким чином, слід визнати, що питання плюрі- чи мультипотентності геному мезенхімальних стовбурових клітин залишається відкритим, що, відповідно, впливає і на уявлення про диференціаційний потенціал стромальних клітин-попередників, який також остаточно не встановлений.

Експериментально доведеною та важливою характеристикою мезенхімальних стовбурових клітин є їхня здатність залишати тканинну нішу та циркулювати в загальному кровотоці. Для активації програми генетичної диференціації такі циркулюючі стовбурові клітини повинні потрапити у відповідне мікрооточення. Показано, що при систематичному введенні МСК у кровотік тварин-реципієнтів незрілі клітини імплантуються в різні органи та тканини, диференціюючись потім у клітини крові, міоцити, адипоцити, хондроцити та фібробласти. Отже, в локальних тканинних зонах відбуваються сигнально-регуляторні взаємодії між некомітованими та комітованими стромальними клітинами-попередниками, а також між ними та навколишніми зрілими клітинами. Передбачається, що диференціація індукується паракринними регуляторними факторами мезенхімального та немезенхімального походження (фактори росту, ейкозаноїди, молекули позаклітинного матриксу), які забезпечують просторові та часові зв'язки в мікрооточенні мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників. Отже, локальне пошкодження мезенхімальної тканини повинно призводити до формування зон мікрооточення мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників, що якісно відрізняються від комплексу регуляторних сигналів інтактних тканин, у яких відбуваються фізіологічні, а не репаративні процеси регенерації. Ця відмінність є надзвичайно важливою з точки зору спеціалізації клітинного фенотипу в нормальному та пошкодженому мікрооточенні.

Згідно з концепціями, саме тут закладені механізми принципової відмінності між двома відомими процесами – фізіологічною регенерацією та запальною проліферацією. Перший з них завершується відновленням спеціалізованого клітинного складу тканини та її функції, тоді як результатом реалізації процесу проліферації є формування зрілих елементів сполучної тканини та втрата функції пошкодженої тканинної зони. Таким чином, для розробки оптимальних програм використання мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників у регенеративно-пластичній медицині необхідне ґрунтовне вивчення особливостей впливу факторів мікросередовища на диференціацію МСК.

Залежність структури компартменту стовбурових клітин від клітинних пара- та аутокринних регуляторів, експресія яких модулюється зовнішніми сигналами, не викликає сумнівів. Серед функцій регуляторних факторів найважливішими є контроль асиметричного поділу МСК та експресія генів, що визначають стадії комітіації та кількість клітинних поділів. Зовнішні сигнали, від яких залежить подальший розвиток МСК, забезпечуються їх мікрооточенням. У незрілому стані МСК проліферують тривалий час, зберігаючи здатність диференціюватися в лінії адипоцитів, міофібробластів, строму гематогенної тканини, хрящові та кісткові клітини. Встановлено, що обмежена популяція CD34-негативних стромальних клітинних елементів, що циркулюють у крові, повертається із загального кровотоку до стром кісткового мозку, де трансформується в лінії CD34-позитивних гемопоетичних стовбурових клітин. Ці спостереження свідчать про те, що рециркуляція прогеніторних мезенхімальних клітин у кровотоці підтримує тканинний баланс стромальних стовбурових клітин у різних органах шляхом мобілізації загального пулу незрілих стромальних елементів кісткового мозку. Диференціація МСК у клітини з множинними мезенхімальними фенотипами та їхня участь у регенерації або відновленні кісток, хрящів, жирової тканини та сухожиль in vivo була доведена за допомогою моделей адоптивного перенесення на експериментальних тваринах. За даними інших авторів, дистантна міграція МСК вздовж судинного русла поєднується з коротким або локальним переміщенням мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників у тканині під час відновлення хряща, регенерації м'язів та інших відновлювальних процесів.

Локальні стовбурові резерви основи стромальної тканини виступають джерелом клітин у процесах фізіологічної регенерації тканин і поповнюються шляхом дистантного транспорту МСК у міру споживання ресурсів стромально-тканинного стовбура. Однак в умовах необхідності екстреної мобілізації репаративного клітинного потенціалу, наприклад, при політравмі, у процесах репаративної регенерації бере участь весь ешелон МСК, а мезенхімальні клітини-попередники кісткового мозку рекрутуються на периферію через загальний кровотік.

Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин

Певні паралелі можна простежити між процесами фізіологічної регенерації тканин та їх формуванням під час внутрішньоутробного розвитку. В ембріогенезі людини та ссавців формування різних типів спеціалізованих клітин відбувається з екто-, мезо- та ендодермального пулу зародкових шарів, але за обов'язкової участі мезенхіми. Пухка клітинна мережа ембріональної мезенхімальної тканини виконує численні регуляторні, метаболічні, каркасні та морфогенетичні функції. Закладка провізорних органів відбувається лише після конденсації мезенхіми завдяки клоногенному росту клітин-попередників, які генерують первинні морфогенетичні сигнали органогенезу. Стромальні похідні ембріональної мезенхіми створюють клітинний каркас провізорних органів та формують основу для їх майбутнього енергопластичного постачання завдяки росту первинних кровоносних та лімфатичних судин. Іншими словами, стромальні елементи мікроциркуляторного апарату органів плода виникають до формування їх структурних та функціональних одиниць. Крім того, активна міграція мезенхімальних клітин під час органогенезу забезпечує просторову орієнтацію органів, що розвиваються, шляхом маркування їх об'ємних меж через обмеження гомеотичних Hox-типів. Стромальний каркас також служить основою для складання структурних та функціональних одиниць паренхіматозних органів, які часто включають морфогенетично та функціонально абсолютно різні клітини. Отже, під час ембріогенезу функції мезенхіми є первинними та реалізуються через генерацію регуляторних сигналів, що активують регіональну проліферацію та диференціацію прогеніторних епітеліальних клітин. Ембріональні мезенхімні клітини продукують фактори росту, такі як HGF-β, HGF-β, CSF, для яких паренхіматозні прогеніторні клітини мають відповідні рецептори. У диференційованій зрілій тканині дорослого організму стромальна мережа клітин також генерує сигнали для підтримки життєздатності та проліферації прогеніторних клітин немезенхімального походження. Однак спектр стромальних регуляторних сигналів у постнатальному онтогенезі різний (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF тощо) та спрямований на забезпечення фізіологічної регенерації або відновлення пошкоджених зон тканин. Більше того, спектральні характеристики стромальних регуляторних факторів у кожному типі тканин і навіть в межах одного органу різні. Зокрема, гемопоез та лімфопоез з проліферацією та диференціацією гемопоетичних та імунокомпетентних клітин відбуваються лише в певних органах, в межах яких функціонує стромальне мікрооточення, що забезпечує умови для дозрівання гемопоетичних та лімфоїдних клітин. Здатність гемопоетичних та лімфоїдних клітин репопулювати даний орган, проліферувати та дозрівати в його мікроструктурних нішах залежить від регуляторних факторів мікрооточення.

Серед компонентів позаклітинного матриксу, що продукують мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники, слід відзначити фібронектин, ламінін, колаген та протеоглікани, а також CD44 (гіалуронан та остеопонтиновий рецептор), які беруть основну участь в організації міжклітинних взаємодій та формуванні позаклітинного матриксу в кістковому мозку та кістковій тканині. Доведено, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники кісткового мозку створюють стромальний мікросередовище, яке забезпечує індуктивні та регуляторні сигнали не лише до МСК, але й до гемопоетичних клітин-попередників та інших немезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку. Відомо, що участь МСК у кровотворенні визначається їхньою здатністю диференціюватися в стромальні клітини, що підтримують кровотворення, і цей інструктивний сигнал отримується МСК безпосередньо від гемопоетичних стовбурових клітин. Саме тому в культурі мережа стромальних клітин-попередників служить живильною базою для розвитку всіх клонів гемопоетичних клітин.

У зрілому організмі інтенсивність гемо- та лімфопоезу знаходиться в стані динамічної рівноваги з «витратами» зрілих клітин крові та клітин імунної системи на периферії. Оскільки стромальні клітини кісткового мозку та лімфоїдних органів оновлюються вкрай рідко, суттєвої перебудови стромальних структур у них не відбувається. Систему можна вивести з динамічної рівноваги механічним пошкодженням будь-якого з органів гемо- або лімфопоезу, що призводить до рівномірних послідовних змін, що стосуються не лише і не стільки гемопоетичних або лімфоїдних елементів, скільки стромальних структур пошкодженого органу. У процесі репаративної регенерації спочатку формується стромальна основа, яка потім заселяється гемопоетичними або імунокомпетентними клітинами. Цей давно відомий факт робить посттравматичну регенерацію зручною моделлю для вивчення стромального мікрооточення гемопоетичних органів. Зокрема, механічне спорожнення кістковомозкової порожнини трубчастих кісток використовується для вивчення репаративної регенерації кісткового мозку – кюретажу, що дозволяє швидко та ефективно вивести кровотворну тканину зі стану динамічної рівноваги. При вивченні процесів репаративної регенерації кровотворного та стромального компонентів кісткового мозку після механічного спорожнення кістковомозкової порожнини великогомілкової кістки морських свинок було виявлено, що немає прямої кореляції між показниками регенерації кровотворних та стромальних клітин (кількістю кровотворних клітин, концентрацією та кількістю стромальних клітин-попередників). Крім того, виявилося, що збільшення популяції стромальних клітин-попередників відбувається у більш ранні терміни після кюретажу, а самі стромальні фібробласти стають фосфатазопозитивними, що характерно для остеогенної тканини. Також встановлено, що кюретаж 3-5 трубчастих кісток призводить до зростання цієї клітинної популяції в кістковому мозку неоперованих кісток і навіть у селезінці, яка у морських свинок є виключно лімфопоетичним органом.

Морфологічна картина репаративних процесів у кістковому мозку кюретованих великогомілкових кісток морських свинок загалом відповідає даним, описаним у літературі, отриманим у дослідах на тваринах інших видів, а динаміка змін, що відбуваються після видалення кровотворної тканини, є однаковою для всіх видів тварин і різниця стосується лише часових параметрів. Морфологічно фазовий порядок відновлення кровотворення у спорожненій кістковомозковій порожнині складається з послідовних процесів організації кров'яного згустку, формування грубої фіброзної кісткової тканини, її резорбції, розвитку синусоїдів та формування ретикулярної строми, яка згодом заселяється кровотворними елементами. При цьому кількість гемопоетичних клітин-попередників у процесі регенерації тканини кісткового мозку збільшується паралельно зі збільшенням вмісту гемопоетичних стовбурових клітин.

Ю. Герасимов та співавтори (2001) порівнювали зміни кількості гемопоетичних клітин та кількості стромальних клітин-попередників в окремих фазах процесу регенерації. Виявилося, що кількісні зміни клітин кісткового мозку в кюретованій кістці відповідають динаміці морфологічних характеристик регенерації. Автори пов'язують зниження клітинного вмісту в регенераті протягом перших трьох днів із загибеллю гемопоетичних клітин через несприятливий вплив мікрооточення, створеного проліферуючою ретикулярною тканиною в збереженому кістковому мозку в області епіфіза, а також з утворенням вогнищ остеоїдної тканини в останньому та пошкодженням судин під час кюретажу. На 7-12-й день підвищення рівня ядерних клітин збігається з появою окремих вогнищ мієлоїдного кровотворення в зонах проліферації стромальних елементів. На 20-й день з'являються значні ділянки регенерованого кісткового мозку та добре розвинені синусові пазухи, що супроводжується значним збільшенням загальної кількості клітин. Однак кількість гемопоетичних елементів за цей період становить 68% від контрольного рівня. Це узгоджується з раніше опублікованими даними про те, що кількість гемопоетичних клітин після кюретажу досягає норми лише на 35-40-й день після операції.

У ранньому посттравматичному періоді основним джерелом відновлення кровотворення є локальні клітинні елементи, що збереглися під час вишкрібання. На пізніших стадіях основним джерелом регенерації кровотворної тканини кісткового мозку є стовбурові клітини, що репопулюють вільні стромальні зони. Що стосується окремих категорій стромальних клітин (ендотеліальних, ретикулярних та остеогенних), то джерела, що забезпечують їх формування під час реорганізації порожнини кісткового мозку, залишаються незрозумілими. Результати дослідження Ю. В. Герасимова та співавторів (2001) свідчать про те, що в кістковому мозку, збереженому після вишкрібання, концентрація клітин, що утворюють колонії фібробластів, значно вища, ніж у нормальному кістковому мозку. Автори вважають, що вишкрібання призводить до більш інтенсивного селективного вимивання гемопоетичних клітин порівняно з колонієутворюючими стромальними клітинами, які беруть участь у формуванні строми та міцніше пов'язані з її основною речовиною, ніж гемопоетичні клітини.

Динаміка зміни кількості клітин, що формують колонії фібробластів, корелює з інтенсивністю процесів остеогенезу, подальшою резорбцією кісткових трабекул та формуванням ретикулярної строми, яка заселена гемопоетичними клітинами. Більшість стромальних клітин-попередників у зазначені терміни регенерації утворюють грубу фіброзну кісткову тканину та ретикулярну строму. При переломах стегнової кістки за умов тривалого остеосинтезу на 5-ту добу в зоні регенерації концентрація та кількість клітин, що формують колонії фібробластів, зростає, а в період інтенсивного кісткоутворення їх кількість збільшується в 6 разів. Відомо, що клітини кісткового мозку, що формують колонії фібробластів, мають остеогенні властивості. Кількість стромальних клітин-попередників збільшується до заселення вискобльованої території кісткового мозку гемопоетичними клітинами. Це добре узгоджується з даними про те, що стромальні клітини забезпечують формування гемопоетичного мікрооточення. Очевидно, створення гемопоетичного мікрооточення відповідає певному рівню регенерації стромальної тканини, а кількість гемопоетичних клітин збільшується з розширенням стромальної платформи, придатної для гемопоезу.

Найбільший інтерес викликають дані авторів про те, що одразу після кюретажу кількість стромальних клітин-попередників у віддалених частинах скелета збільшується. Починаючи з шостої години і до двадцятого дня включно, у контралатеральній великогомілковій кістці спостерігається більш ніж дворазове збільшення як концентрації, так і кількості клітин, що утворюють колонії фібробластів. Механізм цього явища, ймовірно, пов'язаний з тим, що масивне пошкодження кісткового мозку призводить до утворення великої кількості тромбів з одночасним руйнуванням значної кількості тромбоцитів та вивільненням у кров тромбоцитарного фактора росту (PDGF), який, як відомо, викликає проліферацію клітин, що утворюють колонії фібробластів, розташованих в організмі поза проліферативним пулом. В експериментах на кроликах локальне введення МСК сприяє відновленню хрящової тканини хірургічно пошкодженого колінного суглоба, що може бути пов'язано з утворенням хондроцитів, що походять з ін'єктованих МСК. Однак репаративна регенерація кісткових дефектів у лабораторних щурів значно посилюється використанням мезенхімальних стовбурових клітин, укладених у керамічний каркас. Отже, можна припустити, що якщо не RBOC, то якийсь інший фактор, що походить від пошкоджених стромальних клітин, має віддалений стимулюючий вплив на проліферацію мезенхімальних клітин-попередників у зонах інтактного кісткового мозку та стимулює їх міграцію до ділянки дефекту кісткового мозку. У свою чергу, це суперечить літературним даним попередніх років, які вказують на те, що стромальні клітини, відповідальні за мікрооточення, на відміну від гемопоетичних клітин, не здатні до міграції та походять з локальних джерел.

Тим не менш, результати дослідження Ю. Герасимова та співавторів (2001) свідчать про те, що механічна травма викликає не лише різку перебудову структури стромальної тканини в кюретованій кістці, але й значні зміни строми у віддалених інтактних кістках, тобто спостерігається системна реакція стромальної тканини на локальну травму. Більше того, при нанесенні політравми – множинного кюретажу – ця реакція посилюється і спостерігається не лише в оперованій кістці та віддалених частинах скелета, а й у лімфоїдних органах, зокрема в селезінці. Механізм такої системної реакції стромальної тканини кісткового мозку та селезінки на локальну травму та політравму залишається невідомим. Передбачається, що цей процес пов'язаний з дією гуморального фактора, що виділяється мезенхімальною стромою довгастої порожнини кісткового мозку. Про можливість продукування стромальними клітинами кісткового мозку та селезінки органонеспецифічного гуморального фактора, відповідального за проліферацію клітин, що утворюють колонії фібробластів, свідчать дані про їхню колонієстимулюючу активність у моношарових культурах кісткового мозку.

У зв'язку з цим варто зазначити, що при системному введенні мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників їхні похідні репопулюють не лише кістковий мозок, а й інші тканини, що використовується, зокрема, для генної терапії. Було показано, що при внутрішньовенному введенні великої кількості МСК з геномом дикого типу мишам з мутацією в гені колагену I донорські клітини заміщують до 30% клітин кісткової та хрящової тканини реципієнтів, а трансфіковані мезенхімальні стовбурові клітини мишей, що секретують людський IL-3, ефективно підтримують кровотворення протягом 9 місяців у разі їх одночасного введення з людськими гемопоетичними стовбуровими клітинами імунодефіцитним мишам.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Генетична модифікація мезенхімальних стовбурових клітин

Серед успіхів експериментальної генетичної модифікації МСК варто відзначити трансфекцію гена фактора IX у МСК людини з подальшим перенесенням трансфектованих клітин імунодефіцитним мишам, що призводить до появи антигемофільного фактора B у крові протягом 8 тижнів після трансплантації. У цьому експерименті в трансфікованих клітинах було проведено посттрансляційну модифікацію фактора IX γ-глутамілкарбоксилазою. Трансдукція МСК ретровірусним вектором, що кодує фактор IX людини, була менш успішною – подальше введення цих клітин собаці з гемофілією B забезпечило терапевтичний рівень фактора IX, що підтримує нормальну інтенсивність коагуляційного гемостазу, лише протягом 12 днів.

Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин у паренхіму мозку тварин показала, що незрілі клітини донора трансформуються як у нейрональні, так і в гліальні популяції. Приживлення нейрональних похідних здорової мезенхімальної тканини донора теоретично дозволяє коригувати генетичні аномалії метаболізму мозку у пацієнтів з хворобою Гоше та іншими порушеннями ліпідного, гангліозидного або вуглеводного обміну.

Експериментальний пошук умов для трансдиференціації стромальних стовбурових клітин кісткового мозку в клітини-попередники нервової та печінкової тканини триває. Увага дослідників зосереджена на комбінаціях індукторів диференціації та спеціальних кондиціонованих середовищ. Зокрема, для виділення первинної культури стромальних клітин клітини кісткового мозку, промиті та ресуспендовані в культуральному середовищі DMEM/F12 (1/1) з 10% фетальної телячої сироватки, висіваються з щільністю 200 000/см2. Через 24 години неадгезивні клітини видаляють, а фібробластоподібні клітини, прикріплені до пластику, культивують протягом одного тижня. Для диференціації стромальних клітин кісткового мозку в нейробласти використовується кондиціоноване середовище, отримане шляхом триденного культивування первинної культури ембріональних фібробластів миші, а також середовище DMEM/F12 (1/1) з 2% фетальної телячої сироватки та додаванням 20 нг/мл NF або 10-6 М ретиноєвої кислоти (нейроіндуктори, що використовуються для нейронної диференціації ембріональних стовбурових клітин миші та людини). Диференціацію стромальних клітин кісткового мозку в клітини-попередники гепатоцитів індукують у кондиціонованому середовищі, створеному в результаті триденного культивування первинної культури ембріональних клітин печінки миші в середовищі DMEM/F12 (1/1) з додаванням 10% фетальної телячої сироватки.

Тут слід ще раз зазначити, що колонієутворюючі клітини строми кісткового мозку є гетероморфними та можуть бути розділені на два типи. До першого типу належать фібробластоподібні клітини, що утворюють філоподії з великими ядрами та одним або двома ядерцями. Другий тип представлений дрібними веретеноподібними клітинами. При культивуванні клітин обох типів у кондиціонованому середовищі, отриманому на живильному шарі первинних ембріональних фібробластів миші, клітини, подібні до нейробластів, з'являються в культурі на 3-4-й день. На цьому етапі вони найчастіше мають веретеноподібну форму з одним або двома довгими відростками, що закінчуються філоподіями. Рідше зустрічаються пірамідальні або зірчасті клітини з короткими дендритами. Дендрити деяких нейробластів мають характерні розширення (бруньки росту) та розгалуження у своїй дистальній частині, тоді як інші мають чіткі конуси росту з філоподіями, через які проростають дендрити. Подібні морфологічні ознаки (бруньки та конуси росту з філоподіями), властиві нейробластам, що диференціюються в нейрони, були детально описані в дослідженнях з нейрогенезу. На основі цього деякі автори роблять висновок, що знайдені ними в культурі клітини є нейробластами. Зокрема, Є. Щегельська та співавтори (2002) після культивування первинної культури стромальних клітин протягом двох тижнів у кондиціонованому середовищі, яке змінювалося кожні 3-4-й день, виявили, що деякі клітини проліферували, зберігаючи при цьому недиференційований стан. Зовні такі клітини нагадували фібробласти та виявлялися в культурі разом з диференціювальними нейробластами. Більшість клітин (близько 80%) перебували на різних стадіях диференціації в клітини нервової тканини, переважно в нейрони. Дендритні відростки цих клітин тісно контактували один з одним, завдяки чому клітини поступово формували ділянки нервової мережі на субстраті у вигляді довгих багатоклітинних ниток. Дендритні відростки нейробластів ставали значно довшими, деякі з них перевищували довжину самого тіла нейрона у 8-10 разів. Поступово збільшувалася частка пірамідних та зірчастих клітин. Дендрити зірчастих клітин розгалужувалися. На думку авторів, пізніша диференціація пірамідальних та зірчастих клітин порівняно з веретеноподібними клітинами відповідає послідовності стадій нормального нейрогенезу у тварин. В результаті автори роблять висновок, що стромальні стовбурові клітини кісткового мозку зазнають індукованого нейрогенезу, під час якого всі три основні типи нейронів утворюються з нейробластів in vitro. Попередники нервових клітин також були виявлені під час культивування стромальних клітин кісткового мозку протягом 3-4 днів у середовищі з 2% фетальної сироватки та 20 нг/мл LIF. Але в цьому випадку стовбурові клітини ділилися дуже повільно, диференціація нейробластів відбувалася лише у 30% випадків і вони не утворювали нейрональних мереж. Використовуючи ретиноєву кислоту як один з індукторів диференціації нервових клітин, автори отримали до 25-30% нервових клітин у культурі,з переважно гліальними елементами – астроцитами та олігодендроцитами. Нейрони становили лише третину всіх нервових клітин, хоча вони були представлені всіма трьома типами: веретеноподібними, пірамідальними та зірчастими клітинами. На 6-й день культивування стромальних клітин у середовищі з ретиноєвою кислотою нервові клітини стали більш диференційованими, а в окремих пірамідних нейронах були виявлені аксони, які в нормальному нейроонтогенезі з'являються пізніше формування дендритних відростків. На думку авторів, незважаючи на низький вихід нервових клітин, метод індукції ретиноєвою кислотою має свої переваги: олігодендроцити та астроцити виконують мієлінізуючі та поживні функції під час росту дендритів та аксонів і необхідні для нормального формування нервової тканини. Тому для відновлення її пошкоджених ділянок in vivo краще використовувати суспензію нейронів, збагачену гліальними клітинами.

У другій серії експериментів автори спробували індукувати диференціацію стромальних клітин кісткового мозку в клітини печінки. Після трьох днів культивування стромальних стовбурових клітин кісткового мозку в кондиційованому середовищі, отриманому шляхом інкубації ембріональних гепатоцитів миші, були виявлені великі, сферичні клітини, часто двоядерні, з цитоплазматичними включеннями різного розміру. Ці клітини перебували на різних стадіях диференціації та відрізнялися розміром, кількістю ядер та включеннями в цитоплазмі. У більшості цих клітин було виявлено глікоген, на основі чого автори ідентифікували їх як клітини-попередники гепатоцитів. Оскільки в культурі не було виявлено клітин, подібних до нейробластів, було зроблено висновок, що кондиційоване середовище, отримане в результаті культивування ембріональних гепатоцитів, не містило факторів диференціації нервових клітин і, навпаки, містило фактори, що індукують диференціацію стромальних клітин кісткового мозку в клітини-попередники гепатоцитів. На завершення автори припускають наявність плюрипотентності в стромальних клітинах кісткового мозку, оскільки вони диференціюються in vitro в клітини нервової або печінкової тканини залежно від конкретного кондиційованого середовища та використаних індукторів.

Деякі дослідження справді правильно показали диференціацію стромальних клітин кісткового мозку в кардіоміоцити, хрящові, кісткові та нервові тканини. Існують дані, що серед клітин кісткового мозку існують популяції стовбурових клітин, здатних диференціюватися в гепатоцити. З огляду на ці дані, результати вищезазначених експериментів на мишах все ще можна вважати подальшим підтвердженням наявності в кістковому мозку плюрипотентних мезенхімальних стовбурових клітин, здатних диференціюватися в клітини різних тканин дорослого організму.

Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин

У клінічній трансплантології мезенхімальні стовбурові клітини людини можуть бути використані для забезпечення експансії гемопоетичних стовбурових клітин, а також їх ранніх прекомітованих нащадків. Зокрема, введення аутологічних гемопоетичних стовбурових клітин та МСК онкологічним хворим після високодозової хіміотерапії прискорює відновлення кількості нейтрофілів та тромбоцитів у периферичній крові. Ало- та аутологічні трансплантати мезенхімальних стовбурових клітин використовуються для лікування множинної мієломи, апластичної анемії та спонтанної тромбоцитопенії – захворювань, пов'язаних з первинним дефектом строми гемопоетичної тканини. Ефективність клітинної терапії при онкогематологічній патології в багатьох випадках вища при одночасному введенні стромальних та гемопоетичних стовбурових клітин, що проявляється скороченням післяопераційного періоду відновлення гемопоезу, зменшенням кількості летальних випадків внаслідок неселективного руйнування регіональних та циркулюючих ракових клітин, при яких гинуть також власні гемопоетичні клітини-попередники пацієнта. Перспективи використання МСК та інших мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників у клінічній практиці зумовлені відносною легкістю їх отримання з аспіратів кісткового мозку, розширення в культурі та трансфекції терапевтичних генів. Водночас локальна імплантація мультипотентних мезенхімальних клітин-попередників може бути використана для компенсації локальних дефектів тканин, а у разі системних дисфункцій тканин мезенхімального походження не виключається їх введення в загальний кровотік.

Автори робіт, у яких аналізуються перспективи використання МСК для локальної, системної трансплантації та генної терапії з точки зору біології стромальних клітин, більш обережні у своїх міркуваннях. Постнатальний кістковий мозок традиційно розглядається як орган, що складається з двох основних систем чітко визначених клітинних ліній – власне кровотворної тканини та пов’язаної з нею опорної строми. Тому мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку спочатку розглядалися виключно як джерело стромальної основи для продукування регуляторних факторів кровотворного мікрооточення. Потім увага дослідників переключилася на вивчення ролі МСК як стовбурового джерела скелетних тканин. Найновіші дані вказують на неочікуваний потенціал диференціації стромальних клітин кісткового мозку з утворенням нервової або м’язової тканини. Іншими словами, мезенхімальні стовбурові клітини проявляють трансгермінальну пластичність – здатність диференціюватися в типи клітин, фенотипічно не пов’язані з клітинами вихідної тканини. Водночас, деякі аспекти біології стромальних клітин кісткового мозку залишаються неясними та невирішеними як у загальнобіологічному плані, так і в окремих деталях, включаючи ідентифікацію, природу, походження, розвиток та функцію стромальних клітин кісткового мозку in vivo, а також допустимий потенціал диференціації ex vivo та можливості терапевтичного використання in vivo. Отримані дані щодо потенціалу МСК, а також результати досліджень регенеративного потенціалу інших стовбурових клітин, різко суперечать усталеним у біології догмам.

При культивуванні за низької щільності стромальні стовбурові клітини кісткового мозку утворюють окремі колонії, кожна з яких походить з однієї клітини-попередника. Відсоток стромальних клітин-попередників у ядерних клітинах кісткового мозку, що визначається здатністю до формування колоній, сильно залежить як від умов культивування, так і від виду МСК. Наприклад, у гризунів присутність опромінених клітин-живилок кісткового мозку та сироватки крові в культурі є абсолютно необхідною для отримання максимальної кількості стромальних клітин-попередників, тоді як у людей ефективність формування колоній мезенхімальних стовбурових клітин не залежить як від живильного середовища, так і від культурального середовища. Кількість відомих мітогенних факторів, що стимулюють проліферацію стромальних клітин-попередників, обмежена. До них належать PDGF, EGF, FGF, TGF-β та IGF1. За оптимальних умов культивування поліклональні лінії МСК можуть витримувати понад 50 клітинних поділів in vitro, що дозволяє отримати мільярди стромальних клітин кісткового мозку з 1 мл його аспірату.

Однак популяція стромальних клітин кісткового мозку є неоднорідною, що проявляється як мінливістю розмірів колоній, різною швидкістю їх утворення, так і різноманітністю клітинної морфології, яка охоплює діапазон від фібробластоподібних веретеноподібних до великих плоских клітин. Під час розвитку таких культур фенотипова гетерогенність відзначається також через 20 днів. Деякі колонії характеризуються високою експресією лужної фосфатази, інші взагалі її не експресують, а колонії третього типу є фосфатазопозитивними в центральній області та фосфатазонегативними на периферії. Окремі колонії утворюють вузлики кісткової тканини (початок мінералізації матриксу відзначається забарвленням алізариновим червоним або на кальцій за Ван Коссом). В інших колоніях відбувається накопичення жиру, що ідентифікується за допомогою G-забарвлення олійним червоним. Рідше колонії мезенхімальних стовбурових клітин утворюють хрящі, забарвлені альціановим синім).

Після ектопічної трансплантації експериментальним тваринам поліклональні лінії MGK утворюють ектопічну кістку з ретикулярною стромою, пов'язаною з мієлопоезом та адипоцитами, а рідше – з хрящовою тканиною. При трансплантації моноклональних ліній стромальних клітин кісткового мозку в деяких випадках спостерігається химеризм, при якому de novo кістка складається з клітин кісткової тканини, містить строму та адипоцити донорського походження, тоді як клітини гемопоетичного ряду та судинної системи походять від реципієнта.

Результати цих досліджень підтверджують стовбурову природу клітин-попередників строми кісткового мозку, з яких була отримана клональна лінія. Вони також вказують на те, що не всі клітини, клоногенні в культурі, є справді мультипотентними стовбуровими клітинами. Деякі дослідники вважають, і ми поділяємо їхню думку, що найдостовірнішу інформацію про реальний потенціал диференціації окремих клонів можна отримати лише in vivo після трансплантації, а не шляхом визначення фенотипу їхніх похідних in vitro. Експресія в культурі фенотипових маркерів остео-, хондро- або адипогенезу (визначених за допомогою мРНК або гістохімічними методами) і навіть продукція мінералізованої матриці не відображають ступінь плюрипотентності окремого клону in vivo. Тому ідентифікація стовбурових клітин у групі стромальних клітин можлива лише a posteriori, за відповідних умов біологічного трансплантаційного аналізу. Зокрема, хондрогенез дуже рідко спостерігається у відкритих системах трансплантації, тоді як утворення хряща далеко не рідкість у закритих системах, таких як дифузійні камери або мікромасові культури стромальних клітин in vitro, де досягається локальний низький тиск кисню, що сприяє утворенню хрящової тканини. Отже, навіть техніка трансплантації, а також неспецифічні умови культивування in vitro, суттєво впливають на діапазон диференціації МСК.

Експериментальна трансплантація за заданих експериментальних умов є золотим стандартом для визначення потенціалу диференціації стромальних клітин кісткового мозку та ключовим елементом у їх ідентифікації. Історично дослідження трансплантації стромальних клітин кісткового мозку пов'язані із загальною проблемою трансплантації кісткового мозку. Встановлено, що гемопоетичне мікрооточення створюється шляхом пересадки ліній стромальних клітин кісткового мозку та забезпечує ектопічний розвиток гемопоетичної тканини в зоні трансплантації. Походження мікрооточення від донора та гемопоетичної тканини від хазяїна дозволяє розглядати ектопічну кістку як справжню «інвертовану» трансплантацію кісткового мозку. Локальна трансплантація стромальних клітин кісткового мозку сприяє ефективній корекції дефектів кісток, більш вираженій, ніж при спонтанній репаративній регенерації. Кілька доклінічних досліджень на експериментальних моделях переконливо продемонстрували можливість використання трансплантатів стромальних клітин кісткового мозку в ортопедії, хоча для оптимізації цих методів, навіть у найпростіших випадках, потрібна найретельніша робота та аналіз. Зокрема, оптимальні умови для розмноження остеогенних стромальних клітин ex vivo ще не встановлені, структура та склад ідеального носія, а також кількість клітин, необхідних для об'ємної регенерації кістки, залишаються нерозвиненими.

Окрім використання ex vivo розмножених стромальних клітин кісткового мозку для регенерації тканин мезенхімального походження, неортодоксальна пластичність МСК відкриває потенційні можливості для регенерації нервових клітин або доставки генних продуктів до ЦНС. В принципі, це спрощує клітинну терапію пошкоджень нервової системи, оскільки немає потреби в отриманні аутологічних людських нервових стовбурових клітин. Повідомлялося про потенційне застосування клітин кісткового мозку для генерації кардіоміоцитів та міогенних клітин-попередників як справжнього стромального, так і екстрастромального походження.

Проводяться експерименти з системної трансплантації стромальних клітин кісткового мозку для лікування поширених захворювань скелета. Немає сумнівів, що стромальні клітини кісткового мозку є популяцією, відповідальною за генетичні порушення при захворюваннях скелета, що добре ілюструється векторним перенесенням генетичної інформації за допомогою цих клітин, що призводить до утворення патологічної кісткової тканини у експериментальних тварин. Однак здатність стромальних клітин до імплантації, приживлення, проліферації та диференціації в кістках скелета після введення в загальний кровотік ще не доведена.

Частково це пояснюється тим, що при стандартній трансплантації кісткового мозку строма не пересаджується разом з кровотворною тканиною, тому суворі критерії оцінки успішного приживлення системно введених стромальних клітин ще не розроблені. Слід пам'ятати, що наявність маркерних генів в тканинних екстрактах або виділення клітин донорського походження в культурі не свідчить про приживлення клітин, а лише про їх виживання. Навіть внутрішньоартеріальна ін'єкція стромальних клітин кісткового мозку в кінцівку миші може призвести практично до нульового приживлення, незважаючи на те, що клітини донорського походження знаходяться у великій кількості в мікросудинах кісткового мозку. На жаль, такі клітини зазвичай описуються як «приживлені» просто на основі виявлення маркерних генів донорських клітин в культурі ex vivo. Крім того, необхідно надати переконливі докази довготривалої інтеграції диференційованих та функціонально активних клітин донорського походження в досліджувані тканини. У багатьох опублікованих статтях, що повідомляють про приживлення стромальних клітин кісткового мозку в скелет, вражає відсутність чітких даних такого роду. Однак слід зазначити, що деякі коректні експерименти на тваринах справді встановили обмежене, але реальне приживлення стромальних клітин-попередників після їх системного введення.

Ці дані узгоджуються з результатами досліджень щодо можливості доставки міогенних клітин-попередників кісткового мозку до м'язів через судинну систему. Однак не слід забувати, що як скелетна, так і м'язова тканини формуються під час розвитку та росту на основі позасудинних рухів клітин, які використовують процеси міграції, що не залучають кровообіг. Якщо існує незалежний кровообіговий шлях доставки клітин-попередників до тканин твердої фази, чи можна припустити існування фізіологічно циркулюючих мезенхімальних клітин-попередників? Яке походження цих клітин як у організмі, що розвивається, так і в постнатальному періоді, і як вони проникають крізь судинну стінку? Вирішення цих питань видається абсолютно необхідним і вимагає найретельнішого доклінічного аналізу. Навіть після того, як будуть знайдені відповіді на ці питання, проблемні кінетичні аспекти, пов'язані з ростом скелета та ремоделюванням сполучної тканини, залишатимуться невирішеними. Водночас лікування порушень остеогенезу шляхом заміни всієї популяції мутованих клітин-попередників скелета здоровими стромальними елементами видається реальною клінічною перспективою. У цьому випадку локальні зони переломів або деформації, зумовлені патологічним остеогенезом, а також деструктивні зміни кісткової тканини, можуть бути скориговані за допомогою стромальних стовбурових клітин, культивованих in vitro. Тому доцільно зосередити майбутні дослідження на проблемах трансформації або генетичної корекції аутологічних мутованих остеогенних клітин-попередників ex vivo.

Генна інженерія клітин, короткочасна чи постійна, стала основою клітинної та молекулярної біології, джерелом багатьох наукових відкриттів, що стосуються ролі окремих білків у клітинному метаболізмі in vitro та in vivo. Використання молекулярних технологій для корекції спадкової патології та захворювань людини є дуже перспективним для практичної медицини, оскільки властивості стромальних стовбурових клітин кісткового мозку дозволяють розробляти унікальні схеми трансплантації для корекції генетичних захворювань скелета. Водночас мезенхімальні клітини-попередники можна легко отримати від майбутнього реципієнта, вони піддаються генетичним маніпуляціям та здатні розмножуватися у великих кількостях за короткий проміжок часу. Використання мезенхімальних стовбурових клітин дозволяє уникнути обмежень та ризиків, пов'язаних з доставкою генетичного інформаційного матеріалу безпосередньо пацієнту за допомогою внутрішньосудинних векторних конструкцій. Подібна стратегія застосовна до ембріональних стовбурових клітин, але аутологічні постнатальні стромальні клітини кісткового мозку є більш кращим матеріалом, оскільки їх введення виключає можливі імунологічні посттрансплантаційні ускладнення. Для досягнення короткочасного ефекту, наприклад, для прискорення регенерації кісток, найоптимальнішим методом є генетична модифікація мезенхімальних стовбурових клітин за допомогою електропорації, хімічного злиття, ліпофекції, плазмід та аденовірусних конструкцій. Зокрема, вірусна трансфекція в стромальні клітини кісткового мозку BMP-2 довела свою ефективність у прискоренні регенерації кісток при експериментальній політравмі. Створення аденовірусних векторних конструкцій є кращим через відсутність токсичності. Однак генетична модифікація стромальних клітин кісткового мозку в цьому випадку характеризується надзвичайно низькою стабільністю. Крім того, нормальні трансформовані стромальні клітини кісткового мозку потребують використання векторних носіїв генетичної інформації, які є в 10 разів більш інфекційними, ніж інші типи клітин, що значно збільшує відсоток загибелі трансфікованих клітин.

Лікування рецесивних захворювань, спричинених низькою або нульовою біологічною активністю певних генів, вимагає тривалої або постійної модифікації мезенхімальних стовбурових клітин, що вимагає використання аденоасоційованих вірусів, ретровірусів, лентивірусів або адено-ретровірусних химер. Транспортні області цих вірусів здатні переносити великі трансфекти ДНК (до 8 кб). У науковій літературі вже повідомлялося про екзогенну біологічну активність стромальних клітин кісткового мозку, трансфікованих ретровірусними конструкціями, що кодують синтез регуляторних та маркерних молекул – IL-3, CD2, фактора VIII, а також ферментів, що беруть участь у синтезі L-ДОФА. Однак, навіть у цих дослідженнях автори вказують на низку обмежень, які необхідно подолати перед практичним застосуванням цієї технології. Перша проблема полягає в оптимізації процесу модифікації МСК ex vivo. Відомо, що тривала (3-4 тижні) проліферація стромальних клітин кісткового мозку in vitro знижує їх трансфекцію. Водночас, для досягнення високого рівня генетичної модифікації МСК необхідно провести кілька циклів трансфекції. Друга проблема пов'язана з тривалістю терапевтичної експресії генів, яка поки що не перевищує чотирьох місяців. Природне зниження ефективної експресії генів зумовлене інактивацією промотора та загибеллю модифікованих клітин. За загальних перспектив передачі генетичної інформації за допомогою мезенхімальних стовбурових клітин, результати попередніх досліджень вказують на необхідність подальшої оптимізації методів трансфекції ex vivo, вибору адекватного промотора, що регулює біологічну активність у бажаному напрямку, та підвищення здатності модифікованих стромальних клітин кісткового мозку до самопідтримки in vivo після трансплантації. Слід зазначити, що використання ретровірусних конструкцій для модифікації стромальних клітин кісткового мозку у бажаному напрямку не завжди вимагає їх обов'язкового приживлення. Трансфіковані мезенхімальні стовбурові клітини можуть виконувати коригувальну функцію на тлі стабільного проживання та без обов'язкового активного фізичного включення та функціонування у сполучній тканині. У цьому випадку їх слід розглядати як біологічний міні-насос, що виробляє in vivo фактор, дефіцит якого визначає прояв генетичної патології.

Використання трансформованих стромальних клітин кісткового мозку для лікування домінантної генетичної патології, яка характеризується експресією гена з патологічною або аномальною біологічною активністю, є набагато проблематичнішим, оскільки в цьому випадку необхідно блокувати передачу або реалізацію спотвореної генетичної інформації. Одним із методів генної інженерії є гомологічна рекомбінація ембріональних стовбурових клітин з метою створення трансгенних тварин. Однак надзвичайно низький ступінь гомологічної рекомбінації в поєднанні з проблемами ідентифікації, розділення та розширення таких рекомбінантів навряд чи сприятиме широкому використанню цього методу найближчим часом, навіть якщо будуть розроблені нові технологічні методи. Другий підхід у генній терапії домінантної патології базується на автоматичній корекції пошкодженої ДНК, оскільки генетичні мутації можна виправити шляхом введення екзогенної ДНК з потрібною послідовністю (короткі ДНК-олігонуклеотиди або химерні РНК/ДНК-олігонуклеотиди), яка зв'язується з гомологами в пошкодженому геномі. Третій варіант передбачає блокування передачі патологічної інформації, що досягається завдяки використанню спеціально розроблених олігонуклеотидів, які зв'язуються зі специфічним геном, утворюючи потрійну спіральну структуру, що виключає можливість транскрипції.

Хоча корекція генетичного захворювання на рівні геному залишається найоптимальнішим і кращим терапевтичним методом, мРНК також є перспективним вектором (можливо, навіть більш доступним) для блокування домінантно-негативного гена. Молекули білків з антисенсовим олігонуклеотидом або повними послідовностями, що блокують зв'язування мРНК з клітинним біосинтетичним апаратом, вже давно використовуються для пригнічення трансляції та/або посилення деградації мРНК. Крім того, дволанцюгова РНК індукує швидку деградацію мРНК, механізм якої залишається незрозумілим. Однак малоймовірно, що просте усунення мРНК, транскрибованих з мутантного алеля з короткими або одиничними мутаціями, сприятиме експресії мРНК нормального алеля. Альтернативою є використання рибосинтезів типу «молоток» та «шпилька», які мають здатність зв'язуватися з високоспецифічними ділянками мРНК з подальшою індукцією їх розщеплення та інактивацією під час трансляції. Можливість використання цього методу в терапії патологічного остеогенезу наразі вивчається. Незалежно від того, що саме є мішенню – геномні чи цитоплазматичні елементи, успіх нових технологій генної терапії визначатиметься ефективністю включення реагентів у стромальні клітини кісткового мозку ex vivo, оптимальним вибором специфічного вектора та стабільною здатністю мезенхімальних стовбурових клітин експресувати необхідні фактори in vivo.

Таким чином, відкриття мезенхімальних стовбурових клітин з їх несподіваними властивостями створює нову концептуальну схему для розвитку клітинних ліній. Однак, необхідні подальші міждисциплінарні дослідження, щоб зрозуміти біологічну роль стромальних стовбурових клітин, їхню природу, їхню здатність до трансдиференціації або дедиференціації, їхнє фізіологічне значення під час ембріонального розвитку, постнатального росту, дозрівання та старіння, а також при захворюваннях людини.