Гемопоетичні стовбурові клітини жовткового мішка

Очевидно, різні проліферативні і диференціювальні потенції гемопоетичних стовбурових клітин обумовлені особливостями їх онтогенетичного розвитку, оскільки в процесі онтогенезу у людини змінюється навіть локалізація головних областей кровотворення. Клітини-попередники гемопоезу жовткового мішка плода коммітірованних до утворення виключно ерітропоетіческой лінії клітин. Після міграції первинних ГСК в печінку і селезінку в мікрооточенні цих органів спектр ліній коммитирование розширюється. Зокрема, гемопоетичні стовбурові клітини набувають здатність до генерації клітин лімфоїдної лінії. У передродовому періоді клітини-попередники кровотворення досягають зони остаточної локалізації і заселяють кістковий мозок. В процесі внутрішньоутробного розвитку в крові плоду міститься значна кількість стовбурових кровотворних клітин. Наприклад, на 13-му тижні вагітності рівень ГСК досягає 18% від загального числа мононуклеарних клітин крові. Надалі спостерігається прогресивне зниження їх змісту, а й перед самими пологами кількість ГСК в пуповинної крові мало відрізняється від їх кількості в кістковому мозку.

Згідно класичним уявленням, природна зміна локалізації кровотворення в процесі ембріонального розвитку ссавців здійснюється шляхом міграції і впровадження в нове микроокружение поліпотентних гемопоетичних стовбурових клітин - з жовткового мішка в печінку, селезінку і кістковий мозок. Оскільки на ранніх етапах ембріонального розвитку кроветворная тканина містить велику кількість стовбурових клітин, яке зменшується у міру дозрівання плоду, найбільш перспективною для отримання гемопоетичних стовбурових клітин вважається гемопоетичних тканину ембріональної печінки, виділена з абортного матеріалу на 5-8-тижневих термінах гестації.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Питання походження гемопоетичних стовбурових клітин

Той факт, що ембріональний утворення еритроцитів бере свій початок в кров'яних острівцях жовткового мішка, не викликає сумнівів. Однак диференціювальний потенціал in vitro гемопоетичних х клітин жовткового мішка вельми обмежений (вони диференціюються переважно в еритроцити). Слід зазначити, що трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка не здатна відновити гемопоез на тривалий час. Виявилося, що не ці клітини є попередниками ГСК дорослого організму. Справжні ГСК з'являються раніше, на 3-5-му тижні внутрішньоутробного розвитку, в зоні формування тканин шлунка і ендотелію кровоносних судин (paraaortic splanchnopleura, P-SP), а також в місці закладки аорти, гонад і первинних нирок - в області мезонефроса або так званого AGM-району. Показано, що клітини AGM-району є джерелом не тільки ГСК, але і ендотеліальних клітин кровоносних судин, а також остеокластів, що втягуються в процеси формування кісткової тканини. На 6-му тижні гестації ранні гемопоетичні клітини-попередники з AGM-району переміщаються в печінку, яка залишається основним кровотворних органом плода до самого народження.

Оскільки цей момент дуже важливий з точки зору клітинної трансплантації, проблема походження ГСК в процесі ембріогенезу людини заслуговує більш докладного викладу. Класичні уявлення про те, що гемопоетичні стовбурові клітини ссавців і птахів відбуваються з екстраембріональной джерела, засновані на дослідженнях Меткалфа і Мура, які вперше використали методи клонування ГСК і їх нащадків, виділених з жовткового мішка. Результати їх робіт послужили основою для міграційної теорії, згідно з якою ГСК, вперше виникнувши в желточном мішку, послідовно заселяють транзиторні і дефінітивного кровотворні органи в міру формування в них відповідного мікрооточення. Ось так і утвердилася точка зору, що генерація ГСК, спочатку локалізована в желточном мішку, служить клітинної основою дефинитивного гемопоезу.

Кровотворні родоначальні клітини жовткового мішка відносяться до категорії найбільш ранніх клітин-попередників гемопоезу. Їх фенотип описується формулою AA4.1 + CD34 + c-kit +. На відміну від ГСК зрілого кісткового мозку, вони не експресують антигени Sca-1 і молекули МНС. Здавалося б, що поява маркерних антигенів на поверхневих мембранах ГСК жовткового мішка при культивуванні відповідає їх диференціювання в процесі ембріонального розвитку з формуванням коммітірованних ліній гемопоезу: знижується рівень експресії антигену CD34 і Thy-1, підвищується експресія CD38 і CD45RA, з'являються молекули HLA-DR. При подальшій, індукованої цитокінами і факторами росту, спеціалізації in vitro починається експресія антигенів, специфічних для гемопоетичних клітин-попередників певної клітинної лінії. Однак результати вивчення ембріонального кровотворення у представників трьох класів хребетних тварин (земноводних, птахів і ссавців) і, особливо, аналіз походження ГСК, відповідальних за дефінітивний гемопоез в постнатальному онтогенезі, суперечать класичним уявленням. Встановлено, що у представників всіх розглянутих класів в ембріогенезі формуються дві незалежні області, в яких виникають ГСК. Екстраембріональной "класична" область представлена жовтковим мішком або його аналогами, тоді як недавно виявлена інтраембріональная зона локалізації ГСК включає парааортальной мезенхіму і AGM-район. Сьогодні можна стверджувати, що у амфібій і птахів дефінітивного ГСК відбуваються з інтраембріональних джерел, тоді як у ссавців і людини участь ГСК жовткового мішка в Дефінітивного гемопоезі повністю виключити ще не можна.

Ембріональний кровотворення в желточном мішку є, по суті, первинним еритропоезу, для якого характерно збереження ядра на всіх стадіях дозрівання еритроцитів і синтез гемоглобіну фетального типу. Згідно з останніми даними, хвиля первинного еритропоезу завершується в желточном мішку на 8-у добу ембріонального розвитку. За нею йде період накопичення дефінітивних еритроїдних клітин-попередників - BFU-E, які утворюються виключно в желточном мішку і вперше з'являються на 9-ту добу гестації. На наступній стадії ембріогенезу вже формуються дефінітивного еритроїдні клітини-попередники - CFU-E, а також (!) Огрядні клітини і CFU-GM. Саме на цьому грунтується існування точки зору, згідно з якою дефінітивного клітини-попередники виникають в желточном мішку, мігрують з кровотоком, осідають в печінці і швидко ініціюють першу фазу інтраембріонального кровотворення. За таким уявленням, жовтковий мішок можна розглядати, з одного боку, як місце первинного еритропоезу, а з іншого - як перше джерело дефінітивних клітин-попередників гемопоезу в ембріональному розвитку.

Показано, що колониеобразующие клітини з високим проліферативним потенціалом можна виділити з жовткового мішка вже на 8-у добу гестації, тобто, задовго до замикання судинної системи зародка і жовткового мішка. Причому отримані з жовткового мішка клітини з високим проліферативним потенціалом in vitro утворюють колонії, розмір і клітинний склад яких не відрізняються від відповідних параметрів культурального зростання стовбурових клітин кісткового мозку. У той же час при ретрансплантаціі колонієутворюючих клітин жовткового мішка з високим проліферативним потенціалом формується значно більше дочірніх колонієутворюючих клітин і мультіпотентних клітин-попередників, ніж при використанні кістковомозкових клітин-попередників гемопоезу.

Остаточний висновок про роль гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка в Дефінітивного кровотворенні могли б дати результати роботи, в якій автори отримали лінію ендотеліальних клітин жовткового мішка (G166), яка ефективно підтримувала проліферацію його клітин з фенотипическими і функціональними характеристиками ГСК (AA4.1 + WGA +, низька щільність і слабкі адгезивні властивості). Зміст останніх при культивуванні на фидерном шарі клітин С166 протягом 8 діб збільшувалася більш ніж в 100 разів. У змішаних колоніях, які виросли на подслое з клітин лінії С166, були ідентифіковані макрофаги, гранулоцити, мегакаріоцити, бластні клітини і моноцити, а також клітини-попередники В- і Т-лімфоцитів. Клітини жовткового мішка, що ростуть на подслое з ендотеліальних клітин, мали здатність до самовідтворення і витримували в експериментах авторів до трьох пасажів. Відновлення з їх допомогою гемопоезу у статевозрілих мишей з важким комбінованим імунодефіцитом (SCID) супроводжувалося утворенням всіх типів лейкоцитів, а також Т- і В-лімфоцитів. Однак автори в своїх дослідженнях використовували клітини жовткового мішка 10-добового зародка, у якого екстра-та інтраембріональние судинні системи вже замкнуті, що не дозволяє виключити присутності серед клітин жовткового мішка ГСК інтраембріонального походження.

У той же час аналіз дифференцировочного потенціалу кровотворних клітин ранніх стадій розвитку, виділених до об'єднання судинних систем жовткового мішка і зародка (8-8,5 діб гестації), виявив наявність попередників Т- і В-клітин в желточном мішку, але не в тілі зародка . В системі in vitro методом двоступеневого культивування на монослое з епітеліальних і субепітеліальних клітин тимуса мононуклеарние клітини жовткового мішка диференціювалися в пре-Т-і зрілі Т-лімфоцити. У тих же умовах культивування, але на монослое з стромальних клітин печінки і кісткового мозку мононуклеари жовткового мішка диференціювалися в пре-В-клітини і зрілі IglVT-B-лімфоцити.

Результати цих досліджень свідчать про можливість розвитку клітин імунної системи з екстраембріональной тканини жовткового мішка, причому формування первинних Т- і В-клітинних ліній залежить від чинників стромального мікрооточення ембріональних гемопоетичних органів.

У роботах інших авторів також показано, що жовтковий мішок містить клітини з потенціями до лімфоїдної диференціювання, причому утворюються лімфоцити не відрізняються за антигенними характеристиками від таких у статевозрілих тварин. Встановлено, що клітини жовткового мішка 8-9-добового ембріона здатні відновлювати лімфопоез в атімоцітарном тимусі з виникненням зрілих CD3 + CD4 + - і СDЗ + СD8 + -лімфоцитів, що володіють оформленим репертуаром Т-клітинних рецепторів. Таким чином, тимус може заселятися клітинами екстраембріональной походження, однак при цьому не можна виключити ймовірну міграції в тимус ранніх клітин-попередників Т-лімфоцитів з інтраембріональних джерел лімфопоезу.

Разом з тим, трансплантація кровотворних клітин жовткового мішка дорослим опроміненим реципієнтам далеко не завжди завершується тривалої репопуляціі спустошених зон локалізації кровотворної тканини, a in vitro клітини жовткового мішка утворюють значно менше селезінкових колоній, ніж клітини AGM-району. У деяких випадках за допомогою клітин жовткового мішка 9-добового зародка все ж вдається досягти тривалої (до 6 місяців) репопуляціі кровотворної тканини опромінених реципієнтів. Автори вважають, що клітини жовткового мішка з фенотипом CD34 + c-kit + за здатністю до репопуляціі спустошених кровотворних органів не тільки не відрізняються від таких з AGM-району, а й більш ефективно відновлюють гемопоез, оскільки в желточном мішку їх міститься майже в 37 разів більше .

Треба зауважити, що в експериментах використовувалися кровотворні клітини жовткового мішка з маркерними антигенами ГСК (c-kit + і / або CD34 + і CD38 +), які вводилися безпосередньо в печінку або в черевну вену потомства самок мишей, які отримували ін'єкцію бусульфана на 18-у добу вагітності. У таких новонароджених тварин власний мієлопоез був різко пригнічений через елімінації стовбурових кровотворних клітин, викликаної бусульфаном. Після трансплантації ГСК жовткового мішка протягом І місяців в периферичної крові реципієнтів виявлялися формені елементи, містять донорський маркер - гліцерофасфатдегідрогеназу. Встановлено, що ГСК з жовткового мішка відтворення рівня клітин лімфоїдної, мієлоїдної та еритроїдної ліній диференціювання в крові, тимусі, селезінці і кістковому мозку, причому рівень хімерізма був вище в разі внутрішньопечінкового, а не внутрішньовенного введення клітин жовткового мішка. Автори вважають, що ГСК жовткового мішка зародків ранніх стадій розвитку (до 10 діб) для успішного заселення кровотворних органів дорослих реципієнтів потребують попереднього взаємодії з кровотворних мікрооточенням печінки. Не виключено, що в ембріогенезі існує унікальна стадія розвитку, коли клітини жовткового мішка, мігруючи спочатку в печінку, набувають потім здатність заселяти строму кровотворних органів статевозрілих реципієнтів.

У зв'язку з цим треба зауважити, що хімерізм клітин імунної системи досить часто спостерігається після трансплантації клітин кісткового мозку опроміненим статевозрілим реципієнтам - в крові останніх клітини донорського фенотипу в досить великій кількості зустрічаються серед В-, Т-лімфоцитів і гранулоцитів реципієнта, що триває не менше 6 місяців.

Морфологічними методами кровотворні клітини у ссавців вперше виявляються на 7-у добу розвитку зародка і представлені кровотворними острівцями всередині судин жовткового мішка. Однак природна кроветворная диференціювання в желточном мішку обмежена первинними еритроцитами, що вони бережуть ядра і синтезують фетальний гемоглобін. Проте, традиційно вважалося, що жовтковий мішок служить єдиним джерелом ГСК, мігруючих в кровотворні органи зародка і забезпечують дефінітивний гемопоез у дорослих тварин, оскільки поява ГСК в тілі ембріона збігається з замиканням судинних систем жовткового мішка і зародка. На користь цієї точки зору свідчать дані про те, що клітини жовткового мішка при клонуванні in vitro дають початок гранулоцитам і макрофагів, a in vivo - селезінковими колоніям. Потім в ході трансплантаційних експериментів було встановлено, що кровотворні клітини жовткового мішка, які в самому желточном мішку здатні диференціюватися тільки в первинні еритроцити, в мікрооточенні печінки новонароджених і дорослих SCID-мишей, спустошеного тимуса або стромального фідера набувають здатність до репопуляціі кровотворних органів з відновленням всіх ліній гемопоезу навіть у дорослих тварин-реципієнтів. В принципі, це дозволяє віднести їх до категорії справжніх ГСК - як клітин, що функціонують і в постнатальному періоді. Допускається, що жовтковий мішок, поряд з областю AGM, служить джерелом ГСК для дефинитивного кровотворення у ссавців, проте до цих пір не зрозуміле їх внесок в розвиток кровотворної системи. Чи не зрозумілий і біологічний сенс існування в ранньому ембріогенезі ссавців двох кровотворних органів з подібними функціями.

Пошук відповідей на ці питання триває. In vivo вдалося довести присутність в желточном мішку 8-8,5-добових зародків клітин, відновлюють лімфопоез у сублетальні опромінених SCID-мишей з вираженим дефіцитом Т- і В-лімфоцитів. Кровотворні клітини жовткового мішка вводилися як внутрибрюшинно, так і безпосередньо в тканину селезінки і печінки. Через 16 тижнів у реципієнтів виявлялися TCR / CD34 \ CD4 + і CD8 + Т-лімфоцити і B-220 + IgM + В-лімфоцити, марковані донорськими антрхгенамі МНС. При цьому в тілі 8-8,5-добових зародків стовбурових клітин, здатних до такого відновлення імунної системи, автори не виявили.

Кровотворні клітини жовткового мішка володіють високим проліферативним потенціалом і здатні до тривалого само- відтворення in vitro. Деякі автори ідентифікують ці клітини як ГСК на підставі тривалої (майже 7 місяців) генерації еритроїдних клітин-попередників, що відрізняються від кістковомозкових родоначальників еритроїдної лінії більшою тривалістю пассірованія, великими розмірами колоній, підвищеною чутливістю до ростовим факторів і більш тривалої проліферації. Крім того, при відповідних умовах культивування клітин жовткового мішка in vitro утворюються і клітини-попередники лімфоїдного ряду.

Наведені дані в загальному дозволяють вважати жовтковий мішок джерелом ГСК, причому менш коммітірованних і тому володіють великим проліферативним потенціалом, ніж стовбурові клітини кісткового мозку. Однак, незважаючи на те що жовтковий мішок містить поліпотентні кровотворні клітини-попередники, тривалий час підтримують різні лінії кровотворної диференціювання in vitro, єдиним критерієм повноцінності ГСК є їх здатність до тривалої репопуляціі органів гемопоезу реципієнта, кровотворні клітини якого зруйновані або генетично дефектні. Таким чином, ключове питання полягає в тому, чи можуть поліпотентні кровотворні клітини жовткового мішка мігрувати і заселяти кровотворні органи і целесоорбразно переглядати відомі роботи, в яких продемонстровано їх можливості репопуляціі кровотворних органів статевозрілих тварин з утворенням основних гемопоетичних ліній. У ембріонів птахів ще в 70-і роки були виявлені інтраембріональние джерела дефінітивних ГСК, що вже тоді поставило під сумнів усталені уявлення про екстраембріональной походження ГСК, в тому числі і у представників інших класів хребетних. В останні кілька років з'явилися публікації про наявність у ссавців і людини подібних інтраембріональних ділянок, що містять ГСК.

Ще раз відзначимо, що фундаментальні знання в цій галузі є вкрай важливими для практичної клітинної трансплантології, оскільки допоможуть не тільки визначити кращий джерело ГСК, а й встановити особливості взаємодії первинних кровотворних клітин з генетично чужорідним організмом. Відомо, що введення стовбурових кровотворних клітин фетальної печінки людини в зародок вівці на стадії органогенезу призводить до народження тварин-химер, в крові та кістковому мозку яких стабільно визначаються від 3 до 5% гемопоетичних клітин людини. При цьому ГСК людини не змінюють свій каріотип, зберігаючи високий темп проліферації і здатність до диференціювання. Крім того, трансплантовані ксеногенні ГСК не конфліктують з імунною системою і фагоцитами організму-господаря і не трансформуються в пухлинні клітини, що і лягло в основу інтенсивної розробки способів внутрішньоутробної корекції спадкової генетичної патології за допомогою ГСК або ЕСК, трансфікованих дефіцитними генами.

Але на якому етапі ембріогенезу доцільніше проводити таку корекцію? Вперше клітини, детерміновані до гемопоезу, з'являються у ссавців безпосередньо після імплантації (6-е добу гестації), коли морфологічні ознаки кровотворної диференціювання і презумптівного кровотворні органи ще відсутні. На цій стадії дисперговані клітини зародка миші здатні репопуліровать кровотворні органи опромінених реципієнтів з утворенням еритроцитів і лімфоцитів, що відрізняються від клітин господаря відповідно типом гемоглобіну або гліцерофосфатізомерази, а також додатковим хромосомним маркером (Тб) донорських клітин. У ссавців, як і у птахів, одночасно з жовтковим мішком до замикання загального судинного русла безпосередньо в тілі зародка в парааортальной спланхноплевре з'являються кровотворні клітини. З AGM-району виділені кровотворні клітини фенотипу АА4.1 +, охарактеризовані як мультипотентні кровотворні клітини, що утворюють Т-і В-лімфоцити, гранулоцити, мегакаріоцити і макрофаги. Фенотипічно ці мультипотентні клітини-попередники дуже близькі до ГСК кісткового мозку дорослих тварин (CD34 + c-kit +). Чисельність мультіпотентних АА4.1 + -клітин серед всіх клітин AGM-району невелика - вони складають не більше 1/12 його частини.

У зародка людини також виявлена гомологичная AGM-регіону тварин інтраембріональная область, яка містить ГСК. Причому у людини більше 80% мультіпотентних клітин з високим проліферативним потенціалом міститься в тілі зародка, хоча такі клітини є і в желточном мішку. Детальний аналіз їх локалізації показав, що сотні таких клітин зібрані в компактні групи, які розташовуються в безпосередній близькості до ендотелію вентральної стінки дорзальной аорти. Фенотипічно вони представляють собою CD34CD45 + Lin-клітини. Навпаки, в желточном мішку, а також в інших кровотворних органах ембріона (печінка, кістковий мозок) такі клітини поодинокі.

Отже, у зародка людини AGM-район містить кластери кровотворних клітин, тісно асоційовані з вентральним ендотелієм дорзальной аорти. Цей контакт простежується і на імунохімічної рівні - і клітини кровотворних кластерів, і ендотеліоцити експресують фактор росту ендотелію судин, Flt-3-ліганд, їх рецептори FLK-1 і STK-1, а також транскрипції фактор стовбурових клітин лейкемії. У AGM-районі мезенхімальні похідні представлені щільним тяжем округлих клітин, розташованих уздовж всієї дорзальной аорти і експресують тенасцін С - гликопротеид основної речовини, активно бере участь в процесах міжклітинної взаємодії та міграції.

Мультипотентні стовбурові клітини AGM-району після трансплантації швидко відновлюють кровотворення у статевозрілих опромінених мишей і тривалий час (до 8 місяців) забезпечують ефективний гемопоез. У желточном мішку клітин з такими властивостями автори не виявили. Результати цього дослідження підтверджуються даними іншої роботи, в якій показано, що у зародків ранніх стадій розвитку (10,5 діб) область AGM є єдиним джерелом клітин, які відповідають визначенню ГСК, відновлюючи мієлоїдний і лимфоидное кровотворення у статевозрілих опромінених реципієнтів.

З AGM-району виділена стромальна лінія AGM-S3, клітини якої підтримують генерацію в культурі коммітірованних клітин-попередників CFU-GM, BFU-E, CFU-E і колонієутворюючих одиниць змішаного типу. Зміст останніх при культивуванні на фидерном подслое клітин лінії AGM-S3 збільшується від 10 до 80 разів. Таким чином, в мікрооточенні AGM-району присутні клітини стромальной основи, ефективно підтримують кровотворення, тому сам AGM-район цілком може виступати зародковим кровотворних органом - джерелом дефінітивних ГСК, тобто, ГСК, які формують кровотворну тканину дорослої тварини.

Розширене иммунофенотипирование клітинного складу AGM-району показало, що в ньому перебувають не тільки мультипотентні кровотворні клітини, але і клітини, коммітірованние до мієлоїдної і лімфоїдної (Т- і В-лімфоцити) диференціювання. Однак при молекулярному аналізі окремих CD34 + c-kit + клітин з AGM-району за допомогою полімеразної ланцюгової реакції виявлено активування тільки бета-глобинового і міелопероксідазной, але не лімфоїдних генів, що кодують синтез CD34, Thy-1 і 15. Часткове активування лініеспеціфіческіх генів характерно для ранніх онтогенетичних етапів генерації ГСК і клітин-попередників. З огляду на, що кількість комміті- рова клітин-попередників в AGM-районі 10-добового зародка на 2-3 порядки нижче, ніж в печінці, можна стверджувати, що на 10-ту добу ембріогенезу гемопоез в області AGM тільки починається, тоді як в основному кровотворних органів плода в цей період гемопоетичні лінії вже розгорнуті.

Дійсно, на відміну від більш ранніх (9-11-е добу) гемопоетичних стовбурових клітин жовткового мішка і області AGM, які репопуліруют кровотворенню мікрооточення новонародженого, але не дорослого організму, кровотворні клітини-попередники 12-17-добової ембріональної печінки вже не потребують ранньому постнатальному мікрооточенні і заселяють органи кровотворення дорослої тварини не гірше, ніж новонародженого. Після трансплантації ГСК ембріональної печінки гемопоез у опромінених дорослих мишей-реципієнтів мав поліклональних характер. Крім того, за допомогою мічених колоній показано, що функціонування прижилися клонів повністю підпорядковується клональной сукцессии, виявленої в дорослому кістковому мозку. Отже, ГСК ембріональної печінки, марковані в максимально сприятливих умовах, без престімуляціі екзогенними цитокінами, вже володіють основними атрибутами дорослих ГСК: не потребують ранньому постембріональному мікрооточенні, переходять в стан глибокого спокою після трансплантації і мобілізуються в клонообразованіе послідовно відповідно до моделі клональной сукцессии.

Очевидно, слід трохи докладніше зупинитися на феномені клональной сукцессии. Еритропоез здійснюють стовбурові кровотворні клітини, що володіють високим проліферативним потенціалом і здатністю до диференціювання в усі лінії коммітірованних клітин-попередників формених елементів крові. При нормальній інтенсивності кровотворення велика частина гемопоетичних стовбурових клітин перебуває в дормантном стані і мобілізується до проліферації і диференціювання, послідовно утворюючи змінюють одне одного клони. Цей процес і отримав назву клональной сукцессии. Експериментальне доказ клональной сукцессии в кровотворної системи було отримано в дослідженнях з ГСК, маркованих ретровірусних перенесенням гена. У дорослих тварин кровотворення підтримується багатьма, одночасно функціонують кровотворними клонами, похідними ГСК. На підставі феномена клональной сукцессии розроблений репопуляціонний підхід до ідентифікації ГСК. За цим принципом розрізняють довгострокову ГСК (long-term haematopoietic stem cell, LT-HSC), здатну відновлювати кровотворну систему протягом усього життя, і короткочасну ГСК, що виконує цю функцію протягом обмеженого періоду часу.

Якщо розглядати гемопоетичні стовбурові клітини з точки зору репопуляціонного підходу, то особливістю гемопоетичних клітин ембріональної печінки є їх здатність створювати колонії, які за розміром значно перевищують такі при зростанні ГСК кордової крові або кісткового мозку, причому це стосується всіх типів колоній. Вже цей факт вказує на більш високий проліферативний потенціал кровотворних клітин ембріональної печінки. Унікальна властивість гемопоетичних клітин-попередників ембріональної печінки - більш короткий у порівнянні з іншими джерелами клітинний цикл, що має велике значення з точки зору ефективності репопуляціі органів кровотворення при трансплантації. Аналіз клітинного складу гемопоетичних суспензії, отриманої з джерел зрілого організму, свідчить про те, що на всіх стадіях онтогенезу ядерні клітини переважно представлені остаточно диференційованими клітинами, кількість і фенотип яких залежать від онтогенетичного віку донора кровотворної тканини. Зокрема, суспензії мононуклеарних клітин кісткового мозку і кордової крові більш ніж на 50% складаються з зрілих клітин лімфоїдного ряду, тоді як в гемопоетичних тканини ембріональної печінки міститься менше 10% лімфоцитів. Крім того, клітини мієлоїдній лінії в ембріональної і фетальної печінки представлені переважно еритроїдного поруч, в той час як в кордової крові та кістковому мозку превалюють гранулоцитарно-макрофагальні елементи.

Важливим є і той факт, що ембріональна печінка містить повний набір найбільш ранніх попередників гемопоезу. Серед останніх слід зазначити еритроїдні, гранулопоетіческіе, мегакаріопоетіческіе і мультилинейной колониеобразующие клітини. Їх більш примітивні попередники - LTC-IC - здатні пролиферировать і диференціюватися in vitro протягом 5 і більше тижнів, а також зберігати функціональну активність після приживлення в організмі реципієнта при алогенних і навіть ксеногенної трансплантації імунодефіцитних тваринам.

Біологічна доцільність переважання в ембріональної печінки клітин еритроїдного ряду (до 90% загальної кількості кровотворних елементів) обумовлена необхідністю забезпечення еритроцитарної масою швидко зростаючого обсягу крові плоду, що розвивається. У ембріональної печінки еритропоез представлений ядерними еритроїдна попередниками різного ступеня зрілості, що містять фетальний гемоглобін (а2у7), який завдяки більш високій спорідненості до кисню забезпечує ефективну абсорбцію останнього з материнської крові. Інтенсифікація еритропоезу в ембріональної печінки асоціюється з локальним підвищенням синтезу еритропоетину (ЕРО). Примітно, що для реалізації гемопоетичного потенціалу кровотворних клітин ембріональної печінки достатньо присутності одного тільки еритропоетину, тоді як для коммитирование до еритропоезу ГСК кісткового мозку і кордової крові потрібно комбінація цитокінів і факторів росту, що складається з ЕРО, SCF, GM-CSF і IL-3. При цьому ранні клітини-попередники гемопоезу, виділені з ембріональної печінки, що не мають рецепторів до ЕРО, не відповідають на екзогенний еритропоетин. Для індукції еритропоезу в суспензії мононуклеарних клітин ембріональної печінки необхідна присутність більш просунутих ерітропоетінчувствітельних клітин з фенотипом CD34 + CD38 +, які експресують ЕРО-рецептор.

У літературі до сих пір не склалося єдиної думки про становлення гемопоезу в ембріональному періоді. Не встановлено і функціональне значення існування екстра-та інтраембріональних джерел клітин-попередників кровотворення. Однак не викликає сумнівів, що в ембріогенезі людини печінка є центральним органом гемопоезу і на 6-12-му тижнях гестації служить основним джерелом стовбурових кровотворних клітин, які заселяють селезінку, тимус і кістковий мозок, НДР забезпечують виконання відповідних функцій в пре- і постнатальному періодах розвитку.

Слід ще раз відзначити, що ембріональна печінка в порівнянні з іншими джерелами характеризується найвищим вмістом ГСК. Приблизно 30% CD344-клітин ембріональної печінки має фенотип CD38. У той же час кількість лімфоїдних клітин-попередників (CD45 +) на ранніх термінах кровотворення в печінці становить не більше 4%. При цьому встановлено, що, у міру розвитку плоду, від 7 до 17 тижнів гестації кількість В-лімфоцитів прогресивно зростає з щомісячним "кроком", що становить 1,1%, тоді як рівень ГСК перманентно знижується.

Функціональна активність гемопоетичних стовбурових клітин також залежить від терміну ембріонального розвитку їх джерела. Дослідження колонієутворюючих активності клітин печінки ембріонів людини 6-8-й і 9-12-й тижнів гестації при культивуванні в напіврідкої середовищі в присутності SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 і ЕРО показало, що загальне число колоній в 1 , 5 рази вище при посіві ГСК ембріональної печінки ранніх строків розвитку. У той же час кількість в печінці таких клітин-попередників мієлопоез, як CFU-GEMM, на 6-8-й тижнях ембріогенезу більш ніж в три рази перевищує їх число на 9-12-му тижнях гестації. В цілому, колонієутворюючих активність гемопоетичних клітин печінки ембріонів першого триместру гестації виявилася значно вище, ніж клітин фетальної печінки другого триместру вагітності.

Наведені вище дані свідчать про те, що ембріональна печінка на початку ембріогенезу відрізняється не просто підвищеним вмістом ранніх клітин-попередників гемопоезу, але її гемопоетичні клітини характеризуються більш широким спектром диференціювання в різні клітинні лінії. Ці особливості функціональної активності стовбурових гемопоетичних клітин ембріональної печінки можуть мати певне клінічне значення, оскільки їх якісні характеристики дозволяють очікувати вираженого терапевтичного ефекту при трансплантації навіть невеликої кількості клітин, отриманих на ранніх термінах гестації.

Проте, проблема кількості гемопоетичних стовбурових клітин, необхідного для ефективної трансплантації, залишається відкритою та актуальною. Робляться спроби розв'язати цю проблему, використовуючи високий потенціал самовідтворення кровотворних клітин ембріональної печінки in vitro при їх стимуляції цитокінами і факторами росту. При постійній перфузії в біореакторі ранніх ГСК ембріональної печінки через 2-3 дня на виході вдається отримати кількість стовбурових кровотворних клітин, в 15 разів перевищує їх вихідний рівень. Для порівняння слід зауважити, що для досягнення 20-кратного підвищення виходу ГСК кордової крові людини в тих же умовах потрібно не менше двох тижнів.

Таким чином, ембріональна печінка відрізняється від інших джерел гемопоетичних стовбурових клітин більш високим вмістом як коммітірованних, так і ранніх клітин-попередників кровотворення. У культурі з факторами росту клітини ембріональної печінки з фенотипом CD34 + CD45Ra1 CD71l0W утворюють в 30 разів більше колоній, ніж аналогічні клітини кордової крові, і в 90 разів більше, ніж ГСК кісткового мозку. Найбільш виражені в зазначених джерелах відмінності в змісті ранніх клітин-попередників гемопоезу, що утворюють змішані колонії - кількість CFU-GEMM в ембріональної печінки перевищує таке в кордової крові та кістковому мозку відповідно в 60 і 250 разів.

Важливим є і той факт, що аж до 18-го тижня ембріонального розвитку (період початку гемопоезу в кістковому мозку) в реалізацію функції кровотворення залучено понад 60% клітин печінки. Оскільки до 13-го тижня розвитку у плода людини відсутні тимус і відповідно тімоціти, трансплантація гемопоетичних клітин ембріональної печінки 6-12-тижневої гестації значно знижує ризик розвитку реакції "трансплантат проти господаря" і не вимагає підбору гістосумісності донора, так як дозволяє відносно легко домогтися гемопоетичного хімерізма.