Коринебактерії

Дифтерія – гостре інфекційне захворювання, що вражає переважно дітей, яке проявляється глибокою інтоксикацією організму дифтерійним токсином та характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника. Назва хвороби походить від грецького слова diphthera – шкіра, плівка, оскільки в місці розмноження збудника утворюється щільна, сірувато-біла плівка.

Збудник дифтерії – Corynebacterium diphtheriae – був вперше відкритий у 1883 році Е. Клебсом на зрізах плівки, а в чистій культурі отриманий у 1884 році Ф. Леффлером. У 1888 році Е. Ру та А. Єрсін виявили його здатність продукувати екзотоксин, який відіграє головну роль в етіології та патогенезі дифтерії. Виробництво антитоксичної сироватки Е. Берінгом у 1892 році та її використання з 1894 року для лікування дифтерії дозволили значно знизити смертність. Успішний наступ на цю хворобу розпочався після 1923 року у зв'язку з розробкою Г. Районом методу отримання дифтерійного анатоксину.

Збудник дифтерії належить до роду Corynebacterium (клас Actinobacteria). Морфологічно характеризується тим, що клітини мають булавоподібну форму та потовщені на кінцях (грец. coryne – булава), утворюють гілки, особливо у старих культурах, та містять зернисті включення.

Рід Corynebacterium включає велику кількість видів, які поділяються на три групи.

• Коринебактерії є паразитами людини та тварин і є для них патогенними.
• Коринебактерії, патогенні для рослин.
• Непатогенні коринебактерії. Багато видів коринебактерій є нормальними мешканцями шкіри, слизових оболонок глотки, носоглотки, очей, дихальних шляхів, уретри та статевих органів.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Морфологія коринебактерій

C. diphtheriae — це прямі або злегка вигнуті нерухомі палички довжиною 1,0-8,0 мкм та діаметром 0,3-0,8 мкм; вони не утворюють спор або капсул. Часто мають здуття на одному або обох кінцях і часто містять метахроматичні гранули — зерна волютину (поліметафосфати), які набувають блакитно-фіолетового кольору при забарвленні метиленовим синім. Для їх виявлення запропоновано спеціальний метод забарвлення Нейссера. У цьому випадку палички забарвлюються в солом'яно-жовтий колір, а зерна волютину — в темно-коричневий, і зазвичай розташовані на полюсах. Corynebacterium diphtheriae добре забарвлюється аніліновими барвниками, є грампозитивною, але в старих культурах часто знебарвлюється та має негативне забарвлення за Грамом. Характеризується вираженим поліморфізмом, особливо в старих культурах та під впливом антибіотиків. Вміст G+C у ДНК становить близько 60 моль%.

Біохімічні властивості коринебактерій

Дифтерійна паличка є аеробом або факультативним анаеробом, температурний оптимум росту становить 35-37 °C (межі росту – 15-40 °C), оптимальний pH – 7,6-7,8. Вона не дуже вимоглива до поживних середовищ, але краще росте на середовищах, що містять сироватку або кров. Середовища Ру або Леффлера з сироваткою є селективними для дифтерійних бактерій, ріст на них з'являється через 8-12 годин у вигляді опуклих колоній розміром з шпилькову головку, сірувато-білого або жовтувато-кремового кольору. Їх поверхня гладка або злегка зерниста, на периферії колонії дещо прозоріші, ніж у центрі. Колонії не зливаються, внаслідок чого культура набуває вигляду шагреневої шкіри. На бульйоні ріст проявляється рівномірним помутнінням, або бульйон залишається прозорим, а на його поверхні утворюється ніжна плівка, яка поступово густішає, кришиться та осідає пластівцями на дно.

Особливістю дифтерійних бактерій є їхній хороший ріст на кров'яних та сироваткових середовищах, що містять такі концентрації телуриту калію, що вони пригнічують ріст інших видів бактерій. Це пов'язано з тим, що C. diphtheriae відновлюють телурит калію до металевого телуру, який, осідаючи в мікробних клітинах, надає колоніям характерного темно-сірого або чорного кольору. Використання таких середовищ збільшує відсоток висіву дифтерійних бактерій.

Corynebacterium diphtheriae ферментують глюкозу, мальтозу, галактозу з утворенням кислоти без газу, але не ферментують (як правило) сахарозу, мають цистиназу, не мають уреази та не утворюють індол. За цими характеристиками вони відрізняються від тих коринеформних бактерій (дифтероїдів), які найчастіше зустрічаються на слизовій оболонці ока (Corynebacterium xerosus) та носоглотки (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) та від інших дифтероїдів.

У природі існують три основні варіанти (біотипи) дифтерійної палички: gravis, intermedins та mitis. Вони відрізняються морфологічними, культуральними, біохімічними та іншими властивостями.

Поділ бактерій дифтерії на біотипи було здійснено з урахуванням форм дифтерії, у пацієнтів, у яких вони виділяються з найбільшою частотою. Тип gravis найчастіше виділяється у пацієнтів з тяжкою формою дифтерії та спричиняє групові спалахи. Тип mitis викликає легші та спорадичні випадки захворювання, а тип intermedius займає проміжне положення між ними. Corynebacterium belfanti, раніше віднесений до біотипу mitis, виділено як самостійний, четвертий, біотип. Його основна відмінність від біотипів gravis та mitis полягає у здатності відновлювати нітрати до нітритів. Штами Corynebacterium belfanti мають виражені адгезивні властивості, серед них зустрічаються як токсигенні, так і нетоксигенні варіанти.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Антигенна структура коринебактерій

Коринебактерії дуже гетерогенні та мозаїчні. У всіх трьох типах збудників дифтерії виявлено кілька десятків соматичних антигенів, згідно з якими їх поділяють на серотипи. У Росії прийнята серологічна класифікація, згідно з якою виділяють 11 серотипів бактерій дифтерії, з яких 7 є основними (1-7) та 4 - додатковими, рідко зустрічаються серотипами (8-11). Шість серотипів (1, 2, 3, 4, 5, 7) належать до типу gravis, а п'ять (6,8,9,10,11) - до типу mitis. Недоліком методу серотипування є те, що багато штамів, особливо нетоксигенні, мають спонтанну аглютинацію або поліаглютинацію.

[ 11 ]

Фаготипування Corynebacterium diphtheriae

Для диференціації бактерій дифтерії запропоновано різні схеми фаготипування. Згідно зі схемою М.Д. Крилової, використовуючи набір з 9 фагів (A, B, C, D, F, G, H, I, K), можна типувати більшість токсигенних та нетоксигенних штамів типу gravis. Враховуючи чутливість до зазначених фагів, а також культуральні, антигенні властивості та здатність синтезувати корицини (бактерицидні білки), М.Д. Крилова виділила 3 незалежні групи коринебактерій типу gravis (I-III). Кожна з них містить підгрупи токсигенних та їх нетоксигенні аналоги збудників дифтерії.

Резистентність до коринебактерій

Коринебактерія дифтерії (Corynebacterium diphtheriae) виявляє високу стійкість до низьких температур, але швидко гине за високих: при 60 °C – протягом 15-20 хвилин, при кип'ятінні – через 2-3 хвилини. Усі дезінфікуючі засоби (лізол, фенол, хлорамін тощо) у зазвичай використовуваній концентрації знищують її за 5-10 хвилин. Однак збудник дифтерії добре переносить висушування і може тривалий час залишатися життєздатним у висохлому слизу, слині, частинках пилу. У дрібнодисперсному аерозолі бактерії дифтерії залишаються життєздатними протягом 24-48 годин.

Фактори патогенності коринебактерій

Патогенність Corynebacterium diphtheriae визначається наявністю низки факторів.

Фактори адгезії, колонізації та інвазії

Структури, відповідальні за адгезію, не ідентифіковані, але без них дифтерійна паличка не змогла б колонізувати клітини. Їхню роль виконують деякі компоненти клітинної стінки збудника. Інвазивні властивості збудника пов'язані з гіалуронідазою, нейрамінідазою та протеазою.

Токсичний гліколіпід, що міститься в клітинній стінці збудника. Це 6,6'-діестер трегалози, що містить коринеміколеву кислоту (C32H64O3) та коринеміколеву кислоту (C32H62O3) в еквімолярних співвідношеннях (трегалоза-6,6'-дикоринеміколят). Гліколіпід має руйнівну дію на клітини тканин у місці розмноження збудника.

Екзотоксин, який визначає патогенність збудника та характер патогенезу захворювання. Нетоксигенні варіанти C. diphtheriae не викликають дифтерію.

Екзотоксин синтезується як неактивний попередник – один поліпептидний ланцюг з молекулярною масою 61 кДа. Він активується самою бактеріальною протеазою, яка розрізає поліпептид на два пептиди, з'єднані дисульфідними зв'язками: A (mw 21 кДа) та B (mw 39 кДа). Пептид B виконує акцепторну функцію – розпізнає рецептор, зв'язується з ним та утворює внутрішньомембранний канал, через який пептид A проникає в клітину та реалізує біологічну активність токсину. Пептид A – це фермент АДФ-рибозилтрансферази, який забезпечує перенесення аденозиндифосфатрибози з NAD на один із амінокислотних залишків (гістидин) фактора елонгації білка EF-2. В результаті модифікації EF-2 втрачає свою активність, і це призводить до пригнічення синтезу білка рибосомами на стадії транслокації. Токсин синтезується лише тими C. diphtheriae, які несуть у своїй хромосомі гени помірного конвертуючого профага. Оперон, що кодує синтез токсину, є моноцистронним, складається з 1,9 тис. пар нуклеотидів і має промотор toxP та 3 області: toxS, toxA та toxB. Область toxS кодує 25 амінокислотних залишків сигнального пептиду (він забезпечує вивільнення токсину через мембрану в периплазматичний простір бактеріальної клітини), toxA - 193 амінокислотні залишки пептиду А, а toxB - 342 амінокислотні залишки пептиду В токсину. Втрата клітиною профага або мутації в tox-опероні роблять клітину слаботоксигенною. Навпаки, лізогенізація нетоксигенних C. diphtheriae конвертуючим фагом перетворює їх на токсигенні бактерії. Це доведено однозначно: токсигенність дифтерійних бактерій залежить від їх лізогенізації токс-конвертуючими коринефагами. Коринефаги інтегруються в хромосому коринебактерій, використовуючи механізм сайт-специфічної рекомбінації, а штами дифтерійних бактерій можуть містити 2 сайти рекомбінації (attB) у своїх хромосомах, і коринефаги інтегруються в кожен з них з однаковою частотою.

Генетичний аналіз низки нетоксигенних штамів бактерій дифтерії, проведений за допомогою мічених ДНК-зондів, що несуть фрагменти коринефагового токс-оперону, показав, що їхні хромосоми містять послідовності ДНК, гомологічні коринефаговому токс-оперону, але вони або кодують неактивні поліпептиди, або перебувають у «мовчазному» стані, тобто неактивні. У зв'язку з цим виникає дуже важливе епідеміологічне питання: чи можуть нетоксигенні бактерії дифтерії трансформуватися в токсигенні в природних умовах (в організмі людини), подібно до того, що відбувається in vitro? Можливість такої трансформації нетоксигенних культур коринебактерій у токсигенні за допомогою фагової конверсії була продемонстрована в експериментах на морських свинках, курячих ембріонах та білих мишах. Однак, чи відбувається це під час природного епідемічного процесу (і якщо так, то як часто), поки що не встановлено.

З огляду на те, що дифтерійний токсин в організмі хворих має вибірковий та специфічний вплив на певні системи (переважно уражаються симпатично-надниркова система, серце, судини та периферичні нерви), очевидно, що він не тільки пригнічує біосинтез білка в клітинах, але й викликає інші порушення їхнього метаболізму.

Для виявлення токсичності бактерій дифтерії можна використовувати такі методи:

• Біологічні випробування на тваринах. Внутрішньошкірне зараження морських свинок фільтратом бульйонної культури дифтерійних бактерій викликає некроз у місці ін'єкції. Одна мінімальна летальна доза токсину (20-30 нг) вбиває морську свинку масою 250 г при підшкірному введенні на 4-5-й день. Найбільш характерним проявом дії токсину є ураження надниркових залоз, які збільшені та різко гіперемовані.
• Зараження курячих ембріонів. Дифтерійний токсин викликає їхню загибель.
• Інфекція клітинних культур. Дифтерійний токсин викликає виразний цитопатичний ефект.
• Твердофазний імуноферментний аналіз з використанням антитоксинів, мічених пероксидазою.
• Використання ДНК-зонда для прямого виявлення ток-оперону в хромосомі бактерій дифтерії.

Однак найпростішим і найпоширенішим методом визначення токсичності дифтерійних бактерій є серологічний – метод гель-преципітації. Його суть полягає в наступному. Смужку стерильного фільтрувального паперу розміром 1,5 х 8 см зволожують антитоксичною протидифтерійною сироваткою, що містить 500 АЕ в 1 мл, і наносять на поверхню живильного середовища в чашці Петрі. Чашку сушать у термостаті протягом 15-20 хвилин. Тестові культури засівають бляшками з обох боків паперу. На одну чашку висівають кілька штамів, один з яких, очевидно токсичний, служить контролем. Чашки з культурами інкубують при 37 °C, результати враховують через 24-48 годин. Завдяки зустрічній дифузії антитоксину та токсину в гелі, у місці їх взаємодії утворюється чітка лінія преципітації, яка зливається з лінією преципітації контрольного токсигенного штаму. Неспецифічні смуги преципітації (вони утворюються, якщо, крім антитоксину, в сироватці крові в невеликих кількостях присутні інші антимікробні антитіла) з'являються пізно, слабо експресуються та ніколи не зливаються зі смугою преципітації контрольного штаму.

Постінфекційний імунітет

Сильні, стійкі, практично довічні, повторні випадки захворювання спостерігаються рідко - у 5-7% перехворілих. Імунітет має переважно антитоксичний характер, менше значення мають антимікробні антитіла.

Раніше для оцінки рівня протидифтерійного імунітету широко використовувалася проба Шика. Для цього дітям внутрішньошкірно вводили 1/40 частину токсину морської свинки в об'ємі 0,2 мл. За відсутності антитоксичного імунітету на місці ін'єкції через 24-48 годин з'являються почервоніння та набряк діаметром більше 1 см. Така позитивна реакція Шика свідчить або про повну відсутність антитоксину, або про те, що його вміст менше 0,001 АЕ/мл крові. Негативна реакція Шика спостерігається, коли вміст антитоксину в крові вищий за 0,03 АЕ/мл. Якщо вміст антитоксину нижчий за 0,03 АЕ/мл, але вищий за 0,001 АЕ/мл, реакція Шика може бути як позитивною, так і, іноді, негативною. Крім того, сам токсин має виражену алергенну властивість. Тому для визначення рівня протидифтерійного імунітету (кількісного вмісту антитоксину) краще використовувати РПГА з еритроцитарним діагностикумом, сенсибілізованим дифтерійним анатоксином.

Епідеміологія дифтерії

Єдиним джерелом інфекції є людина – хвора, одужуюча або здоровий бактеріоносій. Зараження відбувається повітряно-крапельним шляхом, повітряно-крапельним пилом, а також через різні предмети, якими користуються хворі або здорові носії: посуд, книги, білизну, іграшки тощо. У разі забруднення харчових продуктів (молоко, креми тощо) зараження можливе аліментарним шляхом. Найбільш масове виділення збудника відбувається при гострій формі захворювання. Однак найбільше епідеміологічне значення мають люди з латентними, атиповими формами захворювання, оскільки вони часто не госпіталізуються та не виявляються одразу. Хворий на дифтерію є заразним протягом усього періоду захворювання та частини періоду одужання. Середній період бактеріоносійства у одужуючих коливається від 2 до 7 тижнів, але може тривати до 3 місяців.

Здорові носії відіграють особливу роль в епідеміології дифтерії. В умовах спорадичної захворюваності вони є основними розповсюджувачами дифтерії, сприяючи збереженню збудника в природі. Середня тривалість носійства токсигенних штамів дещо коротша (близько 2 місяців), ніж нетоксигенних (близько 2-3 місяців).

Причина формування здорового носійства токсигенних та нетоксигенних бактерій дифтерії до кінця не розкрита, оскільки навіть високий рівень антитоксичного імунітету не завжди забезпечує повне звільнення організму від збудника. Можливо, певне значення має рівень антибактеріального імунітету. Першочергове епідеміологічне значення має носійство токсигенних штамів бактерій дифтерії.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Симптоми дифтерії

До дифтерії схильні люди будь-якого віку. Збудник може проникати в організм людини через слизові оболонки різних органів або через пошкоджену шкіру. Залежно від локалізації процесу розрізняють дифтерію глотки, носа, гортані, вуха, ока, статевих органів та шкіри. Можливі змішані форми, наприклад, дифтерія глотки та шкіри тощо. Інкубаційний період становить 2-10 днів. При клінічно вираженій формі дифтерії в місці локалізації збудника розвивається характерне фібринозне запалення слизової оболонки. Токсин, що виробляється збудником, спочатку вражає епітеліальні клітини, а потім і ближні кровоносні судини, збільшуючи їх проникність. Виходить ексудат містить фібриноген, коагуляція якого призводить до утворення на поверхні слизової оболонки сірувато-білого плівкового нальоту, який щільно зростається з підлеглою тканиною і при відриві викликає кровотечу. Наслідком пошкодження кровоносних судин може бути розвиток місцевого набряку. Дифтерія глотки особливо небезпечна, оскільки може спричинити дифтерійний круп через набряк слизової оболонки гортані та голосових зв'язок, від якого раніше 50-60% дітей, хворих на дифтерію, помирали внаслідок асфіксії. Дифтерійний токсин, потрапляючи в кров, викликає загальну глибоку інтоксикацію. Він вражає переважно серцево-судинну, симпатично-надниркову системи та периферичні нерви. Таким чином, симптоми дифтерії складаються з поєднання місцевих ознак, що залежать від локалізації вхідних воріт, та загальних симптомів, спричинених отруєнням токсином і проявляються у вигляді адинамії, млявості, блідості шкіри, зниження артеріального тиску, міокардиту, паралічу периферичних нервів та інших порушень. Дифтерія у вакцинованих дітей, якщо й спостерігається, зазвичай протікає в легкій формі та без ускладнень. Рівень смертності в період до застосування серотерапії та антибіотиків становив 50-60%, зараз він становить 3-6%.

Лабораторна діагностика дифтерії

Єдиним методом мікробіологічної діагностики дифтерії є бактеріологічний, з обов'язковим дослідженням виділеної культури коринебактерій на токсичність. Бактеріологічні дослідження на дифтерію проводяться у трьох випадках:

• для діагностики дифтерії у дітей та дорослих з гострими запальними процесами в глотці, носі та носоглотці;
• за епідеміологічними показаннями осіб, які контактували з джерелом збудника дифтерії;
• особи, щойно потрапили до дитячих будинків, ясел, шкіл-інтернатів та інших спеціалізованих закладів для дітей та дорослих, з метою виявлення серед них можливих носіїв дифтерійної палички.

Матеріалом для дослідження є слиз з глотки та носа, плівка з мигдаликів або інших слизових оболонок, які є входом для збудника. Посів проводять на телуритові сироваткові або кров'яні середовища та одночасно на коагуловані сироваткові середовища Ру (коагулована кінська сироватка) або Леффлера (3 частини бичачої сироватки + 1 частина цукрового бульйону), на яких ріст коринебактерій з'являється через 8-12 годин. Виділену культуру ідентифікують за комбінацією морфологічних, культуральних та біохімічних властивостей, використовуючи по можливості методи серо- та фаготипування. У всіх випадках обов'язковим є проведення токсичної проби з використанням одного з вищезазначених методів. Морфологічні особливості коринебактерій найкраще вивчати за допомогою трьох методів забарвлення мазка: за Грамом, Нейссера та метиленовим синім (або толуїдиновим синім).

Лікування дифтерії

Специфічним методом лікування дифтерії є застосування протидифтерійної антитоксичної сироватки, що містить не менше 2000 МО на 1 мл. Сироватку вводять внутрішньом'язово в дозах від 10 000 до 400 000 МО залежно від тяжкості захворювання. Ефективним методом лікування є застосування антибіотиків (пеніцилінів, тетрациклінів, еритроміцину тощо) та сульфаніламідів. Для стимуляції вироблення власних антитоксинів можна використовувати анатоксин. Щоб позбутися бактеріоносійства, слід використовувати антибіотики, до яких даний штам коринебактерій має високу чутливість.

Специфічна профілактика дифтерії

Основним методом боротьби з дифтерією є масова планова вакцинація населення. Для цього використовуються різні варіанти вакцин, зокрема комбіновані, тобто спрямовані на одночасне створення імунітету проти кількох збудників. Найбільш поширеною вакциною в Росії є АКДС. Вона являє собою суспензію бактерій кашлюку, адсорбованих на гідроксиді алюмінію, знищених формаліном або тімеросалом (20 млрд в 1 мл), і містить дифтерійний анатоксин у дозі 30 флокулюючих одиниць та 10 одиниць зв'язуючого правцевого анатоксину в 1 мл. Дітей вакцинують з 3-місячного віку, а потім проводять ревакцинації: перша через 1,5-2 роки, наступні у віці 9 та 16 років, а потім кожні 10 років.

Завдяки масовій вакцинації, яка розпочалася в СРСР у 1959 році, захворюваність на дифтерію в країні до 1966 року, порівняно з 1958 роком, знизилася в 45 разів, а її показник у 1969 році становив 0,7 на 100 000 населення. Подальше скорочення обсягу вакцинації у 1980-х роках призвело до серйозних наслідків. У 1993-1996 роках Росію охопила епідемія дифтерії. Захворіли дорослі, переважно ті, хто не був вакцинований, та діти. У 1994 році було зареєстровано майже 40 тисяч хворих. У зв'язку з цим було відновлено масову вакцинацію. За цей період було вакциновано 132 мільйони людей, у тому числі 92 мільйони дорослих. У 2000-2001 роках охоплення дітей щепленнями у встановлений термін становило 96%, а ревакцинацією - 94%. Завдяки цьому захворюваність на дифтерію у 2001 році зменшилася в 15 разів порівняно з 1996 роком. Однак, щоб звести захворюваність до поодиноких випадків, необхідно вакцинувати щонайменше 97-98% дітей у перший рік життя та забезпечити масову ревакцинацію в наступні роки. Повна ліквідація дифтерії в найближчі роки навряд чи вдасться через широке носійство токсигенних та нетоксигенних бактерій дифтерії. Вирішення цієї проблеми також потребує певного часу.