Corynebacteriae

Дифтерія - гостре інфекційне захворювання переважно дитячого віку, яке проявляється глибокої інтоксикацією організму дифтерійним токсином і характерним фібринозним запаленням у місці локалізації збудника. Назва хвороби походить від грецького слова diphthera - шкіра, плівка, так як в місці розмноження збудника утворюється щільна, сірувато-білого кольору плівка.

Збудник дифтерії - Corynebacterium diphtheriae - був виявлений вперше в 1883 р Е. Клебсом в зрізах з плівки, отриманий в чистій культурі в 1884 р Ф. Леффлером. У 1888 р Е. Ру та А. Ієрсен виявили його здатність продукувати екзотоксин, який грає головну роль в етіології і патогенезі дифтерії. Отримання в 1892 р антитоксичної сироватки Е. Берінгом і використання її з 1894 р для лікування дифтерії дозволило значно знизити летальність. Успішний наступ на цю хворобу почалося після 1923 р зв'язку з розробкою Г. Районом методу отримання дифтерійного анатоксину.

Збудник дифтерії відноситься до роду Corynebacterium (клас Actinobacteria). У морфологічному відношенні характеризується тим, що клітини булавовидно потовщені на кінцях (грец. Согупе - булава), утворюють розгалуження, особливо в старих культурах, і містять зернисті включення.

До складу роду Corynebacterium входить велика кількість видів, які ділять на три групи.

• Коринебактерії - паразити людини і тварин і патогенні для них.
• Коринебактерії, патогенні для рослин.
• Непатогенні коринебактерии. Багато видів коринебактерии є нормальними мешканцями шкіри, слизових зіву, носоглотки, очей, дихальних шляхів, уретри і статевих органів.

[1], [2], [3], [4], [5]

Морфологія коринебактерий

С. Diphtheriae - прямі або злегка зігнуті нерухомі палички довжиною 1,0-8,0 мкм і діаметром 0,3-0,8 мкм, спор і капсул не утворюють. Дуже часто вони мають здуття на одному або обох кінцях, часто містять метахроматичні гранули - зерна волютина (поліметафосфати), які при фарбуванні метиленовим синім набувають блакитнувато-пурпурний колір. Для їх виявлення запропонований особливий метод фарбування по Нейссеру. При цьому палички фарбуються в солом'яно-жовтий, а зерна волютина - в темно-коричневий колір, і розташовуються зазвичай по полюсах. Corynebacterium diphtheriae добре забарвлюється аніліновими барвниками, грампозитивні, але в старих культурах нерідко знебарвлюється і має негативне забарвлення по Граму. Для неї характерний виражений поліморфізм, особливо в старих культурах і під впливом антибіотиків. Зміст Г + Ц в ДНК близько 60 мовляв%.

Біохімічні властивості коринебактерій

Дифтерійна паличка є аеробом або факультативним анаеробом, температурний оптимум для росту 35-37 ° С (межі росту 15-40 ° С), оптимальна рН 7,6-7,8. До живильних середовищ не надто вимоглива, але краще росте на середовищах, що містять сироватку або кров. Виборчими для дифтерійних бактерій є згорнуті сироваткові середовища Ру або Леффлера, зростання на них з'являється через 8-12 год у вигляді опуклих, завбільшки з шпилькову головку колоній сірувато-білого або жовтувато-кремового кольору. Поверхня їх гладка або злегка зерниста, на периферії колонії кілька більш прозорі, ніж в центрі. Колонії не зливаються, внаслідок чого культура набуває вигляду шагреневої шкіри. На бульйоні зростання проявляється у вигляді рівномірного помутніння, або бульйон залишається прозорим, а на його поверхні утворюється ніжна плівка, яка поступово потовщується, кришиться і пластівцями осідає на дно.

Особливістю дифтерійних бактерій є їх гарне зростання на кров'яних і сироваткових середовищах, що містять такі концентрації теллурита калію, які пригнічують ріст інших видів бактерій. Це пов'язано з тим, що С. Diphtheriae відновлюють телурит калію до металевого телуру, який, відкладаючись в мікробних клітинах, надає колоніям характерний темно-сірий або чорний колір. Застосування таких середовищ підвищує відсоток висівання дифтерійних бактерій.

Corynebacterium diphtheriae ферментують глюкозу, мальтозу, галактозу з утворенням кислоти без газу, але не ферментують (як правило) сахарозу, мають цистиназу, не мають уреази і не утворюють індолу. За цими ознаками вони відрізняються від тих корінеформних бактерій (дифтероїдів), які частіше за інших зустрічаються на слизовій оболонці ока (Corynebacterium xerosus) і носоглотки (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) і від інших дифтероїдів.

У природі існують три основні варіанти (біотипів) дифтерійної палички: gravis, intermedins і mitis. Вони розрізняються за морфологічними, культуральними, біохімічними і іншим властивостям.

Розподіл дифтерійних бактерій на біотипи було вироблено з урахуванням того, за яких формах перебігу дифтерії у хворих вони виділяються з найбільшою частотою. Тип gravis частіше виділяється від хворих з важкою формою дифтерії і викликає групові спалахи. Тип mitis викликає більш легкі і спорадичні випадки захворювань, а тип intermedius займає проміжне положення між ними. Corynebacterium belfanti, раніше відносили до біотипів mitis, виділений в самостійний, четвертий, біотип. Його головна відмінність від біотипів gravis і mitis - здатність відновлювати нітрати в нітрити. Штами Corynebacterium belfanti мають виражені адгезивними властивостями, і серед них виявляються як токсигенні, так і нетоксігенние варіанти.

[6], [7], [8], [9], [10]

Антигенна структура коринебактерий

Коринебактерії дуже гетерогенна і мозаїчна. У збудників дифтерії всіх трьох типів виявлено кілька десятків соматичних антигенів, за якими їх ділять на серотипи. У Росії прийнята серологічна класифікація, по якій розрізняють 11 серотипів дифтерійних бактерій, з них 7 основних (1-7) і 4 додаткових, рідко зустрічаються серотипів (8-11). Шість серотипів (1, 2, 3, 4, 5, 7) відносяться до типу gravis, а п'ять (6,8,9,10,11) - до типу mitis. Недоліком методу серотипування є те, що багато штамів, особливо нетоксігенние, мають спонтанної агглютинацией або поліагглютінабельностью.

[11]

Фаготипирование Corynebacterium diphtheriae

Для диференціації дифтерійних бактерій запропоновані різні схеми фаготипирования. За схемою М. Д. Крилової за допомогою набору з 9 фагів (А, В, С, D, F, G, Н, I, К) вдається типировать більшість токсигенних і нетоксигенних штамів типу gravis. З урахуванням чутливості до вказаних фагів, а також культуральних, антигенних властивостей і здатності синтезувати коріціни (бактерицидні білки) М. Д. Крилова виділила 3 самостійні групи коринебактерій типу gravis (I-III). У кожній з них є підгрупи токсигенних і їх нетоксигенних аналогів збудників дифтерії.

Резистентність коринебактерий

Corynebacterium diphtheriae проявляє велику стійкість до низьких температур, але швидко гине при високій температурі: при 60 ° С - протягом 15-20 хв, при кип'ятінні - через 2-3 хв. Всі дезінфікуючі речовини (лізол, фенол, хлорамін і ін.) В зазвичай застосовується концентрації знищують її за 5-10 хв. Однак збудник дифтерії добре переносить висушування і може довго зберігати життєздатність в висохлої слизу, слині, в частинках пилу. У дрібнодисперсному аерозолі дифтерійні бактерії зберігають життєздатність протягом 24-48 год.

Фактори патогенності коринебактерий

Патогенність Corynebacterium diphtheriae визначається наявністю низки факторів.

Фактори адгезії, колонізації та інвазії

Структури, відповідальні за адгезію, не ідентифіковано, однак без них дифтерійна паличка не змогла б колонізувати клітини. Їх роль виконують якісь компоненти клітинної стінки збудника. Інвазивні властивості збудника пов'язані з гіалуронідазами, нейрамінідазою і протеазой.

Токсичного гліколіпіду, що міститься в клітинній стінці збудника. Він являє собою 6,6'-діефір трегалози, що містить корінеміколовую кислоту (С32Н6403) і корінеміколіновую кислоту (Сз2Н62Оз) в еквімолярних відносинах (трегалозу-6,6'-дікорінеміколат). Гліколіпіди завдає руйнівної дії на клітини тканини в місці розмноження збудника.

Екзотоксину, що обумовлює патогенність збудника і характер патогенезу захворювання. Нетоксігенние варіанти С. Diphtheriae дифтерії не викликають.

Екзотоксин синтезується у вигляді неактивного попередника - єдиної поліпептидного ланцюга з м.м. 61 кД. Його активація здійснюється власної бактеріальної протеазой, яка розрізає поліпептид на два пов'язані між собою дисульфідними зв'язками пептиду: А (м.м. 21 кД) і В (м.м. 39 кД). Пептид В виконує акцепторну функцію - він розпізнає рецептор, зв'язується з ним і формує внутрімембранний канал, через який проникає в клітину пептид А і реалізує біологічну активність токсину. Пептид А являє собою фермент АДФ-рібозілтрансферазу, який забезпечує перенесення аденозіндіфосфатрібози з НАД на один з амінокислотних залишків (гистидина) білкового фактора елонгації EF-2. В результаті модифікації EF-2 втрачає свою активність, і це призводить до пригнічення синтезу білка рибосомами на стадії транслокації. Токсин синтезують тільки такі С. Diphtheriae, які несуть в своїй хромосомі гени помірного конвертує профага. Оперон, що кодує синтез токсину, є моноцістронним, він складається з 1,9 тис. Пар нуклеотидів і має промотор toxP і 3 ділянки: toxS, toxA і toxB. Ділянка toxS кодує 25 амінокислотних залишків сигнального пептиду (він забезпечує вихід токсину через мембрану в Периплазма бактеріальної клітини), toxA - 193 амінокислотних залишку пептиду А, і toxB - 342 амінокислотних залишку пептиду В токсину. Втрата клітиною профага або мутації в tox-оперон роблять клітку малотоксігенной. Навпаки, лизогенизации нетоксигенних С. Diphtheriae конвертує фагом перетворює їх в токсигенні бактерії. Це доведено однозначно: токсигенность дифтерійних бактерій залежить від лизогенизации їх конвертує tox-корінефагамі. Корінефагі інтегруються в хромосому коринебактерий за допомогою механізму сайт-специфічної рекомбінації, причому штами дифтерійних бактерій можуть містити в своїх хромосомах по 2 сайта рекомбінації (attB), і корінефагі інтегруються в кожен з них з однаковою частотою.

Генетичний аналіз ряду нетоксигенних штамів дифтерійних бактерій, проведений за допомогою мічених ДНК-зондів, що несуть фрагменти tox-оперона корінефага, показав, що в їх хромосомах є послідовності ДНК, гомологічні tox-оперон корінефага, але вони або кодують неактивні поліпептиди, або знаходяться в « мовчати »стані, т. Е. Неактивні. У зв'язку з цим виникає дуже важливий в епідеміологічному відношенні питання: чи можуть нетоксігенние дифтерійні бактерії перетворюватися в токсигенні в природних умовах (в організмі людини), подібно до того, як це відбувається in vitro? Можливість подібного перетворення нетоксигенних культур коринебактерій в токсигенні за допомогою фагової конверсії була показана в дослідах на морських свинках, курячих ембріонах і білих мишах. Однак відбувається це в ході природного епідемічного процесу (і якщо відбувається, то як часто), поки встановити не вдалося.

У зв'язку з тим, що дифтерійний токсин в організмі хворих надає виборче і специфічне вплив на певні системи (уражаються в основному симпатико-адреналової системи, серце, судини і периферичні нерви), то очевидно, він не тільки пригнічує біосинтез білка в клітинах, а й викликає інші порушення їх метаболізму.

Для виявлення токсигенності дифтерійних бактерій можна використовувати такі способи:

• Біологічні проби на тваринах. Внутрішньошкірне зараження морських свинок фільтратом бульонной культури дифтерійних бактерій викликає у них некроз в місці введення. Одна мінімальна смертельна доза токсину (20-30 нг) вбиває морську свинку вагою 250 г при підшкірному введенні на 4-5-й день. Найбільш характерним проявом дії токсину є ураження наднирників, вони збільшені і різко гіперемійовані.
• Зараження курячих ембріонів. Дифтерійний токсин викликає їх загибель.
• Зараження культур клітин. Дифтерійний токсин викликає виразний цитопатичної ефект.
• Метод твердофазного імуноферментного аналізу з використанням мічених пероксидазою антитоксинів.
• Використання ДНК-зонда для безпосереднього виявлення tox-оперона в хромосомі дифтерійних бактерій.

Однак найбільш простим і поширеним способом визначення токсигенності дифтерійних бактерій є серологічний - метод преципітації в гелі. Суть його полягає в наступному. Смужку стерильної фільтрувального паперу розміром 1,5 х 8 см змочують антитоксической протидифтерійної сироваткою, що містить 500 АЕ в 1 мл, і наносять на поверхню живильного середовища в чашці Петрі. Чашку підсушують в термостаті 15-20 хв. Випробовувані культури засівають бляшками по обидві сторони від папірця. На одну чашку засівають кілька штамів, один з яких, свідомо токсігенний, служить контролем. Чашки з посівами інкубують при 37 ° С, результати враховують через 24-48 год. Внаслідок зустрічної дифузії в гелі антитоксина і токсину в місці їх взаємодії утворюється чітка лінія преципітації, яка зливається з лінією преципітації контрольного токсигенного штаму. Смужки неспецифічної преципитации (вони утворюються, якщо в сироватці крім антитоксина присутні в невеликій кількості інші антимікробні антитіла) з'являються пізно, виражені слабо і ніколи не зливаються з смужкою преципитации контрольного штаму.

Постінфекційний імунітет

Міцний, стійкий, фактично довічний, повторні випадки захворювання спостерігаються рідко - у 5-7% перехворілих. Імунітет носить головним чином антитоксичний характер, менше значення мають антимікробні антитіла.

Для оцінки рівня протидифтерійного імунітету раніше широко застосовувалася проба Шика. З цією метою під шкіру дітям вводилася 1/40 Dim токсину для морської свинки в обсязі 0,2 мл. При відсутності антитоксичну імунітету через 24-48 год на місці введення з'являється почервоніння і припухлість діаметром більше 1 см. Така позитивна реакція Шика свідчить або про повну відсутність антитоксина, або про те, що його зміст не перевищує 0,001 АЕ / мл крові. Негативна реакція Шика спостерігається, коли зміст антитоксина в крові вище 0,03 АЕ / мл. При утриманні антитоксина нижче 0,03 АЕ / мл, але вище 0,001 АЕ / мл реакція Шика може бути або позитивною, або, іноді, негативною. Крім того, сам токсин має виражену алергенним властивістю. Тому для визначення рівня протидифтерійного імунітету (кількісний вміст антитоксину) краще користуватися РПГА з еритроцитарних діагностикумів, сенсибілізованим дифтерійним анатоксином.

Епідеміологія дифтерії

Єдиним джерелом зараження є людина - хворий, видужуючий або здоровий бактеріоносій. Зараження відбувається повітряно-крапельним, повітряно-пиловим шляхом, а також через різні предмети, що були у вжитку у хворих або здорових бактеріоносіїв: посуд, книги, білизна, іграшки і т. П. У випадку інфікування харчових продуктів (молоко, креми і т. П.) можливе зараження аліментарним шляхом. Найбільш масивне виділення збудника має місце при гострій формі захворювання. Однак найбільше епідеміологічне значення мають лиця зі стертими, нетиповими формами захворювання, так як вони часто вже не госпіталізуються і виявляються далеко не відразу. Хворий на дифтерію заразний протягом усього періоду хвороби і частини періоду одужання. Середній термін бактеріоносійство у видужуючих варіює від 2 до 7 тижнів., Але може тривати і до 3 міс.

Особливу роль в епідеміології дифтерії грають здорові бактеріоносії. В умовах спорадичної захворюваності саме вони є основними розповсюджувачами дифтерії, сприяючи і збереженню збудника в природі. Середня тривалість носійства токсигенних штамів дещо менше (близько 2 міс), ніж нетоксигенних (близько 2-3 міс).

Причина формування здорового носійства токсигенних і нетоксигенних дифтерійних бактерій розкрита не до кінця, так як навіть високий рівень антитоксичну імунітету не завжди забезпечує повне звільнення організму від збудника. Можливо, певне значення має рівень антибактеріального імунітету. Першорядне епідеміологічне значення має носійство токсигенних штамів дифтерійних бактерій.

[12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19],

Симптоми дифтерії

До дифтерії сприйнятливі люди будь-якого віку. Збудник може проникнути в організм людини через слизові оболонки різних органів або через пошкоджену шкіру. Залежно від локалізації процесу розрізняють дифтерію зіва, носа, гортані, вуха, очі, статевих органів і шкіри. Можливі змішані форми, наприклад дифтерія зіву і шкіри і т. П. Інкубаційний період - 2-10 днів. При клінічно вираженою формою дифтерії в місці локалізації збудника розвивається характерне фібринозне запалення слизової оболонки. Токсин, що виробляється збудником, спочатку вражає епітеліальні клітини, а потім прилеглі кровоносні судини, підвищуючи їх проникність. У вихідному ексудаті міститься фібриноген, згортання якої призводить до утворення на поверхні слизової оболонки сірувато-білого Кольори плівчастих нальотів, які щільно спаяні з підлеглою тканиною і при відриві від неї викликають кровотечу. Наслідком ураження кровоносних судин може бути розвиток місцевого набряку. Особливо небезпечною є дифтерія зіва, так як вона може стати причиною дифтерійного крупа внаслідок набряку слизової оболонки гортані і голосових зв'язок, від якого раніше гинуло в результаті асфіксії 50-60% хворих на дифтерію дітей. Дифтерійний токсин, потрапляючи в кров, викликає загальну глибоку інтоксикацію. Він вражає переважно серцево-судинну, симпатико-адреналової системи і периферичні нерви. Таким чином, симптоми дифтерії складаються з поєднання місцевих ознак, що залежать від локалізації вхідних воріт, і загальних симптомів, обумовлених отруєнням токсином і виявляються у вигляді адинамии, млявості, блідості шкірних покривів, зниження кров'яного тиску, міокардиту, паралічу периферичних нервів та інших порушень. Дифтерія у щеплених дітей, якщо і спостерігається, протікає, як правило, в легкій формі і без ускладнень. Летальність в період до застосування серотерапії і антибіотиків становила 50-60%, нині - 3-6%.

Лабораторна діагностика дифтерії

Єдиним методом мікробіологічної діагностики дифтерії є бактеріологічний, з обов'язковою перевіркою виділеної культури коринебактерій на токсигенность. Бактеріологічні дослідження на дифтерію проводять в трьох випадках:

• для діагностики дифтерії у дітей і дорослих з гострими запальними процесами в області зіва, носа, носоглотки;
• за епідемічними показаннями осіб, які перебували в контакті з джерелом збудника дифтерії;
• осіб, тих, хто влаштовується в дитячі будинки, ясла, школи-інтернати, інші спеціальні установи для дітей і дорослих, з метою виявлення серед них потенційних бактерієносіїв дифтерійної палички.

Матеріалом для дослідження служать слиз із зіву і носа, плівка з мигдаликів або інших слизових оболонок, які є місцем вхідних воріт збудника. Посіви роблять на телуритовий сироваткові або кров'яні середовища і одночасно на згорнуті сироваткові середовища Ру (згорнута кінська сироватка) або Леффлера (3 частини бичачої сироватки + 1 частина цукрового бульйону), на яких зростання коринебактерий з'являється вже через 8-12 ч. Виділену культуру ідентифікують за сукупності морфологічних, культуральних і біохімічних властивостей, по можливості використовують методи сіро і фаготипирования. У всіх випадках обов'язкове перевірка на токсигенность одним із зазначених вище методів. Морфологічні особливості коринебактерий краще вивчати, використовуючи три методи фарбування препарату-мазка: по Граму, Нейссеру і метиленовим синім (або толуїдиновим синім).

Лікування дифтерії

Специфічним засобом лікування дифтерії є застосування протидифтерійної антитоксичної сироватки, що містить не менш як 2000 ME в 1 мл. Сироватку вводять внутрішньом'язово в дозах від 10 000 до 400 000 ME в залежності від тяжкості перебігу хвороби. Ефективним методом лікування є застосування антибіотиків (пеніциліни, тетрациклін, еритроміцин та ін.) І сульфаніламідних препаратів. З метою стимулювання вироблення власних антитоксинів можна використовувати анатоксин. Для звільнення від бактеріоносійство слід використовувати ті антибіотики, до яких даний штам коринебактерий високочутливий.

Специфічна профілактика дифтерії

Основним методом боротьби з дифтерією є масова планова вакцинація населення. З цією метою використовують різні варіанти вакцин, в тому числі комбіновані, т. Е. Спрямовані на одночасне створення імунітету проти кількох збудників. Найбільшого поширення в Росії отримала вакцина АКДП. Вона являє собою адсорбовану на гідроокису алюмінію суспензія кашлюкових бактерій, убитих формаліном або мертіолята (20 млрд в 1 мл), і містить дифтерійний анатоксин в дозі 30 флоккулірует одиниць і 10 одиниць зв'язування правцевого анатоксину в 1 мл. Вакцинують дітей з 3-місячного віку, а потім проводять ревакцинацію: першу через 1,5-2 роки, наступні у віці 9 і 16 років, а далі через кожні 10 років.

Завдяки масової вакцинації, розпочатої в СРСР в 1959 р, захворюваність на дифтерію в країні до 1966 р порівнянні з 1958 р була знижена в 45 разів, а її показник в 1969 р склав 0,7 на 100 000 населення. Настало в 80-х рр. XX ст. Зниження обсягу щеплень призвело до тяжких наслідків. У 1993-1996 рр. Росію охопила епідемія дифтерії. Хворіли дорослі, в основному не отримали щеплень, і діти. У 1994 р було зареєстровано майже 40 тис. Хворих. У зв'язку з цим була відновлена масова вакцинація. У цей період були щеплені 132 млн чоловік, в тому числі 92 млн дорослих. У 2000-2001 рр. Охоплення дітей щепленнями в установлений термін склав 96%, а ревакцинацією - 94%. Завдяки цьому рівень захворюваності на дифтерію в 2001 р знизився в порівнянні з 1996 р в 15 разів. Однак для того щоб довести рівень захворюваності до поодиноких випадків, необхідно охопити вакцинацією не менше 97-98% дітей першого року життя і забезпечити в наступні роки масову ревакцинацію. Домогтися повної ліквідації дифтерії в найближчі роки навряд чи можливо через поширеного носійства токсигенних і нетоксигенних дифтерійних бактерій. Для вирішення цієї проблеми також буде потрібно певний час.