Діагностика герпесу

Діагностика герпесу заснована на проведенні класичного вірусовиделеніе на чутливих клітинних культурах, імунофлюоресцентним і серологічним методами, проведенні кольпоскопічного дослідження, використання сучасних молекулярно-біологічних методів (ПЛР, дот-гібридизація), що дозволяє діагностувати всю групу герпесвірусів, включаючи ВГЧ-6 і ВГЧ-7 типів.

Методи лабораторної діагностики герпетичної інфекції

Основні методи, спрямовані на виділення ВПГ або виявлення вірусних частинок і / або їх компонентів	Допоміжні методи, спрямовані на виявлення антитіл до ВПГ в біологічних рідинах організму людини
Виділення ВПГ на чутливих культурах клітин і тварин Пряма і імунна електронна мікроскопія Прямий і непрямий варіанти МФА IFA Молекулярно-біологічні методи Реакція аглютинації латексу	реакція нейтралізації РСК Визначення антитіл до неструктурних білків ВПГ-1,2

Показано, що у 76% хворих генітальний герпес (ГГ) викликаний ВПГ-2, а у 24% - ВПГ-1 типу. Причому ГГ як моноінфекція протікав лише у 22% хворих, в 78% випадків були виявлені мікробні асоціації. У 46% осіб виявлено паразитоценоз, обумовлений двома збудниками, в тому числі хламідії були виявлені в 40% випадків. Рідше в мазках визначали гарднерели, трихомонади, гонококи.

У 27% хворих паразитоценоз був представлений трьома, у 5,2% - чотирма збудниками. Причому частіше відзначалося поєднання хламідії з гарднереллами і грибами роду Candida. Ці дані доводять необхідність ретельного бактеріологічного обстеження хворих ГГ з метою виявлення поєднань патогенних агентів, а також поглибленого вивчення патогенезу змішаних інфекцій урогенітального тракту, що дозволить проводити диференційовану комплексну терапію герпетичної інфекції.

Матеріали, досліджувані при виділенні ВПГ в залежності від локалізації герпетичних уражень

Локалізація уражень	Вміст везикул	Зішкріб клітин				SDC	Аспірат з бронхів	Біоптат	Кров
		1	2	3	4
Шкіра	+								+
Очі			+						+
Геніталії				+					+
Анус	+				+				+
Рот	+	+							+
ЦНС	+					+		+	+
Легкі		+					+		+
Печінка								+	+
Природжений герпес	+	+	+				+		+

Методи лабораторної діагностики цитомегаловірусної інфекції

Методи	Час, необхідний для отримання результатів	Примітки
Вірусологічні
Електронна мікроскопія	3:00	Напруга
Виділення вірусу в культурі клітин (ЦПД)	4-20 днів	Стандартний, Повільний
Иммунофлюоресцентное фарбування ранніх АГ із застосуванням моноклональних антитіл	6:00	Менш специфічний
ЦИТОЛОГІЧЕСКИЙ	2-3 години	Менш специфічний
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ
РСК	2 дні	Стандартний
Ssubsistence	1 день	Трудомісткий
РИФ	6:00	Простий, специфічний
НФІФ	6:00	Складний
RIMF	6:00	Складний
ІФА (IgM, TO)	6:00	Швидкий, простий
Імуноблот	6:00	Дорогий
Молекулярно-БІОЛОГІЧНИЙ
МГ	5-7 днів	Дорогий, трудомісткий
ПЛР	3:00	Дорогий

Методи діагностики вірусу оперізувального герпесу

Методи діагностики	Лабораторні методики
НЕПРЯМІ
Виділення	Культура тканини, курячі ембріони, лабораторні тварини, спільне культивування з пермісивними клітинами або вірусами-помічниками
Ідентифікація ізолятів	Реакція нейтралізації, РСК, ІФ, ПІЕФ, реакція ізолятів преципитации, аглютинації, ІФ
ПРЯМИЙ
Цитологія	Мазки: колірна імунофлюоресценція
Гістологія	Патоморфологія клітини
Структура	Ембріональна мікроскопія, іммуноелектронная мікроскопія
Визначення антигенів	IF, PIEF, RIM, IFA
Визначення місцевої вироблення антитіл	Ig M, Ig G, Ig A: IFA, RIA
Молекулярнобиологические підходи	Молекулярна гібридизація, ПЦР

Лабораторна діагностика інфекції, спричиненої вірусом оперізуючого герпесу

Діагностичні проблеми	Методи	Очікувані результати
Гостра первинна інфекція	1	Виявлення через 2 години
	2	Рівень антитіл зростає повільно
	3	Присутні через 3 дні після інфекції
Гостра реактивировать інфекція	1	Виявлення У'У через 2 години
	2	Рівень антитіл зростає повільно
	4	Присутні через 4 дні після появ висипань

1. визначення в рідини везикул ВІЕФ;
2. cерологія: РСК, ІФА, спрямовані на виявлення
3. cерологія: ІФА, спрямовані на виявлення IgМ;
4. серология: ІФА, спрямовані на виявлення IgА, IgM.

Методи індикації імунної відповіді інфекції, зумовленої вірусом оперізуючого герпесу

Підхід	Метод
Виявлення підвищення титру антитіл у других сироватках	РСК, РГГА, РПГА, реакція нейтралізації ІФ, РИМ, ІФА
Виявлення Ig G, Ig A класспеціфіческіх антитіл в першій пробі сироватки	ІФА, ІФ, РІМ, латекс-аглютинація

Інтерпретація результатів серологічного обстеження сироваток хворих на герпесвірусні інфекції (ІФА)

Назва інфекції / маркера	Середні порогові значення для інфекцій
	Результати аналізу	Інтерпретація
Цитомегалія анти-ЦМВ IgG (1-20 Е / мл) Анти-CMV IgM (100-300%)	Позитивний 1-6 позитивний 6-10 Позитивний> 10 Негативний Позитивний 100-300 Негативний <90 Сумнівний 90-100	Ремісія Загострення хвороби Гостра фаза хвороби Ні інфікування (захворювання) Гостра фаза хвороби Повторити аналіз через 2-3 тижні
Герпес простий 1,2 серотипів Анти-HSV 1/2 заг. (100-900%)	Позитивний 100-400 Позитивний 400-800 Позитивний> 800 Негативний <100	Ремісія Загострення хвороби Гостра фаза хвороби Ні інфікування (захворювання)

У таблиці представлені основні методи лабораторної діагностики герпесвірусних інфекцій, а також рекомендовані біологічні матеріали, які досліджуються при виділенні ВПГ з урахуванням локалізації герпетичних уражень

Вірогідним є виділення вирусов простого герпесу і ЦМВ за допомогою зараження чутливих клітинних культур. Так, при вирусологическом обстеженні 26 хворих в період рецидиву ВПГ було виділено на чутливій культурі клітин Vero в 23 випадках (88,4%). У заражених культурах спостерігалася характерна для ВПГ картина цитопатичної дії - утворення багатоядерних гігантських клітин або скупчення округлих і збільшених в розмірі клітин у вигляді грон. У 52,1% випадків вже до 16-24 год. Після зараження можна було виявити осередки цитопатичної дії вірусу. До 48-72 годинам інкубації заражених культур відсоток матеріалів, що викликають специфічну деструкцію клітин, збільшився до 87%. І лише в 13% випадків позитивні результати були виявлені через 96 годин після зараження і більш-при повторному пасирування.

Методи лабораторної діагностики генералізованої герпетичної інфекції

Основні методи, спрямовані на виявлення (виділення) герпесвирусов, їх часток і їх компонентів	Допоміжні методи, спрямовані на виявлення антитіл до вірусів герпесу в біологічних рідинах, виявлення ферментативних зрушень в сироватці крові
Виділення вірусів герпесу на чутливих культурах клітин і тварин Пряма і імунна електронна мікроскопія Прямий і непрямий варіанти імунопероксидазному методу Прямий і непрямий варіанти методу флуоресцентних антитіл Варіанти твердофазного імуноферментного аналізу Варіанти методу молекулярної (ДНК ДНК) гібридизації Полімеразна ланцюгова реакція Реакція аглютинації латексу	Реакція нейтралізації Реакція зв'язування комплементу Реакція аглютинації латексу Непрямий варіант методу флуоресцентних антитіл Непрямий варіант імунопероксидазному методу Варіанти твердофазного імуноферментного аналізу Метод імунного блоттинга Метод радіальної фіксації комплементу Визначення рівнів аланін і аспартатамінотрансферази

Для діагностики інфекційного мононуклеозу (інфекція, викликана ВЕБ) використовують серологічні методи. Реакція Пауль-Буннеля з еритроцитами барана, діагностичний титр 1:28 і вище при одноразовому дослідженні сироватки крові, або 4-кратний приріст антитіл при обстеженні парних сироваток. Використовують реакцію Гоффа-Бауера з суспензією 4% формалінйзірованних еритроцитів коня. Результат враховують через 2 хвилини, при інфекційному мононуклеозі реакція високоспецифічні.

В даний час розробляється імуноферментний (ІФА) метод діагностики інфекційного мононуклеозу. При цьому антитіла класів IgG і IgМ в сироватці хворого визначають шляхом її інкубації з лімфобластами, зараженими ВЕБ з подальшою обробкою флюоресцирующими антитілами. У гострому періоді захворювання антитіла до вірусного капсидному антигену визначаються в титрі 1: 160 і вище.

При використанні ряду імпортних комерційних тест-систем в ІФА можна виявити: антитіла до ант Іген оболонки ВЕБ, антитіла до раннього антигену ВЕБ, загальні антитіла до раннього антигену ВЕБ, що визначаються в гострій фазі захворювання і в ядрі і в цитоплазмі клітини, і обмежені антитіла до раннього ВЕБ, що визначаються в гострій фазі захворювання і в ядрі і в цитоплазмі клітини, обмежені антитіла до раннього антигену ВЕБ, що визначаються в розпал захворювання тільки в цитоплазмі клітини, і антитіла до ядерного антигену ВЕБ. Використання даних тест-систем дозволяє проводити диференційну діагностику ряду захворювань, пов'язаних з ВЕБ.

Після позитивної ІФА, яка виявила антитіла до ВЕБ, ставлять підтверджує реакцію иммуноблотинга, в якій визначають наявність антитіл до окремих маркерним білків ВЕБ (р-протеїни): р23, Р54, Р72 (наявність цього білка вказує на можливість розмноження ВЕБ), р 138. Зазначені вище лабораторні методи використовують і для контролю ефективності лікування.

Чутливість вірусологічних методів 85-100%, специфічність 100%, час дослідження 2-5 днів. Часто в практичній роботі використовується метод прямої імунофлюоресценції (ПІФ) з поліклональними або моноклональними антитілами проти ВПГ-1 і ВПГ-2. Метод ПІФ досить легко відтворюємо в звичайній клінічній лабораторії, не є дорогим, чутливість вище 80%, специфічність 90-95%. При імунофлюоресцентної мікроскопії виявляли наявність цитоплазматичних включень, морфологічні особливості, відсоток інфікованих клітин в мазках-соскобах з уретри, цервікального каналу, шийки матки, прямої кишки.

Метод ПІФ дає уявлення про морфологічні властивості клітин і зміні локалізації антигенів ВПГ. Крім прямих ознак ураження клітин вірусами герпесу (виявлення специфічного світіння) є непрямі ознаки герпетичної інфекції за даними ПІФ:

• агрегація ядерного речовини, відшаровування каріолемми;
• наявність т. Н. Ядерно «дірок», коли від ядра клітини залишається тільки одна каріолемми;
• наявність внутрішньоядерних включень - тільця Каудрі.

При постановці ПІФ лікар отримує не тільки якісну, але і кількісну оцінку стану інфікованих клітин, що нами було використано для оцінки ефективності проведеної противірусної терапії ацикловіром (АЦ). Так, 80 хворих простим генітальним герпесом (ГГ) обстежені методом ПІФ в динаміці. Показано, що якщо до лікування ацикловіром в мазках 88% хворих був високий відсоток інфікованих клітин (50-75% і вище), то після одного курсу ацикловиром в мазках 44% хворих виявлялися здорові клітини, в 31% випадків відзначені поодинокі інфіковані клітини і у 25% хворих було до 10% інфікованих клітин.

Зміст інфікованих клітин в мазках (реакція ПІФ) хворих на генітальний герпес, які лікувалися ацикловиром

Періоди хвороби	Процентний вміст в мазках
	Інфікованих клітин					Нормальних клітин
	Більш 75%	50-75%	40-50%	10%	Поодинокі клітини в п / зр
Рецидив (до лікування)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Ремісія (після лікування)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Використовуючи багато років ПІФ і метод дот-гібридизації, відзначено майже в 100% випадків збіг результатів дослідження. Слід зазначити, що для підвищення надійності діагностики ГГ, особливо у випадках наявності субклінічних і маломаніфестними форм герпесу, рекомендується використовувати в роботі 2-3 методу лабораторної діагностики, особливо при обстеженні вагітних, жінок з неблагополучним акушерським анамнезом, осіб з неуточненими гінекологічним діагнозом.

Так, при ПЛР-діагностики вірусно-бактеріальних інфекцій урогенітального тракту необхідно проводити оцінку отриманих позитивних результатів з урахуванням анамнезу, наявності (або відсутності) конкретних клінічних симптомів хвороби. Якщо за допомогою ПЛР виявлено хламідії, то в даному випадку з великою ймовірністю можна говорити про інфікування і вирішувати відповідним чином питання терапії. У разі виявлення мікоплазм (уреаплазм), є умовно-патогенними мікроорганізмами, для підтвердження діагнозу потрібно провести додатково культуральні дослідження, т. Е. Посів матеріалу від хворого на чутливі клітинні культури. Тільки при отриманні позитивних результатів при культуральному аналізі можна говорити про лабораторне підтвердження діагнозу микоплазмоза. Цей же метод дозволить при необхідності визначити і чутливість виділених мікоплазм до часто використовуваних лікарських форм (антибіотиків, фторхінолонів та ін.).

Можливо одномоментне інфікування декількома вірусами сімейства Неrреsviridae. Нерідко ми виявляли інфікування одного пацієнта вірусами ВПГ-1, ВПГ-2 і ЦМВ. Значно частіше інфіковані декількома вірусами герпесу були пацієнти з клініко-лабораторними проявами вторинних ІДС (хворі онкогематологічні, онкологічні, ВІЛ-інфіковані). Так, показано, що прогресуючі при ВІЛ-інфекції клініко-імунологічні порушення супроводжуються збільшенням числа виявлених методом молекулярної гібридизації герпесвирусов. При цьому прогностично найбільш значущим можна вважати комплексне одномоментне виявлення ДНК ВПГ-1, ЦМВ і ВГЧ-6 типу.

[1], [2], [3]