Діагностика герпесу

Діагностика герпесу базується на класичному виділенні вірусу на чутливих клітинних культурах, імунофлуоресцентному та серологічному методах, кольпоскопічному дослідженні та використанні сучасних молекулярно-біологічних методів (ПЛР, точкова гібридизація), що дозволяє діагностувати всю групу герпесвірусів, включаючи HHV-6 та HHV-7 типи.

Лабораторні методи діагностики герпетичної інфекції

Основні методи, спрямовані на виділення ВПГ або виявлення вірусних частинок та/або їх компонентів	Допоміжні методи, спрямовані на виявлення антитіл до ВПГ у біологічних рідинах організму людини
Виділення ВПГ у чутливих клітинних та тваринних культурах Пряма та імунна електронна мікроскопія Прямі та непрямі варіанти IPA ІФА Молекулярно-біологічні методи Реакція латексної аглютинації	Реакція нейтралізації Королівська шкільна комісія (РШК) Визначення антитіл до неструктурних білків ВПГ-1,2

Було показано, що у 76% пацієнтів генітальний герпес (ГГ) спричинений ВПГ-2, а у 24% – ВПГ-1 типу. Причому ГГ як моноінфекція зустрічався лише у 22% пацієнтів, у 78% випадків виявлено мікробні асоціації. У 46% осіб виявлено паразитоценоз, спричинений двома збудниками, зокрема хламідії виявлені у 40% випадків. Гарднерели, трихомонади та гонококи виявлялися в мазках рідше.

У 27% пацієнтів паразитоценоз був представлений трьома збудниками, у 5,2% – чотирма збудниками. Причому найчастіше відзначалося поєднання хламідій з гарднерелою та грибами Candida. Ці дані обґрунтовують необхідність ретельного бактеріологічного обстеження пацієнтів з ГХ з метою виявлення комбінацій патогенних агентів, а також поглибленого вивчення патогенезу змішаних інфекцій урогенітального тракту, що дозволить проводити диференційовану комплексну терапію герпетичної інфекції.

Матеріали, що досліджувалися для виділення ВПГ залежно від локалізації герпетичних уражень

Локалізація уражень	Вміст везикул	Зібрання клітин				СМР	Бронхіальний аспірат	Біопсія	Кров
		1	2	3	4
Шкіра	+								+
Очі			+						+
Статеві органи				+					+
Анус	+				+				+
Рот	+	+							+
ЦНС	+					+		+	+
Легені		+					+		+
Печінка								+	+
Вроджений герпес	+	+	+				+		+

Методи лабораторної діагностики цитомегаловірусної інфекції

Методи	Час, необхідний для отримання результатів	Нотатки
ВІРУСОЛОГІЧНИЙ
Електронна мікроскопія	3 години	Не дуже доступно
Виділення вірусу в культурі клітин (VCI)	4-20 днів	Стандартний, Повільний
Імунофлуоресцентне фарбування ранньої стадії АГ з використанням моноклональних антитіл	6 годин	Менш специфічний
ЦИТОЛОГІЧНИЙ	2-3 години	Менш специфічний
СЕРОЛОГІЧНИЙ
Королівська шкільна комісія (РШК)	2 дні	Стандартний
РГА	1 день	Трудомісткий
РИФ	6 годин	Простий, конкретний
НРІФ	6 годин	Важко
РІМП	6 годин	Важко
ІФА (IgM, DO)	6 годин	Швидко, просто
Імуноблот	6 годин	Дорого
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНИЙ
МГ	5-7 днів	Дорого, трудомістко
ПЛР	3 години	Дорого

Методи діагностики вірусу оперізувального герпесу

Діагностичні методи	Лабораторні методи
НЕПРЯМИЙ
Вибір	Культура тканин, курячі ембріони, лабораторні тварини, спільне культивування з пермісивними клітинами або хелперними вірусами
Ідентифікація ізолятів	Реакція нейтралізації, RSC, IF, PIEF, реакція преципітації ізолятів, аглютинація, IF
ПРЯМИЙ
Цитологія	Мазки: кольорова імунофлуоресценція
Гістологія	Патоморфологія клітини
Структура	Ембріональна мікроскопія, імуноелектронна мікроскопія
Визначення антигенів	IF, PIEF, RIM, IFA
Визначення локального вироблення антитіл	Ig M, Ig G, Ig A: ІФА, РІА
Молекулярно-біологічні підходи	Молекулярна гібридизація, ПЛР

Лабораторна діагностика інфекції, спричиненої вірусом оперізувального герпесу

Діагностичні проблеми	Методи	Очікувані результати
Гостра первинна інфекція	1	Виявлення за 2 години
	2	Рівень антитіл повільно зростає
	3	З'являється через 3 дні після зараження
Гостра реактивована інфекція	1	Виявлення ННН через 2 години
	2	Рівень антитіл повільно зростає
	4	З'являється через 4 дні після появи висипу

1. визначення везикул VEGF у рідині;
2. серологія: КСК, ІФА, спрямована на виявлення
3. серологія: ІФА, спрямована на виявлення IgM;
4. серологія: ІФА, спрямований на виявлення IgA, IgM.

Методи індикації імунної відповіді на інфекцію вірусом оперізувального герпесу

Підхід	Метод
Виявлення підвищення титру антитіл у другій сироватці	РСК, РТГА, РПГА, реакція нейтралізації ІФ, РИМ, ІФА
Виявлення специфічних антитіл класу Ig G, Ig A у першому зразку сироватки	ІФА, ІФ, РИМ, латекс-аглютинація

Інтерпретація результатів серологічного дослідження сироваток крові пацієнтів на герпесвірусні інфекції (ІФА)

Назва інфекції/маркера	Середні порогові значення для інфекцій
	Результати аналізу	Інтерпретація
Цитомегалія Анти-CMV IgG (1-20 Од/мл) Антитіла IgM до ЦМВ (100-300%)	Позитивний 1-6 Позитивний 6-10 Позитивний >10 Негативний Позитивний 100-300 Негативний <90 Сумнівний 90-100	Ремісія Загострення захворювання Гостра фаза захворювання Відсутність інфекції (захворювання) Гостра фаза захворювання Повторити аналіз через 2-3 тижні
Герпес простого 1, 2 серотипи Анти-HSV 1/2 загалом (100-900%)	Позитивний 100-400 Позитивний 400-800 Позитивний >800 Негативний <100	Ремісія Загострення захворювання Гостра фаза захворювання Відсутність інфекції (захворювання)

У таблиці представлені основні методи лабораторної діагностики герпесвірусних інфекцій, а також рекомендовані біологічні матеріали, що досліджуються при виділенні ВПГ, з урахуванням локалізації герпетичних уражень.

Надійне виділення вірусів простого герпесу та ЦМВ шляхом інфікування чутливих клітинних культур. Так, під час вірусологічного обстеження 26 пацієнтів у період рецидиву ВПГ був виділений на чутливій культурі клітин Vero у 23 випадках (88,4%). Інфіковані культури демонстрували картину цитопатичної дії, типову для ВПГ - утворення багатоядерних гігантських клітин або скупчення округлих та збільшених клітин у вигляді кластерів. У 52,1% випадків вогнища цитопатичної дії вірусу могли бути виявлені вже через 16-24 години після інфікування. До 48-72 годин інкубації інфікованих культур відсоток матеріалів, що викликають специфічне руйнування клітин, збільшився до 87%. І лише у 13% випадків позитивні результати були виявлені через 96 годин після інфікування або більше або під час повторного пасажування.

Методи лабораторної діагностики генералізованої герпетичної інфекції

Основні методи, спрямовані на виявлення (виділення) герпесвірусів, їх частинок та компонентів	Допоміжні методи, спрямовані на виявлення антитіл до вірусів герпесу в біологічних рідинах, виявлення ферментативних зрушень у сироватці крові
Виділення вірусів герпесу на чутливих клітинних та тваринних культурах. Пряма та імунна електронна мікроскопія. Прямі та непрямі варіанти імунопероксидазного методу. Прямі та непрямі варіанти методу флуоресцентних антитіл. Варіанти твердофазного імуноферментного аналізу. Варіанти методу молекулярної (ДНК-ДНК) гібридизації. Полімеразна ланцюгова реакція. Реакція латекс-аглютинації.	Реакція нейтралізації Реакція фіксації комплементу Реакція латекс-аглютинації Непрямий варіант методу флуоресцентних антитіл Непрямий варіант імунопероксидазного методу Варіанти твердофазного імуноферментного аналізу Метод імунного блоттингу Метод радіальної фіксації комплементу Визначення рівнів аланін- та аспартатамінотрансферази

Для діагностики інфекційного мононуклеозу (інфекції, спричиненої вірусом Епштейна-Барр) використовуються серологічні методи. Реакція Поля-Баннелла з еритроцитами барана, діагностичний титр 1:28 або вище в одноразовому дослідженні сироватки крові або 4-кратне збільшення антитіл при дослідженні парних сироваток. Використовується реакція Гоффа-Бауера з 4% суспензією формалінізованих еритроцитів коня. Результат враховується через 2 хвилини; при інфекційному мононуклеозі реакція є високоспецифічною.

Наразі розробляється метод імуноферментного аналізу (ІФА) для діагностики інфекційного мононуклеозу. У цьому випадку антитіла IgG та IgM у сироватці крові пацієнта визначають шляхом інкубації її з лімфобластами, інфікованими ВЕБ, з подальшою обробкою флуоресцентними антитілами. У гострому періоді захворювання антитіла до капсидного антигену вірусу визначаються в титрі 1:160 і вище.

При використанні низки імпортних комерційних тест-систем, ІФА може виявляти: антитіла до оболонкових антитіл ВЕБ, антитіла до раннього антигену ВЕБ, загальні антитіла до раннього антигену ВЕБ, що визначаються в гострій фазі захворювання як у ядрі, так і в цитоплазмі клітини, та обмежені антитіла до раннього ВЕБ, що визначаються в гострій фазі захворювання як у ядрі, так і в цитоплазмі клітини, обмежені антитіла до раннього антигену ВЕБ, що визначаються на піку захворювання лише в цитоплазмі клітини, та антитіла до ядерного антигену ВЕБ. Використання цих тест-систем дозволяє проводити диференціальну діагностику низки захворювань, пов'язаних з ВЕБ.

Після позитивного результату ІФА-тесту, який виявляє антитіла до ВЕБ, проводиться підтверджувальна реакція імуноблотингу, яка визначає наявність антитіл до окремих маркерних білків ВЕБ (p-білків): p23, p54, p72 (наявність цього білка вказує на можливість розмноження ВЕБ), p 138. Вищезазначені лабораторні методи також використовуються для контролю ефективності лікування.

Чутливість вірусологічних методів становить 85-100%, специфічність – 100%, час дослідження – 2-5 днів. У практичній роботі часто використовується метод прямої імунофлуоресценції (ПІФ) з поліклональними або моноклональними антитілами проти HSV-1 та HSV-2. Метод ПІФ досить легко відтворюється в умовах звичайної клінічної лабораторії, не є дорогим, чутливість – вище 80%, специфічність – 90-95%. Імунофлуоресцентна мікроскопія виявляла наявність цитоплазматичних включень, морфологічні особливості, відсоток інфікованих клітин у мазках-зіскрібках з уретри, цервікального каналу, шийки матки, прямої кишки.

Метод PIF дає уявлення про морфологічні властивості клітин та зміни в локалізації антигенів HSV. Окрім прямих ознак пошкодження клітин герпесвірусами (виявлення специфічної люмінесценції), існують непрямі ознаки герпесінфекції за даними PIF:

• агрегація ядерної речовини, відшарування каріолеми;
• наявність так званих «діркових» ядер, коли від ядра клітини залишається лише одна каріолема;
• наявність внутрішньоядерних включень – тілець Коудрі.

Під час проведення ПІФ лікар отримує не лише якісну, а й кількісну оцінку стану інфікованих клітин, яку ми використовували для оцінки ефективності противірусної терапії ацикловіром (АЦ). Так, методом ПІФ у динаміці було обстежено 80 пацієнтів з простим генітальним герпесом (ГГ). Було показано, що якщо до лікування ацикловіром у 88% пацієнтів був високий відсоток інфікованих клітин (50-75% і вище) у мазках, то після одного курсу ацикловіру здорові клітини були виявлені в мазках у 44% пацієнтів, у 31% випадків відзначалися поодинокі інфіковані клітини, а у 25% пацієнтів було до 10% інфікованих клітин.

Вміст інфікованих клітин у мазках (реакція PIF) пацієнтів з генітальним герпесом, які отримували ацикловір

Періоди хвороби	Відсотковий вміст у мазках
	Інфіковані клітини					Нормальні клітини
	Більше ніж 75%	50-75%	40-50%	10%	Поодинокі клітини в полі зору
Рецидив (до лікування)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Ремісія (після лікування)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Використовуючи PIF та метод точкової гібридизації протягом багатьох років, було відзначено, що результати дослідження збігаються майже у 100% випадків. Слід зазначити, що для підвищення достовірності діагностики герпесу, особливо у випадках субклінічних та маломаніфестних форм герпесу, рекомендується використовувати в роботі 2-3 методи лабораторної діагностики, особливо при обстеженні вагітних, жінок з несприятливим акушерським анамнезом та осіб з неуточненим гінекологічним діагнозом.

Таким чином, при ПЛР-діагностиці вірусних та бактеріальних інфекцій урогенітального тракту необхідно оцінювати отримані позитивні результати з урахуванням анамнезу, наявності (або відсутності) специфічних клінічних симптомів захворювання. Якщо хламідії виявлені за допомогою ПЛР, то в цьому випадку існує висока ймовірність інфікування та питання терапії можуть бути вирішені відповідно. У разі виявлення мікоплазм (уреаплазм), які є умовно-патогенними мікроорганізмами, для підтвердження діагнозу необхідні додаткові культуральні дослідження, тобто посів матеріалу від пацієнта на чутливі клітинні культури. Тільки за умови отримання позитивних результатів у культуральному аналізі можна говорити про лабораторне підтвердження діагнозу мікоплазмозу. Цей же метод дозволить за необхідності визначити чутливість виділених мікоплазм до часто використовуваних лікарських форм (антибіотиків, фторхінолонів тощо).

Можливе одночасне інфікування кількома вірусами родини Herpesviridae. Нами часто виявлялося інфікування одного пацієнта вірусами HSV-1, HSV-2 та CMV. Пацієнти з клінічними та лабораторними проявами вторинних ІВС (онкогематологічні, онкологічні, ВІЛ-інфіковані пацієнти) значно частіше були інфіковані кількома герпесвірусами. Таким чином, було показано, що клінічні та імунологічні порушення, що прогресують при ВІЛ-інфекції, супроводжуються збільшенням кількості герпесвірусів, що виявляються методом молекулярної гібридизації. У цьому випадку найбільш прогностично значущим можна вважати комплексне одночасне виявлення ДНК HSV-1, CMV та HHV-6 типу.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]