Лабораторна діагностика туберкульозу

Туберкульоз – це захворювання, яке легко діагностувати в сучасних умовах та завдяки науковим досягненням. Лабораторна діагностика туберкульозу займає центральне місце серед інших діагностичних методів, поступаючись лише рентгенологічним методам дослідження.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Клінічний аналіз крові

У хворих на туберкульоз зміни загального аналізу крові не є патогномонічними. При обмежених та малоактивних формах туберкульозу характерна гіпохромія еритроцитів за нормальної кількості. При масивних інфільтратах або казеозній пневмонії, при поширеному казеозному лімфаденіті, специфічному ураженні кишечника, а також при великих легеневих або післяопераційних кровотечах відзначаються еритропенія та мікроцитоз, олігохромазія, поліхромазія. Макроцитоз, і особливо пойкілоцитоз, зустрічаються значно рідше, зазвичай при тяжкій анемії. Кількість ретикулоцитів у компенсованій стадії туберкульозу коливається від 0,1 до 0,6%, у субкомпенсованій стадії - від 0,6 до 1,0%, а для декомпенсованої стадії характерний 1% ретикулоцитів.

У деяких випадках туберкульозу може спостерігатися помірний лейкоцитоз (до 15 тис. лейкоцитів), рідше лейкопенія, яка зустрічається у 2-7% випадків у пацієнтів з обмеженими та легкими формами процесу та у 12,5% при деструктивному та прогресуючому туберкульозі легень.

Найчастіше відбуваються зрушення в лейкоцитній формулі. Відзначається як відносна, так і абсолютна нейтрофілія, помірний зсув лейкоцитної формули вліво до промієлоцитів. Мієлоцити дуже рідко зустрічаються у випадках неускладненого туберкульозу. Збільшення кількості нейтрофілів з патологічною зернистістю в гемограмі хворого на туберкульоз завжди свідчить про тривалість процесу: у хворих на тяжкий туберкульоз майже всі нейтрофіли містять патологічну зернистість. Коли спалах туберкульозу стихає, ядерний зсув відносно швидко повертається до норми. Патологічна зернистість нейтрофілів зазвичай зберігається довше, ніж інші зміни в гемограмі.

Вміст еозинофілів у периферичній крові також коливається залежно від фази процесу та алергічного стану організму. Їх кількість зменшується до анеозинофілії при важких і затяжних спалахах захворювання і, навпаки, збільшується під час розсмоктування інфільтратів і плеврального випоту, а також при ранніх формах первинного туберкульозу.

Більшість форм первинного туберкульозу супроводжуються лімфопенією, яка іноді спостерігається протягом кількох років навіть після рубцювання специфічних змін. Вторинний туберкульоз у гострій фазі, залежно від тяжкості процесу, може супроводжуватися або нормальною кількістю лімфоцитів, або лімфопенією.

Серед тестів для оцінки туберкульозного процесу особливе місце займає визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ), що має значення для оцінки перебігу туберкульозного процесу та виявлення його активних форм. Збільшення ШОЕ свідчить про наявність патологічного процесу (інфекційно-запального, гнійного, септичного, гемобластозу, лімфогранулематозу тощо) та служить показником його тяжкості, але нормальні значення ШОЕ не завжди свідчать про відсутність патології. Прискоренню осідання еритроцитів сприяє збільшення вмісту в крові глобулінів, фібриногену, холестерину та зниження в'язкості крові. Уповільнення осідання еритроцитів характерне для станів, що супроводжуються гемоконцентрацією, збільшенням вмісту альбумінів та жовчних кислот.

Гемограма хворих на туберкульоз змінюється під час лікування. Чим успішніше терапевтичне втручання, тим швидше зникають гематологічні зміни. Водночас слід враховувати вплив різних антибактеріальних препаратів на кровотворення. Вони часто викликають еозинофілію, в деяких випадках – лейкоцитоз, а частіше лейкопенію аж до агранулоцитозу та лімфоїдно-ретикулярну реакцію. Систематичний гематологічний моніторинг та правильний аналіз отриманих даних мають важливе значення для оцінки клінічного стану пацієнта, динаміки процесу та ефективності лікування.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Клінічний аналіз сечі

При туберкульозі сечовивідних шляхів основним лабораторним методом діагностики є аналіз сечі. Може спостерігатися лейкоцитурія, еритроцитурія, протеїнурія, гіпоізостенурія, туберкульозна мікобактеріурія, неспецифічна бактеріурія.

Лейкоцитурія є найпоширенішим симптомом туберкульозу сечовивідних шляхів перед специфічною хіміотерапією та відсутня лише у виняткових випадках, таких як повна облітерація просвіту сечоводу. Проба Нечипоренка (визначення кількості лейкоцитів в 1 мл сечі) допомагає більш об'єктивно оцінити ступінь лейкоцитурії при нефротуберкульозі, а в деяких випадках виявити її при нормальному загальному аналізі сечі. Однак слід враховувати, що лейкоцитурія може виникати при гострому та хронічному пієлонефриті, циститі, уретриті, каменях у нирках та сечоводах.

Еритроцитурія, як і лейкоцитурія, вважається однією з найпоширеніших лабораторних ознак туберкульозу сечостатевого тракту. Частота гематурії залежить від поширеності процесу; вона зростає в міру розвитку деструктивного туберкульозного процесу в нирці. Еритроцитурія без лейкоцитурії більш типова для ранніх стадій туберкульозу нирок. Гематурія, що переважає над лейкоцитурією, є важливим аргументом на користь туберкульозу нирок при диференціації його від неспецифічного пієлонефриту.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Біохімічний аналіз крові

При туберкульозі зміни деяких біохімічних показників залежать, перш за все, від фази процесу, ускладнень та різних супутніх захворювань. У хворих на неактивний туберкульоз легень та інших органів загальний білок та білкові фракції сироватки крові не змінюються та визначають їх нормальний вміст.

При гострих формах захворювання, а також при загостренні та прогресуванні хронічних форм туберкульозу альбумін-глобуліновий коефіцієнт знижується.

Істотне значення в оцінці функціонального стану та органічного ураження печінки при туберкульозі та його ускладненнях має визначення прямого та загального білірубіну, аспартатамінотрансферази (АСТ), аланін-амінотрансферази (АЛТ) у сироватці крові. Динамічне визначення рівня амінотрансфераз. білірубіну при лікуванні хворих на туберкульоз, особливо у важких його формах, є обов'язковим компонентом біохімічного обстеження хворих на туберкульоз і проводиться щомісяця.

Оцінка функціонального стану нирок включає визначення креатиніну сироватки крові та розрахунок швидкості клубочкової фільтрації за формулою Кокрофта-Голта. Розрахунок швидкості клубочкової фільтрації за допомогою проби Реберга дає менш точні результати.

Головною метою динамічних біохімічних досліджень хворих на туберкульоз є моніторинг перебігу процесу, своєчасне виявлення побічних ефектів препаратів та адекватна корекція виникаючих порушень гомеостазу.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Застосування біохімічних методів дослідження при позалегеневому туберкульозі

Найбільш інформативним показником вважається вміст туберкулостеаринової кислоти в біологічних рідинах, проте його визначення пов'язане з технічними труднощами (необхідність використання газової хроматографії та мас-спектрометрії).

Перспективним є вимірювання активності аденозиндезамінази – ферменту, що визначається в рідинах: синовіальній, перикардіальній, асцитичній або спинномозковій. Основними продуцентами аденозиндезамінази є лімфоцити та моноцити. Визначення активності аденозиндезамінази в біологічних рідинах полегшує діагностику туберкульозного синовіту, туберкульозу лімфатичних вузлів, туберкульозного менінгіту, туберкульозного серозиту.

Деякі біохімічні показники, через їхню неспецифічність, визначаються лише в біологічних рідинах поблизу ураження. Рівень показників вимірюється у відповідь на підшкірне або внутрішньошкірне введення туберкуліну (зазвичай до введення та через 48 і 72 години після нього). Після цього розраховується ступінь підвищення рівня маркера (у %) відносно початкового рівня.

Оптимально активність органоспецифічного ферменту трансамідинази визначається в сечі; її поява відзначається при ураженні нирок різного походження. Дослідження трансамідинази виправдане лише за умов підшкірного введення туберкуліну з метою загострення місцевого запального процесу. Активність трансамідинази визначається в сечі первинно та через 24-72 години після введення 50 ТЕ туберкуліну. Збільшення ферментурії в 2 рази і більше дозволяє у 82% випадків диференціювати активний туберкульоз нирок від загострення хронічного пієлонефриту.

При туберкульозі жіночих статевих органів концентрації гаптоглобіну та малонового діальдегіду в крові визначають за умов провокаційної туберкулінової проби. Туберкулін вводять підшкірно в дозі 50 ТЕ та проводять повторне біохімічне дослідження через 72 години. При туберкульозній етіології ступінь підвищення рівня гаптоглобіну становить не менше 28%, а рівень малонового діальдегіду – 39% і більше. Також використовують визначення активності аденозиндезамінази в перитонеальній рідині, отриманій з дугласової кишені. Пункцію досліджують повторно через 72 години після внутрішньошкірного введення туберкуліну в дозах 0,1 ТЕ та 0,01 ТЕ в ділянці проекції внутрішніх статевих органів на передню черевну стінку. Збільшення активності аденозиндезамінази на 10% і більше порівняно з початковим значенням свідчить про туберкульозний процес.

У разі ураження ока досліджується вогнищева реакція, що виникає в оці у відповідь на антигенну стимуляцію. У цьому випадку розвиток різко вираженої відповіді, що супроводжується зниженням зорових функцій, є небажаним. Оскільки оцінка мінімальних вогнищевих реакцій часто буває складною, рекомендується паралельно зосередитися на ступені підвищення гаптоглобіну або аденозиндезамінази в сироватці крові для об'єктивізації висновку.

Усі біохімічні дослідження слід проводити в поєднанні з іншими методами.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Дослідження системи згортання крові

Актуальність вивчення стану системи згортання крові у фтизіатрії зумовлена наявністю кровохаркання або легеневих кровотеч у низки пацієнтів з туберкульозом легень, а також гемокоагуляційних ускладнень при хірургічному лікуванні туберкульозу. Крім того, природно супутня латентна внутрішньосудинна гемокоагуляція впливає на перебіг захворювання та ефективність хіміотерапії.

У хворих на туберкульоз легень з переважним ексудативним компонентом запалення спостерігається зниження антикоагулянтної активності крові. У пацієнтів з низькою поширеністю специфічного ураження легень з переважним продуктивним компонентом запалення внутрішньосудинна гемокоагуляція виражена незначно. У хворих на туберкульоз легень з кровохарканням та легеневими кровотечами стан системи згортання крові відрізняється: у пацієнтів з незначною крововтратою на висоті крововтрати або одразу після її припинення спостерігається різке підвищення коагуляційної здатності крові через виражену інтенсифікацію процесів тромбінутворення при збереженні підвищеної «структурної» згортання. У пацієнтів з масивною крововтратою спостерігається зниження коагуляційного потенціалу через зниження концентрації фібриногену, активності фактора XIII та кількості тромбоцитів. На етапі хірургічного лікування у пацієнтів з обмеженими формами туберкульозу легень суттєвих порушень у системі гомеостазу не відбувається. У пацієнтів з поширеними процесами при проведенні пневмонектомії або плевропневмонектомії часто розвивається ДВЗ-синдром, який може проявлятися у формі «другої хвороби».

Для контролю стану системи згортання крові у хворих на туберкульоз легень необхідно визначити активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ), фібриноген, тромбіновий час, протромбіновий індекс, а також час кровотечі та час згортання крові.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Гормональні дослідження

Сучасні експериментальні та клінічні спостереження свідчать про наявність змін гормонального статусу при специфічному туберкульозному запаленні легень. Доведено, що корекція дисфункції гіпофізарно-надниркової, гіпофізарно-тиреоїдної систем та функції підшлункової залози в поєднанні з протитуберкульозною терапією сприяє активації фіброгенезу та процесів репарації у вогнищі специфічного запалення.

Функціональний стан гіпофізарно-тиреоїдної системи оцінюється за вмістом трийодтироніну (Т3), тироксину (Т4) та тиреотропного гормону гіпофіза (ТТГ) у сироватці крові _. Встановлено _, що субклінічний гіпотиреоз виявляється у 38-45% пацієнтів з туберкульозом легень, і найчастіше він діагностується при дисемінованій та фіброзно-кавернозній формах процесу. При цих формах рівні як Т3, так і Т4 найбільш різко знижені _, і виникає _{дисбаланс} цих гормонів у вигляді збільшення співвідношення _Т4/ Т3.

Функцію кори надниркових залоз оцінюють за рівнем кортизолу в сироватці крові, а ендокринну функцію підшлункової залози – за концентрацією імунореактивного інсуліну. У гострій фазі інфекційного захворювання потреба в ендогенному кортизолі та інсуліні зростає. Гіперінсулінемія також свідчить про інсулінорезистентність тканин організму, що характерно для будь-якого активного запального процесу, зокрема специфічного. Визначення глюкокортикоїдної функції надниркових залоз при активному туберкульозі легень дозволяє виявити наявність гіперкортицизму у більшості пацієнтів. Нормальну концентрацію кортизолу в крові у пацієнта з інфекційним запаленням у гострому періоді слід розцінювати як відносну недостатність глюкокортикоїдної функції кори надниркових залоз, що може служити основою для замісної терапії адекватними дозами глюкокортикоїдів.

Майже у третини пацієнтів з туберкульозом легень спостерігається низький рівень інсулінемії, що наближається до нижньої межі норми, тоді як у 13-20% спостерігається значний гіперінсулінізм. Як відносний гіпо-, так і гіперінсулінізм є факторами високого ризику розвитку порушень вуглеводного обміну різного ступеня тяжкості. Ці зміни функціональної активності В-клітин підшлункової залози вимагають регулярного контролю глікемії у пацієнтів з туберкульозом та своєчасної профілактики цукрового діабету. Крім того, це служить додатковим обґрунтуванням доцільності використання фізіологічних доз інсуліну в комплексній терапії туберкульозу.

Загалом, зниження рівня гормонів щитовидної залози, їх дисбаланс, гіперкортизолемія та гіперінсулінізм найбільш виражені у пацієнтів з тяжким перебігом туберкульозного процесу, з обширними ураженнями легень та вираженими симптомами туберкульозної інтоксикації.

Мікробіологічна діагностика туберкульозу

Мікробіологічні дослідження необхідні для виявлення хворих на туберкульоз, верифікації діагнозу, контролю та корекції хіміотерапії, оцінки результатів лікування, іншими словами, з моменту взяття хворого на туберкульоз на облік до моменту зняття його з обліку.

Усі епідеміологічні програми та проекти базуються на оцінці кількості бактеріовиділень, що неможливо зробити без використання лабораторних методів виявлення мікобактерій туберкульозу. При дослідженні звернення так званого неорганізованого населення відсоток бактеріовиділень сягає 70 і більше, що робить лабораторні методи досить ефективним засобом виявлення хворих на туберкульоз серед цієї групи населення.

Традиційними мікробіологічними методами діагностики туберкульозу є бактеріоскопічні та культуральні дослідження. Сучасні методи включають культивування мікобактерій туберкульозу в автоматизованих системах та ПЛР. Однак усі ці методи обов'язково поєднуються з класичними бактеріологічними методами.

Збір діагностичного матеріалу

Ефективність лабораторних досліджень значною мірою залежить від якості діагностичного матеріалу. Дотримання правил збору, зберігання та транспортування діагностичного матеріалу та точне виконання алгоритму обстеження пацієнта безпосередньо впливає на результат та забезпечує біологічну безпеку.

Для тестування на туберкульоз використовуються різноманітні матеріали. Оскільки туберкульоз легень є найпоширенішою формою туберкульозної інфекції, основним матеріалом для тестування вважається мокротиння та інші види виділень трахеобронхіального дерева: виділення верхніх дихальних шляхів, отримані після інгаляцій аерозолю: промивні води бронхів; бронхоальвеолярні лаважи; матеріал, отриманий під час бронхоскопії, транстрахеальної та внутрішньолегеневої біопсії: бронхіальний аспірат, мазки з гортані, ексудати, мазки з ран тощо.

Ефективність дослідження підвищується, якщо проводиться контрольований забір матеріалу у пацієнта. Для цього виділяється спеціально обладнана кімната або купуються спеціальні кабінки. Забір матеріалу – небезпечна процедура, тому матеріал для дослідження необхідно збирати з дотриманням правил інфекційної безпеки.

Матеріал для дослідження на мікобактерії туберкульозу збирають у стерильні флакони з щільно закрученими кришками, щоб запобігти забрудненню навколишнього середовища та захистити зібраний матеріал від забруднення.

Флакони для збору діагностичного матеріалу повинні відповідати наступним вимогам:

• повинні бути виготовлені з ударостійкого матеріалу;
• повинен легко плавитися під час автоклавування;
• мати достатній об'єм (40-50 мл):
• мати широкий отвір для збору мокротиння (діаметр не менше 30 мм);
• бути зручним у використанні, прозорим або напівпрозорим, щоб кількість та якість зібраного зразка можна було оцінити, не відкриваючи кришку.

Для отримання оптимальних результатів дослідження необхідно дотримуватися наступних умов:

• забір матеріалу слід проводити до початку хіміотерапії;
• матеріал для дослідження необхідно зібрати перед їжею або прийомом ліків вранці;
• Для дослідження бажано зібрати щонайменше 3 ранкові зразки мокротиння. Мокротиння збирають протягом 3 днів поспіль;
• Зібраний матеріал необхідно доставити до лабораторії якомога швидше:
• у випадках, коли неможливо негайно доставити матеріал до лабораторії, його зберігають у холодильнику за температури повітря 4 °C не більше 48 годин;
• Під час транспортування матеріалу необхідно звертати особливу увагу на цілісність пляшок.

Правильно зібране мокротиння має слизовий або слизисто-гнійний характер. Оптимальний об'єм досліджуваної порції мокротиння становить 3-5 мл.

Збір мокротиння здійснюється під наглядом медичного працівника. Особи, відповідальні за збір мокротиння, повинні забезпечити дотримання певних правил:

• Необхідно пояснити пацієнту мету обстеження та необхідність відкашлювати не слину чи носоглоточний слиз, а вміст глибоких відділів дихальних шляхів. Цього можна досягти в результаті продуктивного кашлю, що виникає після кількох (2-3) глибоких вдихів. Також необхідно попередити пацієнта, що він повинен попередньо прополоскати рот кип'яченою водою, щоб видалити основну частину мікрофлори, що вегетує в ротовій порожнині, та залишки їжі, що ускладнюють дослідження мокротиння;
• Медичний працівник, який займається збором мокротиння, крім халата та шапочки, повинен носити маску, гумові рукавички та гумовий фартух;
• стоячи позаду пацієнта, йому рекомендується тримати пляшку якомога ближче до губ і одразу ж відокремлювати мокротиння в неї, коли він її відкашлює, при цьому необхідно стежити, щоб потік повітря був спрямований від медичного працівника:
• Після завершення збору мокротиння медичний працівник повинен ретельно закрити пляшку кришкою та оцінити кількість і якість зібраного мокротиння. Потім пляшку етикетують та поміщають у спеціальну коробку для транспортування до лабораторії.

Якщо у пацієнта не виділяється мокротиння, то напередодні ввечері та рано вранці в день збору матеріалу йому слід дати відхаркувальний засіб: екстракт коренів алтеї (мукалтин), бромгексин, амброксол тощо - або застосувати подразнюючу інгаляцію, використовуючи обладнання, встановлене в кімнаті для збору мокротиння. Зібраний таким чином матеріал не підлягає консервації та має бути досліджений у день збору. Щоб уникнути його «бракування» в лабораторії, у направленні слід зробити спеціальну позначку.

Якщо мікробіологічні дослідження не проводяться в даному закладі, зібраний діагностичний матеріал необхідно доставити до лабораторії централізовано за умови зберігання матеріалу в холодильнику або з консервантами між поставками. Матеріал до лабораторії доставляється в транспортних коробках, які можна легко дезінфікувати. Кожен зразок повинен бути забезпечений відповідною етикеткою, а вся партія повинна мати заповнену супровідну форму.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Способи та частота обстеження пацієнтів

Під час первинного, так званого діагностичного, обстеження хворого на туберкульоз необхідно дослідити не менше 3 порцій мокротиння, зібраного під наглядом медичного персоналу протягом 2 або 3 днів, що підвищує ефективність мікроскопії.

Первинне обстеження на туберкульоз повинні проводити всі лікувально-діагностичні заклади системи охорони здоров'я. Останнім часом для підвищення ефективності первинного обстеження на базі клініко-діагностичних лабораторій організовано так звані центри мікроскопії, оснащені сучасними мікроскопами та обладнанням для забезпечення епідемічної безпеки.

У протитуберкульозних закладах використовується схема обстеження, яка передбачає не менше 3-кратне дослідження мокротиння або іншого діагностичного матеріалу протягом 3 днів. Під час лікування мікробіологічні дослідження проводяться регулярно не рідше одного разу на місяць у фазі інтенсивної хіміотерапії. При переході до фази подальшого спостереження дослідження проводяться рідше – з інтервалом 2-3 місяці, при цьому частота досліджень скорочується до двох.

Особливості збору діагностичного матеріалу для виявлення позалегеневого туберкульозу

Особливістю патологічного матеріалу при позалегеневих формах туберкульозу є низька концентрація в ньому мікобактерій туберкульозу, що вимагає більш чутливих методів мікробіологічного дослідження, насамперед методів посіву на живильне середовище.

При туберкульозі сечостатевого тракту сеча є найдоступнішим матеріалом для дослідження. Збір сечі повинна проводитися спеціально навченою медсестрою.

Зовнішні статеві органи миють водою з милом або слабким розчином перманганату калію. Зовнішній отвір уретри ретельно обробляють. Середню порцію ранкової сечі збирають у стерильну пляшечку: у чоловіків – природним шляхом, у жінок – за допомогою катетера. Сечу з ниркових мисок збирають у стерильні пробірки під час катетеризації однієї або двох нирок, в останньому випадку – обов’язково окремо з кожної нирки. Невелику кількість цієї сечі центрифугують, осад досліджують.

У чоловіків сперму, проколи яєчок та секрет простати центрифугують для отримання осаду. При будь-якій локалізації певного процесу в області статевих органів у чоловіків масаж простати може сприяти виділенню секретів, що містять мікобактерії туберкульозу.

Менструальну кров у жінок збирають шляхом відсмоктування або за допомогою ковпачка Кафки. Отриманий матеріал звільняють від еритроцитів, промиваючи його дистильованою водою, а потім центрифугуючи. Осад досліджують.

Виділення з цервікального каналу матки збирають у якусь ємність або ковпачок Кафки, тобто бажано накопичити 1-2 мл патологічного матеріалу.

Матеріал, отриманий під час хірургічних втручань на нирках, статевих органах, біопсії, зішкрібки ендометрія, гомогенізують. Для цього його поміщають у стерильну ступку та ретельно подрібнюють стерильними ножицями. До отриманої суспензії додають стерильний річковий пісок у кількості, що дорівнює її масі, потім 0,5-1,0 мл ізотонічного розчину натрію хлориду та все подрібнюють до утворення кашоподібної маси з додаванням ізотонічного розчину натрію хлориду (4-5 мл). Потім масі дають відстоятися протягом 1-1,5 хвилин, досліджують надосадову рідину.

Туберкульоз кісток та суглобів. Прокол (гній з абсцесів), отриманий стерильним шприцом, поміщають у стерильний контейнер та негайно доставляють до лабораторії. За допомогою стерильної піпетки, попередньо зволоженої стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду, беруть 2-5 мл гною, переносять у флакон з кульками та додають ще 2-3 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Флакон закривають пробкою та струшують у шейкері протягом 8-10 хвилин. Гомогенізовану суспензію досліджують.

При свищевих формах кістково-суглобового туберкульозу гній береться з фістули. Рясні виділення збираються безпосередньо в пробірку. У випадках мізерних гнійних виділень фістульний хід промивають стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду, а змивні рідини, зібрані в пробірку, або шматочок тампона, змочений гноєм, направляють на дослідження.

Хірургічний матеріал, отриманий під час хірургічних втручань на кістках та суглобах, може складатися з гнійно-некротичних мас, грануляцій, рубцевої тканини, кісткової тканини, тканини синовіальної оболонки та інших субстратів. Його обробка проводиться так само, як і при туберкульозі нирок.

Мікробіологічне дослідження синовіальної рідини у 3% розчині цитрату натрію (у співвідношенні 1:1) для запобігання згортанню проводять одразу після пункції.

Туберкульоз лімфатичних вузлів. Гній, виділений під час пункції лімфатичних вузлів, досліджується так само, як і гній з абсцесів. Тканину лімфатичних вузлів, отриману під час хірургічних втручань та біопсій, досліджують, як і при інших формах туберкульозу.

Дослідження калу на мікобактерії туберкульозу проводиться вкрай рідко через майже повну відсутність позитивних результатів.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Мікроскопія мікобактерій

Мікроскопія мокротиння – це відносно швидкий, простий і недорогий метод, який слід використовувати у всіх випадках підозри на туберкульоз. Крім того, це дослідження проводиться для оцінки ефективності хіміотерапії та підтвердження одужання або невдачі лікування за відсутності результатів посіву.

Використовуються два методи мікроскопічного дослідження:

• метод прямої мікроскопії, коли мазок готується безпосередньо з діагностичного матеріалу;
• метод мікроскопії осаду, приготованого з матеріалу, обробленого деконтамінантами, для культурального дослідження.

Перший метод використовується в тих лабораторіях, де проводяться лише мікроскопічні дослідження (клініко-діагностичні лабораторії загальної медичної мережі).

Найкращі результати мікроскопічного дослідження отримують шляхом концентрування діагностичного матеріалу (наприклад, центрифугуванням).

Для виявлення Mycobacterium tuberculosis з 50% ймовірністю за допомогою мікроскопії, 1 мл мокротиння має містити понад 5000 мікробних клітин. Мокротиння хворих на легеневі форми туберкульозу зазвичай містить значну кількість кислотостійких бактерій, що дозволяє достовірно виявляти їх за допомогою бактеріоскопії. Діагностичну чутливість цього методу можна підвищити, дослідивши кілька зразків мокротиння від одного пацієнта. Негативний результат бактеріоскопічного дослідження не виключає діагнозу туберкульозу, оскільки мокротиння деяких пацієнтів містить менше мікобактерій, ніж можна виявити за допомогою мікроскопії. Неякісне приготування мазків мокротиння також може бути причиною негативного результату бактеріоскопічного дослідження.

Найпоширенішим методом виявлення кислотостійких мікобактерій у мазку є забарвлення за Цілем-Нільсеном. Метод заснований на проникненні карболового фуксину в мікробну клітину через мембрану, що включає восково-ліпідний шар, з одночасним впливом нагрівання та сильної травлячої дії фенолу. Подальше знебарвлення мазка 25% розчином сірчаної кислоти або 3% соляним спиртом призводить до знебарвлення всіх некислотостійких структур. Знебарвлені елементи мазка забарвлюються 0,3% розчином метиленового синього. Мікобактерії не сприймають звичайні анілінові барвники, внаслідок чого кислотостійкі мікобактерії забарвлюються в малиново-червоний колір, а інші мікроби та клітинні елементи – в синій.

Для дослідження мазків, забарвлених за Цілем-Нільсеном, використовують світловий бінокулярний мікроскоп з імерсійним об'єктивом (90- або 100-кратне збільшення) та окуляром із 7- або 10-кратним збільшенням. Досліджують 100 полів зору, чого достатньо для виявлення поодиноких мікобактерій у мазку. Якщо результат такого дослідження негативний, рекомендується дослідити ще 200 полів зору для підтвердження. Результати фіксують, вказуючи кількість виявлених кислотостійких мікобактерій (КШБ).

Окрім цього методу, для люмінесцентної мікроскопії використовується флуорохромне фарбування, що дозволяє досягти найкращих результатів. Використання цього методу підвищує ефективність мікроскопії на 10-15%. При обробці мікобактерій люмінесцентними барвниками (аурамін, родамін тощо) ці речовини також зв'язуються з воскоподібними структурами мікробної клітини. При опроміненні забарвлених клітин збуджуючим джерелом світла (певний спектр ультрафіолетового випромінювання) вони починають світитися помаранчевим або яскраво-червоним кольором на чорному або темно-зеленому фоні. Завдяки високій яскравості та контрастності видимого зображення загальне збільшення мікроскопа можна зменшити в 4-10 разів, що розширює поле зору та скорочує час перегляду препарату. Поряд з цим, завдяки значно більшій глибині різкості, можна підвищити комфортність дослідження.

При використанні флуоресцентної мікроскопії перегляд тієї ж ділянки мазка займає значно менше часу, ніж світлова мікроскопія мазків, забарвлених за Цілем-Нільсеном. Якщо мікроскопіст переглядає приблизно 20-25 таких мазків протягом робочого дня, то за допомогою флуоресцентної мікроскопії він може дослідити понад 60-80 зразків за один і той же час. Досвідчені мікроскопісти знають, що забарвлення клітин сумішшю аураміну та родаміну певним чином специфічне для кислотостійких мікобактерій, які в цьому випадку мають вигляд золотих паличок. Сапрофіти забарвлюються в зеленуватий колір.

Ще однією важливою перевагою методу флуоресцентної мікроскопії є можливість виявлення змінених мікобактерій, які втратили свої кислотостійкі властивості під впливом низки несприятливих факторів, зокрема інтенсивної хіміотерапії, і тому не виявляються за допомогою забарвлення за Цілем-Нільсеном.

До недоліків методу флуоресцентної мікроскопії слід віднести відносно високу вартість мікроскопа та його експлуатації. Однак у централізованих або інших великих лабораторіях, де робоче навантаження перевищує норму трьох лаборантів, які працюють із трьома звичайними мікроскопами, дешевше використовувати один флуоресцентний мікроскоп.

Бактеріоскопічні методи мають досить високу специфічність (89-100%). Близько 97% позитивних результатів, отриманих будь-яким методом мікроскопії, чітко підтверджуються результатами посіву.

Слід зазначити, що мікроскопічне дослідження мазка патологічного матеріалу не дозволяє визначити вид виявлених кислотостійких мікобактерій. Мікроскопічний метод дозволяє зробити висновок лише про наявність або відсутність кислотостійких мікроорганізмів у препараті, що пояснюється існуванням у природі великої кількості нетуберкульозних кислотостійких мікроорганізмів, морфологічно подібних до мікобактерій туберкульозного комплексу.

Оцінка результатів мікроскопії проводиться в напівкількісних одиницях.

Для можливості порівняння результатів різних методів мікроскопії вводяться емпіричні коефіцієнти. Наприклад, для порівняння результатів мазка, забарвленого флуоресцентними барвниками, з даними світлового мікроскопічного дослідження (1000-кратне збільшення), необхідно кількість кислотостійких мікобактерій, виявлених за допомогою флуоресцентного мікроскопа, поділити на відповідний коефіцієнт: при 250-кратному збільшенні мікроскопа - на 10, при 450-кратному - на 4, при 630-кратному - на 2.

Особливості мікроскопії при позалегеневому туберкульозі

Проводиться пряма мікроскопія, а також мікроскопія мазків, приготованих після збагачення, з подальшим фарбуванням за Цілем-Нільсеном або флуоресцентними барвниками. Пряма мікроскопія мазків неефективна через низьку концентрацію мікобактерій у матеріалі, і тому раціональніше використовувати методи збагачення. Найбільш ефективним є центрифугування. Якщо біологічний матеріал в'язкий, використовується центрифугування з одночасною гомогенізацією та розрідженням матеріалу, яке проводять за допомогою високошвидкісних центрифуг із силою центрифугування 3000 g та розчинів гіпохлориту. Інші методи збагачення, такі як мікрофлотація, наразі не використовуються через утворення біологічно небезпечних аерозолів.

[ 37 ]

Культуральний метод діагностики туберкульозу

Метод посіву, або метод культивування, є чутливішим за мікроскопію мазка та має низку переваг перед останньою. Він дозволяє виявляти кілька десятків життєздатних мікобактерій у досліджуваному матеріалі та має високу діагностичну цінність. Це особливо важливо при дослідженні матеріалу від вперше діагностованих або лікованих пацієнтів, які виділяють невелику кількість мікобактерій.

Порівняно з мікроскопією, культуральне дослідження дозволяє збільшити кількість виявлених хворих на туберкульоз більш ніж на 15-25%, а також верифікувати туберкульоз на ранніх стадіях, коли захворювання ще легко піддається лікуванню. Дуже важливою перевагою культурального дослідження вважається можливість отримання культури збудника, яку можна ідентифікувати та вивчити щодо чутливості до препаратів, вірулентності та інших біологічних властивостей.

До недоліків методів культивування можна віднести їх тривалість (термін очікування матеріалів досягає 10 тижнів), вищу вартість та складність обробки діагностичного матеріалу.

Принципи передпосівної обробки діагностичного матеріалу

Звичайні мікробіологічні методи не можуть бути використані для проведення тестів на туберкульоз. Це пов'язано з тим, що мікобактерії туберкульозу ростуть дуже повільно, а більшість клінічних зразків містять швидкозростаючі гнійні та гнильні мікроорганізми та гриби. Їх швидкий ріст на багатих поживних середовищах перешкоджає розвитку мікобактерій і не дозволяє виділити збудника туберкульозу, тому діагностичний матеріал перед посівом необхідно попередньо обробити. Крім того, мікобактерії, що виділяються з дихальних шляхів пацієнта, зазвичай оточені великою кількістю слизу, що ускладнює їх концентрування. У зв'язку з цим перед посівом мокротиння та інших подібних матеріалів їх необхідно розрідити та знезаразити.

Усі мийні та дезактивуючі засоби мають більш-менш виражену токсичну дію на мікобактерії. В результаті обробки може загинути до 90% мікобактерій. Для збереження достатньої частини популяції мікобактерій необхідно використовувати щадні методи обробки, які дозволяють, з одного боку, придушити швидкозростаючі гнійні та гнильні мікроорганізми, а з іншого боку, максимально зберегти життєздатність мікобактерій, присутніх у матеріалі.

Залежно від матеріалу, його однорідності та рівня забруднення, для передпосівної обробки використовуються різні деконтамінанти: для мокротиння - 4% розчин гідроксиду натрію, 10% розчини тринатрійфосфату, бензалконію хлориду тринатрійфосфат, NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеїн-гідроксид натрію) з кінцевою концентрацією NaOH 1%, для сечі та інших рідких матеріалів - 3% розчин сірчаної кислоти, для забруднених зразків, матеріалів, що містять жир - розчин щавлевої кислоти до 5%. Крім того, в деяких випадках використовуються ферменти та поверхнево-активні речовини (детергенти). Використання Tween та деяких інших детергентів супроводжується меншою загибеллю клітин мікобактерій (виживає 40-50%). Однак їх можна використовувати лише для рідких матеріалів. NALC-NaOH, що випускається в наборах, є найбільш широко використовуваним у світі. Цей метод дозволяє виділити понад 85% популяції клітин мікобактерій. Деконтамінація твердих матеріалів, що містять тканини, є складнішою, оскільки важко вгадати ступінь диспергування матеріалу під час гомогенізації. Наприклад, обробка біоптатів лімфатичних вузлів часто супроводжується підвищеною частотою забруднення сторонньою флорою. У цьому випадку можна використовувати 1% розчин етонію.

Неоднорідний матеріал гомогенізують за допомогою скляних кульок у присутності деконтамінантів. Рідкі матеріали попередньо центрифугують, і обробляється лише осад.

Техніка посіву та інкубації

Після попередньої обробки матеріал центрифугують, що призводить до осадження мікобактерій та збільшення їх вмісту в осаді («збагачення осаду»). Отриманий осад нейтралізують та висівають на поверхню щільних поживних середовищ або пробірок з рідкими (напіврідкими) середовищами. З решти осаду готують мазки для мікроскопічного дослідження. Методика посіву повинна запобігати перехресному забрудненню діагностичного матеріалу.

Для достовірної клінічної інтерпретації результатів мікробіологічного дослідження необхідно дотримуватися наступного правила: мікроскопічні та культуральні дослідження необхідно проводити паралельно з одного й того ж зразка діагностичного матеріалу.

Інокульовані пробірки поміщають у термостат при температурі 37 ^o C на 2 дні в горизонтальному положенні. Це забезпечує більш рівномірне всмоктування матеріалу в поживне середовище. Через 2 дні пробірки переміщують у вертикальне положення та герметично закривають гумовими або силіконовими пробками, щоб запобігти висиханню засіяних середовищ.

Посіви витримують у термостаті при температурі 37 ^° C протягом 10-12 тижнів з регулярним щотижневим оглядом. При кожному контрольному огляді реєструють такі параметри:

• період візуально спостережуваного росту з дня посіву;
• швидкість росту (кількість КУО);
• забруднення культури сторонньою мікробною флорою або грибами (такі пробірки видаляють);
• немає видимого наростання. Трубки залишають у термостаті до наступної перевірки.

Поживні середовища

Для культивування мікобактерій використовуються різні поживні середовища: тверді, напіврідкі, рідкі. Однак жодне з відомих поживних середовищ не має властивостей, що забезпечують ріст усіх клітин мікобактерій. У зв'язку з цим для підвищення ефективності рекомендується використовувати одночасно 2-3 поживні середовища різного складу.

Як стандартне середовище для первинного виділення збудника туберкульозу та визначення його чутливості до препаратів, ВООЗ рекомендує середовище Левенштейна-Йенсена. Це щільне яєчне середовище, на якому ріст мікобактерій отримують на 20-25-й день після посіву бактеріоскопічно позитивного матеріалу. Посів бактеріоскопічно негативного матеріалу вимагає тривалішого інкубаційного періоду (до 10-12 тижнів).

У нашій країні поширення набуло яєчне середовище Фінна-II, запропоноване Е. Р. Фінном. Воно відрізняється тим, що замість L-аспарагіну використовується глутамат натрію, який запускає інші шляхи синтезу амінокислот у мікобактерій. Ріст на цьому середовищі з'являється дещо раніше, а частота виділення мікобактерій на 6-8% вища, ніж на середовищі Левенштейна-Йенсена.

Для підвищення ефективності бактеріологічної діагностики позалегеневого туберкульозу доцільно включати до комплексу поживних середовищ модифіковане середовище Finn-II. Для прискорення росту в поживне середовище Finn-II додатково вносять 0,05% тіогліколяту натрію, що знижує концентрацію кисню. Для захисту ферментних систем мікобактерій від токсичних продуктів перекисного окислення ліпідів у поживне середовище Finn-II вносять антиоксидант α-токоферолу ацетат у концентрації 0,001 мкг/мл. Діагностичний матеріал висівають за стандартною методикою.

У протитуберкульозних лабораторіях Росії використовуються й інші модифікації щільних поживних середовищ: поживне середовище «Нова», запропоноване Г. Г. Мордовським, поживні середовища А-6 та А-9, розроблені В. А. Анікіним, тощо.

Через те, що під час хіміотерапії відбувається пошкодження різних метаболічних систем мікробної клітини, частина мікобактеріальної популяції втрачає здатність нормально розвиватися на звичайних поживних середовищах і потребує осмотично збалансованих (напіврідких або рідких) поживних середовищ.

Оцінка та реєстрація результатів посіву діагностичного матеріалу

Деякі штами та види мікобактерій ростуть повільно, ріст може з'явитися навіть до 90-го дня. Кількість таких культур невелика, але це змушує посіви тримати в термостаті протягом 2,5-3 місяців.

Вірулентні культури Mycobacterium tuberculosis зазвичай ростуть на твердих яєчних середовищах у вигляді колоній R-форми різного розміру та зовнішнього вигляду. Колонії сухі, зморшкуваті, кольору слонової кістки та злегка пігментовані. На інших середовищах колонії Mycobacterium tuberculosis можуть бути більш вологими. Після курсу хіміотерапії або під час лікування можуть бути виділені гладкі колонії з вологим ростом (S-форми).

При виділенні культур використовується комплекс спеціальних досліджень для диференціації туберкульозних мікобактерій від нетуберкульозних мікобактерій та кислотостійких сапрофітів.

Позитивна відповідь дається після обов'язкового мікроскопічного дослідження мазка з вирослих колоній, забарвлених за Цілем-Нільсеном. У разі зростання мікобактерій у мазках виявляються яскраво-червоні палички, що лежать поодинці або групами, утворюючи скупчення у вигляді повсті або кісок. У молодих культурах, особливо виділених від пацієнтів, які тривалий час лікувалися хіміотерапією, мікобактерії відрізняються вираженим поліморфізмом, аж до наявності коротких, майже коккоподібних або видовжених варіантів, що нагадують грибний міцелій, поряд з паличкоподібними формами.

Інтенсивність росту мікобактерій позначається за такою схемою: (+) - 1-20 КУО в пробірці (низьке бактеріовиділення); (++) - 20-100 КУО в пробірці (помірне бактеріовиділення); (+++) - >100 КУО в пробірці (рясне бактеріовиділення). У лабораторній діагностиці туберкульозу недостатньо дати відповідь, що вказує на те, чи були виявлені мікобактерії певним методом. Необхідно також мати детальне уявлення про обсяг і характер популяції мікобактерій, її склад і властивості. Саме ці дані дозволяють правильно інтерпретувати стан процесу, планувати тактику та своєчасно коригувати лікування.

В останні роки для прискорення росту мікобактерій було запропоновано поживні середовища на основі агару з різними ростовими добавками та використанням спеціальної газової суміші. Для отримання росту мікобактерій на цих середовищах під час культивування створюється атмосфера з підвищеним вмістом вуглекислого газу (4-7%). Для цього використовуються спеціальні CO2-інкубатори _. Однак найбільшого розвитку отримали автоматизовані системи культивування мікобактерій: MGIT-BACTEC-960 та MB/Bact.

Однією з таких систем є система MGIT (пробірка для індикації росту мікобактерій), яка є високотехнологічною розробкою та призначена для прискореної бактеріологічної діагностики туберкульозу та визначення чутливості мікобактерій до препаратів першого ряду та деяких препаратів другого ряду. MGIT призначена для використання у складі приладу VASTEC-960. Мікроорганізми культивуються у спеціальних пробірках з рідким поживним середовищем на основі модифікованого середовища Middlebrook-7H9. Для стимуляції росту мікобактерій та пригнічення росту сторонньої мікрофлори використовується добавка MGIT Growth Supplement та суміш антибактеріальних препаратів PANTA.

Ріст мікроорганізмів реєструється оптично. Він заснований на флуоресценції, яка виникає, коли мікобактерії споживають кисень під час свого росту. Киснезалежний флуорохромний барвник міститься на дні спеціальної пробірки та покритий шаром силікону. Розмноження мікобактерій призводить до зменшення кількості кисню в пробірці та зменшення його концентрації, що викликає збільшення флуоресценції, яка стає видимою при опроміненні пробірки ультрафіолетовим світлом та автоматично реєструється фотосенсорами, вбудованими в прилад VASTES-960. Інтенсивність люмінесценції реєструється в одиницях росту (GU). Дані росту автоматично вводяться в комп'ютер, де їх можна зберігати. Комп'ютерний аналіз кривих росту може надати інформацію про наявність різних пулів мікобактерій, включаючи нетуберкульозні, а також допомагає оцінити ростові властивості мікобактерій.

В результаті впровадження таких систем час росту мікобактерій значно скоротився, в середньому становлячи 11 днів на VASTEC-960 та 19 днів на MB/Bact проти 33 днів на стандартному щільному поживному середовищі. Слід зазначити, що ці системи потребують висококваліфікованого персоналу. Посів матеріалу на рідкі середовища обов'язково супроводжується посівом на середовище Левенштейна-Йенсена, яке відіграє роль резервного у випадках, коли туберкульозні мікобактерії не ростуть на інших середовищах.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Визначення чутливості мікобактерій до ліків

Визначення спектру та ступеня чутливості мікобактерій до протитуберкульозних препаратів має велике клінічне значення, а також для епідеміологічної оцінки поширення лікарсько-резистентного туберкульозу. Крім того, моніторинг лікарської резистентності дозволяє оцінити ефективність протитуберкульозної програми в цілому, будучи інтегральним показником роботи всіх компонентів протитуберкульозних заходів.

Частота та терміни тестування на чутливість до ліків:

• перед початком лікування, одноразово для визначення стратегії та тактики лікування:
• При виділенні культур з різних матеріалів від пацієнта (мокротиння, БАЛ, сеча, ексудати, спинномозкова рідина тощо) досліджують усі виділені штами:
• після закінчення інтенсивної фази лікування за відсутності клінічної та радіологічної динаміки:
• якщо необхідно змінити схему лікування у разі:
  • відсутність негативності мокротиння;
  • повторне посівування після негативного результату мокротиння;
  • різке збільшення кількості КСБ у мазку після початкового зниження. Загальновідомо, що з матеріалу від хворого на туберкульоз виділяють штами Mycobacterium tuberculosis з різною чутливістю до препаратів. Чутливість штамів до протитуберкульозних препаратів може відрізнятися спектром дії, ступенем, частотою та швидкістю розвитку резистентності.

Ступінь лікарської стійкості Mycobacterium tuberculosis визначається відповідно до встановлених критеріїв, які орієнтовані на клінічне значення резистентності та залежать від протитуберкульозної активності препарату, його фармакокінетики, концентрації в осередку ураження, максимальної терапевтичної дози тощо.

Визначення чутливості мікобактерій до ліків наразі проводиться за допомогою мікробіологічних методів:

• абсолютні концентрації (метод розведення на твердих або рідких поживних середовищах),
• пропорції,
• коефіцієнт опору.

Зазвичай резистентність проявляється у вигляді візуально спостережуваного росту колоній мікобактерій туберкульозу, проте існують методи, що індукують ріст на ранніх стадіях поділу клітин мікобактерій у вигляді кольорових реакцій. Ці методи скорочують час тестування з 3-4 до 2 тижнів.

Метод абсолютної концентрації, рекомендований Комітетом ВООЗ з хіміотерапії, набув поширення в Росії як уніфікований метод. З методологічної точки зору він є найпростішим, але вимагає високої стандартизації та точності лабораторних процедур. Тест на чутливість до ліків складається з набору пробірок з живильним середовищем, модифікованим протитуберкульозними препаратами. Набір складається з 2-3 пробірок з різною концентрацією кожного з використовуваних препаратів, однієї контрольної пробірки із середовищем без препарату та однієї пробірки, що містить 1000 мкг/мл саліцилату натрію або 500 мкг/мл паранітробензойної кислоти для виявлення росту нетуберкульозних мікобактерій.

Для приготування набору середовищ з препаратами використовують модифіковане середовище Левенштейна-Йенсена (без крохмалю), яке розливають у колби. У кожну з колб додають певний об'єм відповідного розведення протитуберкульозного препарату. Вміст колб ретельно перемішують, розливають у пробірки та коагулюють у похилому положенні протягом 40 хвилин за температури 85°C. Рекомендується коагулювати середовище в електричному коагуляторі з автоматичним контролем температури. Середовище з протитуберкульозними препаратами

1-й ряд можна зберігати в холодильнику при температурі 2-4 °C протягом 1 місяця, з препаратами 2-го ряду – не більше 2 тижнів. Зберігання середовищ з препаратами при кімнатній температурі неприпустимо. При приготуванні розчинів протитуберкульозних препаратів враховують їх активність, розраховуючи концентрацію з поправкою на молекулярну масу неспецифічної частини препарату, чистоту тощо. Для визначення чутливості до препаратів використовують лише хімічно чисті речовини.

Принцип методу полягає у визначенні концентрації протитуберкульозного препарату, яка пригнічує ріст значної частини популяції мікобактерій. За умови правильного виконання цей метод має хорошу надійність.

Перед проведенням дослідження необхідно переконатися, що виділена культура Mycobacterium tuberculosis не містить сторонньої мікрофлори. З культури мікобактерій у 0,9% розчині хлориду натрію готують гомогенну суспензію, що містить 500 мільйонів мікробних тіл в 1 мл (оптичний стандарт каламутності 5 одиниць). Отриману суспензію розбавляють 0,9% розчином хлориду натрію (1:10) і додають 0,2 мл суспензії в кожну пробірку набору поживних середовищ. Засіяні пробірки поміщають у термостат при температурі 37 °C і витримують горизонтально протягом 2-3 днів, щоб похила поверхня поживного середовища рівномірно засіялася суспензією Mycobacterium tuberculosis. Потім пробірки переводять у вертикальне положення та інкубують протягом 3-4 тижнів. Результати записують через 3-4 тижні.

Оскільки час, необхідний для виділення збудника з клінічного матеріалу на поживних середовищах, становить щонайменше 1-1,5 місяців, результати визначення чутливості до препаратів за допомогою цього методу можна отримати не раніше ніж через 2-2,5 місяці після посіву матеріалу. Це є одним з основних недоліків методу.

Результати тестування чутливості мікобактерій до препаратів інтерпретуються на основі певних критеріїв. На твердих середовищах культура вважається чутливою до концентрації препарату, що міститься в середовищі, якщо кількість колоній мікобактерій, вирощених у даній пробірці з препаратом, не перевищує 20 при рясному рості на контрольній пробірці без препаратів. Тільки за наявності більше 20 колоній культура вважається стійкою до даної концентрації. На практиці, коли отримані результати росту в пробірках, близькі до 20 КУО, необхідно повідомити клінічний підрозділ, що чутливість або стійкість у цьому випадку є прикордонною, оскільки це іноді може пояснити нечітку динаміку клінічних показників.

Для різних препаратів встановлюється певна концентрація, за якої спостерігається відтворення критичної частки популяції мікобактерій. Ці концентрації називаються «критичними». Величину росту популяції мікобактерій на живильному середовищі з препаратом у критичній концентрації використовують як критерій стабільності.

У вітчизняній фтизіатричній практиці при визначенні лікарської стійкості не обмежуються визначенням лише критичних концентрацій. Це пов'язано з тим, що розширене визначення рівня лікарської стійкості збудника дозволяє клініцисту більш правильно формулювати тактику хіміотерапії, використовуючи знання про потенціюючу дію комбінацій препаратів, передбачати перехресну резистентність або використовувати більш ефективні препарати використовуваної групи протитуберкульозних засобів.

Метод абсолютної концентрації є найпростішим, але й найбільш чутливим до помилок, що допускаються під час його проведення. Більш надійним, особливо при визначенні чутливості до препаратів другого ряду, та поширеним за межами Росії є метод пропорцій. Він враховує недоліки методу абсолютної концентрації, але є більш трудомістким у виконанні.

Метод дуже схожий на метод абсолютної концентрації. Підготовка пробірок з препаратами така ж, як і в методі абсолютної концентрації. Однак посівна доза суспензії мікобактерій туберкульозу зменшується в 10 разів, що виключає частоту спонтанної резистентності деяких штамів мікобактерій туберкульозу до таких препаратів, як етамбутол, протіонамід, капреоміцин. Як контроль використовують 2 або 3 пробірки з посівною дозою, що дорівнює дозі в пробірках, послідовно розведені в 10 та 100 разів. Критерієм резистентності є частка візуально спостережуваного росту мікобактерій туберкульозу. Для препаратів 1-го ряду критерієм резистентності є надлишковий ріст на 1% від початкової популяції, для препаратів 2-го ряду - ріст на 1 або більше 10% від початкової, залежно від обраної критичної концентрації.

У 1997 році робоча група ВООЗ та Міжнародного союзу боротьби з туберкульозом з питань виявлення резистентності до протитуберкульозних препаратів внесла корективи до цих критеріїв, запропонувавши вважати резистентними мікобактерії, що ростуть на щільному яєчному середовищі Левенштейна-Йенсена за таких концентрацій:

• дигідрострептоміцин – 4 мкг/мл;
• ізоніазид - 0,2 мкг/мл:
• рифампіцин – 40 мкг/мл:
• Етамбутол – 2 мкг/мл.

У 2001 році були запропоновані критичні концентрації для наступних препаратів другої лінії (для критичної частки 1%):

• капреоміцин – 40 мкг/мл;
• протіонамід – 40 мкг/мл;
• канаміцин – 30 мкг/мл;
• віоміцин – 30 мкг/мл;
• циклосерин – 40 мкг/мл;
• аміносаліцилова кислота – 0,5 мкг/мл;
• офлоксацин – 2 мкг/мл.

Результати росту оцінюються через 4 тижні як попередні, а через 6 тижнів культивування – як остаточні.

Для визначення лікарської чутливості до піразинаміду, який широко використовується в сучасній хіміотерапії туберкульозу, рекомендована критична концентрація становить 200 мкг/мл. Однак досі немає загальноприйнятого методу визначення лікарської стійкості до цього препарату на твердих поживних середовищах, оскільки його антибактеріальна активність проявляється лише в кислому середовищі (pH <6), яке технічно важко підтримувати. Крім того, багато клінічних культур Mycobacterium tuberculosis неохоче ростуть на яєчних середовищах з кислим середовищем.

Для оцінки якості результатів визначення чутливості мікобактерій до ліків рекомендується контролювати кожну нову партію середовища Левенштейна-Йенсена шляхом паралельного визначення чутливості стандартного музейного штаму H37Rv. Крім того, існують певні мікробіологічні критерії, які необхідно дотримуватися, щоб методи давали добре відтворюваний та правильно інтерпретований результат. До них належать життєздатність культури туберкульозних мікобактерій, правила отримання гомогенної суспензії та суспензії, правила відбору культур туберкульозних мікобактерій та репрезентативність відібраної бактеріальної маси. Надійність визначення стійкості до ліків знижується при вкрай поганому бактеріовиділенні.

Останнім часом перспективним визнано метод визначення чутливості до ліків за допомогою автоматизованих систем. Найбільш передовими в цій галузі є розробки на основі VASTEC MGIT-960. У цьому випадку чутливість мікобактерій туберкульозу до ліків визначається на основі методу модифікованих пропорцій. Під час визначення порівнюється швидкість росту мікобактерій туберкульозу в контрольній пробірці та в пробірках з препаратами. Для визначення чутливості до стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу використовуються збагачуючі добавки та антибіотики, що входять до складу набору SIRE. Для визначення чутливості до піразинаміду використовується набір PZA. Під час випробування пробірки з препаратами засівають суспензією мікобактерій туберкульозу, а також контрольні пробірки зі 100-кратним розведенням суспензії для всіх препаратів, за винятком піразинаміду, де розведення суспензії становить 10 разів. Критерієм стабільності є показник росту мікобактерій 100 GU, коли ріст у контрольній пробірці досягає 400 GU (див. «Культурні методи виділення мікобактерій»). Результати реєструються та інтерпретуються автоматично та встановлюються введеною або обраною програмою.

Кінцеві концентрації у пробірці з рідким поживним середовищем використовуються як критичні концентрації. Наразі критичні концентрації розроблені як для препаратів першого ряду, так і для деяких препаратів другого ряду. Слід зазначити, що визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до циклосерину та аміносаліцилової кислоти проводиться лише на поживних середовищах з яйцями.

Детальний протокол роботи з описаною системою дозволяє проводити тестування чутливості до ліків як на ізольованій культурі (з щільним живильним середовищем), так і з використанням первинного росту мікобактерій у пробірці MGIT. Останній варіант значно скорочує час, необхідний для проведення культуральних досліджень, дозволяючи отримати повні результати культури туберкульозних мікобактерій (включаючи інформацію про чутливість до ліків) протягом 3 тижнів після збору матеріалу, тоді як традиційний метод може забезпечити це лише до 3-го місяця. Своєчасні результати, коли пацієнт перебуває в інтенсивній фазі лікування, можуть компенсувати відносну високу вартість досліджень.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Диференціація мікобактерій

Враховуючи, що використані поживні середовища не є суворо селективними, подальша диференціація виділених мікобактерій вважається обов'язковою. Необхідність диференціації мікобактерій зумовлена низкою особливостей патологічних процесів, що викликаються представниками роду: різним перебігом та результатом туберкульозу та мікобактеріозу, наявністю природної лікарської стійкості до деяких протитуберкульозних препаратів.

Визнано, що первинна ідентифікація мікобактерій комплексу M. tuberculosis від нетуберкульозних мікобактерій проводиться за такими характеристиками: швидкість росту на щільних поживних середовищах, утворення пігменту, морфологія колоній, наявність кислотостійкості та температурний оптимум для росту.

На жаль, не існує єдиного лабораторного методу, який би міг достовірно відрізнити мікобактерії комплексу M. tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій; проте поєднання вищеописаних ознак з результатами низки біохімічних тестів, наведених нижче, дозволяє ідентифікувати мікобактерії комплексу M. tuberculosis з імовірністю до 95%.

Для диференціації мікобактерій комплексу M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii та інші) від повільно зростаючих нетуберкульозних мікобактерій використовуються основні біохімічні тести, що виявляють наявність таких ознак:

• здатність виробляти нікотинову кислоту (ніациновий тест):
• активність нітратредуктази;
• термостабільна каталаза;
• ріст на середовищі з саліцилатом натрію (1 мг/мл).

Як додатковий тест, також можна використовувати тести росту на середовищі, що містить 500 мкг/мл пара-нітробензойної кислоти або 5% хлориду натрію.

Багато бактеріологічних лабораторій ідентифікують ці мікроорганізми лише на комплексному рівні, що пов'язано з обмеженими можливостями лабораторій та методологічними можливостями спеціалістів.

У більшості випадків на практиці для диференціації M. tuberculosis та M. bovis достатньо таких тестів: ніацин, нітратредуктаза, піразинамідаза та реєстрація росту на середовищі, що містить 2 мкг/мл гідразиду тіофен-2-карбонової кислоти. Враховується, що мікобактерії комплексу M. tuberculosis характеризуються наступним набором ознак:

• повільний ріст (більше 3 тижнів);
• температура росту в межах 35-37 ^o C;
• відсутність пігментації (колір слонової кістки);
• виражене кислотостійке забарвлення;
• позитивний тест на ніацин;
• позитивний тест на нітратредуктазу;
• відсутність термостабільної каталази (68 ^o C).
• відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить:
  • 1000 мкг/мл саліцилової кислоти натрію,
  • 500 мкг/мл пара-нітробензойної кислоти,
  • 5% розчин хлориду натрію:
• ріст у присутності 1-5 мкг/мл тіофен-2-карбонової кислоти.

Актуальність диференціації ізольованих мікобактерій значно зростатиме зі зростанням частоти реєстрації випадків ВІЛ/СНІДу, пов'язаних з туберкульозом або мікобактеріозом. Наразі немає абсолютної впевненості в готовності практичних регіональних лабораторій до коректного виконання цього обсягу роботи.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Імунологічна діагностика туберкульозу

Існує ряд універсальних явищ, препаратів та імунологічних тестів, які спочатку були відкриті саме при туберкульозі або на моделі імунної відповіді на мікобактерії. До них належать БЦЖ та туберкулін, таке явище, як шкірна ДСТ (туберкулінові проби - реакції Пірке та Манту), реакція на підшкірне введення туберкуліну сенсибілізованим тваринам (феномен Коха). Одні з перших антитіл при інфекційних захворюваннях також були відкриті при туберкульозі. Звичайно, чим глибше розуміння механізмів протитуберкульозного імунітету та їх генетичного контролю, тим ширше може бути використання імунологічних методів та препаратів, що впливають на імунітет, для вирішення практичних завдань фтизіатрії.

Найважливішою та найскладнішою практичною проблемою наразі вважається виявлення туберкульозу в процесі масового скринінгу населення. Однак, незважаючи на численні повідомлення про «успіхи» (на обмеженому матеріалі), не існує жодного імунологічного методу (відтворюваного в «будь-яких руках») або препарату, придатного для цих цілей.

У клінічній практиці широко використовуються імунологічні методи, зокрема серологічні дослідження (визначення антигенів, антитіл) та туберкулінові провокаційні тести.

Серологічні методи, що визначають антигени та антитіла в різних середовищах організму, посідають перше місце серед імунологічних досліджень, що використовуються в диференціальній діагностиці.

Специфічність визначення антитіл до мікобактерій туберкульозу залежить від антигенів, що використовуються в імунному аналізі. Було запропоновано значну кількість антигенів, першим з яких є туберкулін PPD:

• ППД та інші складні препарати з культуральної рідини;
• ультразвуковий дезінтегратор;
• Екстракт тритону та інші складні препарати клітинних стінок;
• 5-антиген (Даніель);
• 60-антиген (Кокціто);
• ліпоарабіноманан;
• фактор корду (трегалоза-6,6-диміколат);
• фенольні та інші гліколіпіди;
• ліпополісахариди;
• фібронектин-зв'язуючий антиген;
• білки (найчастіше рекомбінантні); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 кДа тощо.

В результаті багаторічних досліджень російських та зарубіжних вчених були виявлені основні закономірності утворення антитіл та ефективність серологічної діагностики туберкульозу: чим складніший антиген, тим вища чутливість і нижча специфічність тестів. Специфічність варіюється в різних країнах залежно від інфікованості населення M. tuberculosis та нетуберкульозними мікобактеріями, від вакцинації БЦЖ тощо. У дітей інформативність серодіагностики нижча, ніж у дорослих. При первинному туберкульозі (частіше у дітей) більш інформативним є визначення IgM; при вторинному туберкульозі - IgG. У ВІЛ-інфікованих людей інформативність серодіагностики у визначенні антитіл знижена. Ефективність визначення антитіл залежить від низки «клінічних моментів»: активності процесу (наявність або відсутність «виділення» мікобактерій, наявність порожнин розпаду, ступінь інфільтрації), поширеності процесу, тривалості його перебігу.

Чутливість методу імуноферментного аналізу (ІФА) становить близько 70%. Недостатня ефективність дослідження зумовлена його низькою специфічністю. Раніше розглядалися можливості використання серологічного скринінгу в групах високого ризику, зокрема серед людей з посттуберкульозними змінами в легенях.

Для підвищення специфічності ІФА шукають більш специфічні антигени, зокрема отримані методами генної інженерії: ESAT-6 тощо (див. вище). Використання суворо специфічних антигенів (38 кДа, ESAT) підвищує специфічність, але значно знижує чутливість аналізу. Поряд з ІФА (експериментальні лабораторні тест-системи, такі як Pathozyme ELISA kit) пропонуються також імунохроматографічні набори з латеральною фільтрацією (Mycodot), а також інші подібні тести (мембранний точковий аналіз) з візуальною оцінкою результату тесту. При проведенні цих тестів аналіз займає 10-30 хвилин; вони не потребують спеціального обладнання, вимагають візуальної оцінки результатів, що пов'язано з певною суб'єктивністю. Ці методи мають приблизно такі ж характеристики чутливості та специфічності (70% та 90-93% відповідно), як і традиційний ІФА.

Використання методів імунного аналізу має певну цінність як додатковий метод, що враховується в комплексі методів, що використовуються в диференціальній діагностиці туберкульозу, особливо в діагностиці його позалегеневих форм. Метод ІФА є найбільш ефективним у діагностиці туберкульозного менінгіту при дослідженні спинномозкової рідини. При цьому чутливість аналізу становить 80-85%, а специфічність - 97-98%. Є інформація про ефективність визначення антитіл до Mycobacterium tuberculosis у слізній рідині при діагностиці туберкульозного увеїту.

Індукція синтезу гамма-інтерферону in vitro

Гамма-інтерферон (IFN-γ) є фактором специфічного імунного захисту, що реалізується шляхом активації ферментних систем макрофагів. Індукція синтезу IFN-γ сенсибілізованими Т-лімфоцитами зумовлена їх взаємодією з мікобактеріальними антигенами.

Як антигени використовуються як туберкуліновий PPD, так і специфічні антигени, отримані методами генної інженерії, зокрема антиген ESAT-6 (ранньо секретований антиген з молекулярною масою 6 кДа) та CFP-10 (білок культурального фільтрату, 10 кДа). Генетично модифіковані або рекомбінантні антигени відсутні в клітинах вакцини БЦЖ та інших мікобактерій. При використанні туберкуліну результати індукційного тесту IFN-γ порівнянні з результатами шкірного туберкулінового тесту (пряма кореляція). При використанні генетично модифікованих антигенів результати тесту є більш специфічними та не залежать від попередньої вакцинації БЦЖ. При обстеженні вакцинованих осіб, які не мали контакту з туберкульозною інфекцією, специфічність тесту становить 99%. Чутливість тесту серед хворих на туберкульоз коливається від 81 до 89%.

Розроблено тести та діагностичні методи, засновані на короткочасному культивуванні клітин цільної крові або мононуклеарних клітин, виділених з крові з антигенами мікобактерій туберкульозу, in vitro, з подальшим визначенням концентрації IFN-γ або підрахунком кількості Т-лімфоцитів, що синтезують IFN-γ. Концентрацію синтезованого інтерферону в пробірці визначають методом ІФА з використанням моноклональних антитіл, що зв'язують IFN-γ. Потім, за допомогою калібрування стандартного IFN-γ, визначають його концентрацію в пробірці або лунках планшета.

У тесті Elispot кількість Т-клітин, що синтезують IFN-γ, підраховується на поверхні чашки, покритої антитілами до IFN-γ.

Розробники індукційної діагностики IFN-γ in vitro, схваленої Управлінням з контролю за продуктами харчування та лікарськими засобами США, стверджують, що тест не може диференціювати латентну туберкульозну інфекцію від активного туберкульозу. Тому в регіонах з високим рівнем інфікування тест не має прямої діагностичної цінності. Однак у нашій країні його можна використовувати для диференціації туберкульозної інфекції у дітей від поствакцинальної алергії, а також для оцінки рівня специфічного імунітету під час лікування.

Наразі досліджується вітчизняна тест-система для визначення індукції синтезу IFN-γ специфічними туберкульозними антигенами in vitro.

Імунний статус та перебіг туберкульозу, імунокорекція

Під час лікування туберкульозу у людей відбуваються зміни антигенемії та стану імунної системи.

Дані щодо змін в ексудатах і тканинах значною мірою суперечливі. Єдине, що можна зазначити з повним правом, це те, що туберкульозні гранульоми, як правило, містять значну кількість активованих Т-лімфоцитів.

Має сенс зупинитися ще на двох моментах, необхідних для розуміння ролі імунологічних механізмів у лікуванні туберкульозу у людини:

• У пацієнтів зі СНІДом особливо високий рівень розвитку множинної лікарської стійкості;
• У разі множинної лікарської стійкості (і за відсутності ВІЛ-інфекції) особливо значущі імунні порушення (насамперед Т-клітинний імунітет).

При туберкульозі широко використовуються різні методи імунокорекції: перш за все, це препарати, що діють переважно на Т-клітинний імунітет та систему мононуклеарних фагоцитів (гормони тимуса, ізофон, лікопід, поліоксидоній тощо), а також цілі (аттенуйовані) мікобактерії та їх компоненти.

Молекулярно-біологічна діагностика туберкульозу

Методи молекулярної біології в діагностиці інфекційних захворювань включають переважно методи, засновані на маніпуляції геномними матеріалами бактеріальних та вірусних збудників з метою ідентифікації специфічного генетичного матеріалу - ділянок ДНК з нуклеотидною послідовністю, специфічною для даного виду або штаму збудника, для аналізу специфічних послідовностей ДНК у генах, що визначають чутливість збудника до певних препаратів, а також для аналізу функціональної активності певних генів збудника. Молекулярно-біологічні методи набули широкого поширення в наукових дослідженнях та практичного застосування в діагностиці та моніторингу різних бактеріальних та вірусних інфекцій після відкриття полімеразної ланцюгової реакції в 1985 році Керрі Малліс (лауреатка Нобелівської премії. 1989).

Принципи та можливості методу полімеразної ланцюгової реакції

ПЛР дозволяє ампліфікувати (розмножити) нуклеотидну послідовність (фрагмент ДНК патогена) у пробірці за кілька годин у мільйони разів. Проведення реакції у присутності окремих ланцюгів ДНК визначає винятково високу чутливість аналізу.

Нуклеотидна послідовність певних ділянок ланцюга ДНК визначає генетичну унікальність мікроорганізму, що пояснює високу специфічність ПЛР.

Важливість цього методу для виявлення та вивчення характеристик Mycobacterium tuberculosis зумовлена біологічними особливостями мікроорганізму, який має дуже повільний ріст: час подвоєння ДНК Mycobacterium tuberculosis під час їх культивування становить 12-24 години.

Принцип методу ПЛР полягає в ампліфікації – багаторазовому, мільйонному розмноженні ділянок певної послідовності ДНК у мікрооб'ємі пробірки з циклічним повторенням наступних трьох стадій реакції, кожна з яких відбувається в різному температурному режимі:

• I стадія – денатурація дволанцюгової ДНК при нагріванні з розбіжністю її ланцюгів;
• II етап – комплементарне зв’язування (гібридизація) праймерів (праймерних олігонуклеотидів) з кінцевими ділянками ланцюгів суворо специфічного фрагмента ДНК, відібраного для ампліфікації;
• III етап – добудова ланцюжка фрагмента ДНК за допомогою термостабільної ДНК-полімерази.

Для ампліфікації пробірка повинна містити молекули матричної ДНК. Чотири типи дезоксинуклеозидтрифосфатів (нуклеотидів), що містять відповідні азотисті основи: аденін (А), тимін (Т), гуанін (G), цитозин (С); штучно синтезовані праймерні олігонуклеотиди (праймери), що складаються з 18-20 пар основ; термостабільний фермент ДНК-полімераза з температурним оптимумом 68-72 ^° C та іони магнію.

Специфічність ПЛР залежить від вибору фрагмента ДНК. Відповідно до нього синтезуються фланкуючі праймери-олігонуклеотиди. Специфічність гібридизації та добудови ланцюга ДНК визначається принципом комплементарності наступних пар азотистих основ: аденін-тимін, гуанін-цитозин.

Для визначення геному мікобактерій туберкульозного комплексу найефективнішою мішенню ампліфікації в більшості тест-систем є фрагмент ДНК IS6110, який у більшості штамів туберкульозних мікобактерій має значну кількість (10-20) повторів у геномі, що забезпечує, поряд зі специфічністю, високу чутливість аналізу. Водночас описані штами туберкульозних мікобактерій з невеликою кількістю повторів або відсутністю фрагмента IS6110.

Екстракція молекул ДНК з біологічного зразка

Для проведення ПЛР молекули ДНК збудника необхідно виділити з біологічного матеріалу в мінімальному обсязі, з мінімальною кількістю неспецифічної ДНК та різних інгібіторів ферменту – ДНК-полімерази.

Підготовку зразків необхідно проводити в умовах, що запобігають перехресному забрудненню досліджуваних зразків ізольованими молекулами ДНК. Це вимагає попередньої обробки приміщення ультрафіолетовим світлом, підлоги та робочих поверхонь столів і приладів - хлорвмісними розчинами. Також необхідно використовувати чисті рукавички, одноразові пробірки та наконечники для автоматичних піпеток.

Для виділення ДНК Mycobacterium tuberculosis з клінічних зразків (ліквору, бронхіального лаважу), що не містять великої кількості лейкоцитів, клітинного дебрису або солей, достатньо центрифугувати зразок при 3-4 тис. обертів за хвилину, додати до осаду 20-30 мкл 2% розчину Тритону Х-100 та нагрівати при 90 ^o C протягом 30 хвилин.

Підготовка зразків мокротиння вимагає ефективного розрідження, зазвичай з використанням 4% гідроксиду натрію та N-ацетил-L-цистеїну (NALC) у концентрації 50-80 мг на зразок, залежно від в'язкості зразка. Розчин NALC слід готувати ex tempore, або порошок NALC можна додавати сухим безпосередньо до зразка. Після розрідження зразки слід центрифугувати протягом 15 хвилин при 3500-4000 об/хв (3000 g) у пробірках об'ємом 50 мл з загвинчуваною кришкою, тобто за тих самих умов, що рекомендовані для підготовки мокротиння до посіву.

Для екстракції ДНК з осаду найчастіше використовується метод, заснований на використанні 5-6 молярного розчину гуанідинізотіоціанату як лізуючого реагенту та мікропористих частинок оксиду кремнію («діатомітової землі»), що сорбують молекули ДНК. Неспецифічні речовини, включаючи можливі інгібітори, потім промивають у 2,5 молярному розчині гуанідинізотіоціанату та розчині етанолу, після чого молекули ДНК десорбуються у воді, і ці зразки використовуються для проведення ПЛР. Для спрощення технології екстракції ДНК «діатомітову землю» часто замінюють магнітними мікрочастинками, покритими оксидом кремнію. У цьому випадку для осадження частинок замість центрифугування використовується спеціальна магнітна підставка для мікропробірок.

У Росії розроблено оригінальний метод імуномагнітного розділення мікобактерій з подальшим виділенням ДНК збудника. Для імуномагнітного розділення мікобактерій туберкульозу використовуються ферочастинки розміром 3-5 мкм, покриті оксидом кремнію, до яких за допомогою хімічного зв'язку прикріплюються поліклональні (кролячі) антитіла до мікобактерій туберкульозу. Зразки мокротиння після лужного лізису нейтралізують кислим розчином Tris-HCl та інкубують з імуномагнітним сорбентом. Потім імуноферочастинки збирають за допомогою магнітного стрижня зі змінним наконечником, переносять у мікропробірку та осаджують. Додають 20-30 мкл 2% розчину Triton X-100 та нагрівають протягом 30 хвилин при 90 ^° C. Супернатант використовують як ДНК-матрицю для ПЛР-аналізу.

Складною проблемою є екстракція ДНК мікобактерій туберкульозу з біопсійних зразків. Для лізису біопсії використовується фермент протеїназа К у кінцевій концентрації 200-500 мг/л при температурі 56 ^° C протягом ночі. Потім її екстрагують одним із відомих методів. Надлишок неспецифічної ДНК у ПЛР-аналізі біопсійних зразків часто призводить до гальмування реакції, що вимагає повторної екстракції ДНК.

Методи виявлення результатів

Після завершення реакції ампліфіковані фрагменти ДНК патогена ідентифікуються за допомогою різних методів.

Метод гель-електрофорезу добре відомий. У цьому випадку отриманий фрагмент ДНК ідентифікується за допомогою позитивного контролю, що містить потрібний специфічний фрагмент ДНК, або за заздалегідь відомим розміром (кількістю пар нуклеотидів) фрагмента, який визначається за допомогою стандартного молекулярного маркера.

У присутності специфічного барвника – броміду етидію, що входить до складу дволанцюгової ДНК, синтезований фрагмент ДНК виявляється у вигляді смуги, що світиться під впливом ультрафіолетового світла.

Розмір фрагмента ДНК, визначений за допомогою електрофорезу на основі відстані, пройденої від початку, повинен відповідати відомому маркеру молекулярної маси або позитивному контролю.

Інші методи визначення результатів ПЛР базуються на гібридизації одноланцюгових продуктів ПЛР з комплементарним олігонуклеотидом – ДНК-зондом, міченим біотином, з подальшою детекцією за допомогою ферментативної реакції, наприклад, шляхом зв'язування кон'югату стрептавідин-лужна фосфатаза з біотином.

На основі цього типу детекції створені ПЛР-аналізатори, в яких детекція результатів ПЛР здійснюється автоматично в результаті зчитування оптичної щільності у зразках після того, як відбулася ферментативна реакція.

До недоліків цих методів можна віднести можливість внутрішньолабораторного забруднення досить короткими фрагментами молекул ДНК. Коли ці молекули потрапляють у щойно протестовані зразки, вони стають матрицею для ПЛР і призводять до хибнопозитивних результатів.

У зв'язку з цим, для запобігання хибнопозитивним результатам, запроваджуються суворі правила відділення та ізоляції приміщень: для екстракції ДНК з біологічних зразків; приміщень для детекції результатів (електрофорезу) від чистої зони. Ці приміщення являють собою зону ймовірного забруднення. Ще однією ізольованою зоною є чисте приміщення для введення досліджуваних зразків ДНК у пробірки з реакційною сумішшю для ПЛР. І нарешті, передбачається, що основний прилад - ДНК-ампліфікатор - слід винести в окреме, можливо, офісне, приміщення.

Щоб запобігти забрудненню продуктами попередніх реакцій – ампліконами, деякі ПЛР-тест-системи містять дезоксинуклеозид уридин замість дезоксинуклеозид тимідину, який вбудовується у відповідне положення під час синтезу ланцюга in vitro, тобто азотиста основа тимін, присутня в нативній ДНК, заміщується урацилом. Урацил ДНК-глікозилаза, додана до реакційної суміші аналізованого матеріалу, руйнує лише забруднюючі фрагменти дезоксиуридином, але не нативну аналізовану ДНК, що містить дезокситимідин. Подальше нагрівання при 94 ^o C інактивує цей фермент і не перешкоджає ампліфікації в ПЛР.

Існує тест-система, заснована на ізотермічній ампліфікації рРНК, для якої спочатку виконується зворотна транскрипція та синтез молекул ДНК, які, в свою чергу, є матрицею для подальшого синтезу молекул РНК. Амплікони РНК виявляються за допомогою ДНК-зонда, забарвленого акридином, під час гібридизації в розчині реакційної пробірки. Цей метод, крім високої чутливості, має перевагу у проведенні аналізу в одній пробірці, що запобігає забрудненню. За даними авторів, чутливість цього методу в респіраторних зразках досягає 90% зі специфічністю 99-100%.

У ПЛР у реальному часі впроваджуються нові методи детекції. Ці методи відрізняються, перш за все, тим, що ПЛР та детекція її результатів проводяться одночасно в одній закритій пробірці. Це не тільки технологічно спрощує метод аналізу, але й запобігає забрудненню лабораторних приміщень та зразків продуктами попередньої ПЛР.

У ПЛР у реальному часі результати виявляються за допомогою флуоресценції, що виникає внаслідок гібридизації флуорогенного ДНК-зонда зі специфічним фрагментом ДНК, ампліфікованим під час ПЛР. Структура флуорогенних ДНК-зондів побудована таким чином, що флуоресцентний маркер вивільняється в результаті ферментативної реакції або дистанціюється від молекули гасителя флуоресценції лише при специфічній гібридизації з потрібною молекулою ДНК, ампліфікованою під час ПЛР. Зі збільшенням кількості молекул, гібридизованих із зондом, збільшення флуоресценції до виявленого рівня пропорційне кількості молекул ампліфікованого продукту. Оскільки кількість молекул фрагмента ДНК подвоюється під час кожного циклу ПЛР, номер циклу, з якого виявляється та збільшується флуоресценція, обернено пропорційний кількості молекул ДНК у вихідному зразку. Якщо в реакцію ввести кілька різних відомих концентрацій молекул відповідного фрагмента ДНК мікобактерій туберкульозу як калібратор, то кількість геномів ДНК у досліджуваному матеріалі можна розрахувати за допомогою комп'ютерної програми.

Кожен стандартний зразок дублюється. Кількісним критерієм є мінімальна кількість циклів ПЛР, необхідна для початку та зростання виявленої флуоресценції. Вісь абсцис – кількість циклів; вісь ординат – значення флуоресценції. Концентрації ДНК обернено пропорційні кількості циклів, необхідних для появи флуоресценції. Вікна у правому стовпці (21-32) показують номери циклів для відповідних концентрацій. Різниця між 10-кратними концентраціями фрагментів ДНК 10² ^- 10⁶ ^мл становить 3,2-3,4 циклу. Для двох пацієнтів концентрації фрагментів IS6110 становили близько 10³ ^/ мл та ^10⁶ /мл. З урахуванням кількості повторів (6-20) аналізованих фрагментів у геномі Mycobacterium tuberculosis, кількість Mycobacterium tuberculosis у клінічних зразках становить близько 100 та 1000 клітин відповідно.

Застосування ПЛР у діагностиці туберкульозу

Метод ПЛР найбільше використовується для швидкої діагностики туберкульозу – виявлення Mycobacterium tuberculosis у клінічних зразках: мокротинні, бронхіальних змивах, плевральному ексудаті, сечі, спинномозковій рідині, пунктах остеолізу, аспіратах жіночих статевих шляхів та різних біоптатах. У дослідженні, проведеному в Голландії на близько 500 зразках мокротиння та бронхіальних змивів від 340 пацієнтів з підтвердженим діагнозом туберкульозу легень, було вивчено порівняльну чутливість методів ПЛР, посіву та мікроскопії мазка. Чутливість аналізу становила 92,6%, 88,9% та 52,4% відповідно. Специфічність усіх методів становила близько 99%.

Було проведено порівняння ефективності виявлення Mycobacterium tuberculosis за допомогою мікроскопії мазка, посіву на середовище Левенштейна-Йенсена, тест-системи VASTES та ПЛР-аналізу. ПЛР продемонструвала чутливість 74,4%, мікроскопії - 33,8%, посіву на тверде середовище - 48,9% та VASTES - 55,8%. Середній час виявлення за посіву на середовище Левенштейна-Йенсена становить 24 дні, VASTES - 13 днів, ПЛР - 1 день.

Також обговорюється потенціал використання ПЛР як чутливого та швидкого методу моніторингу ефективності лікування туберкульозу.

Виявлення ДНК Mycobacterium tuberculosis методом ПЛР при ефективній хіміотерапії визначається протягом тривалішого періоду часу – в середньому 1,7 місяця порівняно з бактеріовиділенням, визначеним за допомогою флуоресцентної мікроскопії, та 2,5 місяця порівняно з бактеріологічним дослідженням.

Діагностика позалегеневих форм туберкульозу

Значення ПЛР як чутливого методу особливо велике для позалегеневих форм, оскільки саме при цих формах клінічні та радіологічні методи та традиційні бактеріологічні методи визначення Mycobacterium tuberculosis у діагностичних матеріалах є неефективними.

При дослідженні зразків сечі результати ПЛР-аналізу були позитивними у 16 з 17 пацієнтів з активним туберкульозом сечовидільної системи та негативними у 4 пацієнтів з неактивним туберкульозом нирок та 39 пацієнтів з нетуберкульозними захворюваннями сечовидільної системи.

Було продемонстровано ефективність ПЛР-аналізу при дослідженні аспіратів кісткового мозку у пацієнтів з лихоманкою невідомого генезу з підозрою на туберкульозну природу захворювання. Для діагностики туберкульозного лімфаденіту у дітей було досліджено 102 пункційні аспірати та зразки біопсії 67 дітей з підозрою на туберкульозний лімфаденіт. Позитивні результати отримано: за допомогою ПЛР у реальному часі - 71,6%, флуоресцентної мікроскопії - 46,3%, культурального дослідження - 41,8%. При дослідженні 50 біоптатів лімфатичних вузлів у пацієнтів з хворобою котячої подряпини всі результати були негативними. Таким чином, було продемонстровано 100% специфічність ПЛР-аналізу. У цій же роботі було показано можливість виявлення M. avium при пункційній біопсії лімфатичних вузлів.

Діагностика туберкульозу жіночих статевих органів при безплідді, як відомо, є однією з найскладніших діагностичних проблем. Позитивні результати були отримані при ПЛР-дослідженні біоптатів ендометрія, аспіратів ендометрія та зразків рідини дугласової кишені у 14 (56%) з 25 пацієнток, обстежених лапароскопічно з підозрою на туберкульоз. Мікроскопія мазка та посів дали 1 та 2 позитивні результати відповідно. Ці випадки також були ПЛР-позитивними. Більшість ПЛР-позитивних результатів були у випадках з характерними ознаками туберкульозу за даними гістологічного дослідження; менша кількість - у випадках з підозрою на туберкульоз за даними лапароскопії. Лише один позитивний результат ПЛР був отриманий за відсутності лапароскопічних даних на туберкульоз.

При діагностиці позалегеневих форм туберкульозу у клініцистів часто виникає питання щодо можливості ідентифікації збудника при дослідженні зразків крові методом ПЛР. Дані літератури свідчать про те, що виявлення ДНК Mycobacterium tuberculosis із зразків крові можливе при запущених формах ВІЛ-інфекції. ДНК Mycobacterium tuberculosis була виявлена лише при генералізованому туберкульозі різних органів у пацієнтів з трансплантованою ниркою та імуносупресією.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Видова ідентифікація мікобактерій

Метод ПЛР може бути досить ефективним для швидкої ідентифікації мікобактерій туберкульозного комплексу та деяких видів нетуберкульозних мікобактерій після отримання їх первинного росту. У цьому випадку використання ПЛР дозволяє заощадити 7-10 днів, необхідних для подальшої культуральної ідентифікації позитивного результату. ПЛР-дослідження технічно дуже просте, оскільки не вимагає складної підготовки зразків клінічного матеріалу для досягнення високої чутливості. При дослідженні 80 позитивних культур у такій тест-системі (MB BacT. від Organon) всі позитивні результати ПЛР-аналізу були суворо специфічними та проводилися протягом 1 дня. Для ідентифікації інших видів мікобактерій при їх отриманні в культурі ДНК збудника гібридизують зі специфічними ДНК-зондами, міченими акридином, а штами виявляють за появою хемілюмінесценції за допомогою хемілюмінометра або на нітроцелюлозних смужках з візуальною оцінкою після гібридизації. Цей набір ідентифікує обмежену кількість видів: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii та M. gordonae.

А. Теленті та ін. також розробили відносно простий та недорогий метод видової ідентифікації клінічно важливих мікобактерій на основі ПЛР та подальшої обробки двома рестрикційними ферментами (ферментами, що мають здатність розрізати молекулу ДНК у певних точках). У цьому випадку ампліфікується фрагмент ДНК, що кодує білок теплового шоку (65 кДа), після чого отриманий у ПЛР фрагмент ДНК розміром 439 пар нуклеотидів обробляють окремо двома ферментами - Bste II та Нае III. Потім за допомогою електрофорезу в агарозному гелі аналізують два отримані продукти, визначаючи їх розміри (кількість пар нуклеотидів) за допомогою набору стандартних фрагментів ДНК (молекулярних ДНК-маркерів) довжиною від 100 до 1000 пар нуклеотидів. У кожному з визначених видів (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) для кожного рестрикційного ферменту виявляють 2 або 3 фрагменти ДНК різного розміру. Поєднання отриманих фрагментів ДНК різного розміру дозволяє диференціювати ці види один від одного.

Розробляється технологія біологічних ДНК-мікрочипів, яка допоможе ідентифікувати понад 100 видів мікобактерій за одне дослідження.

Ідентифікацію видів також можна проводити за допомогою ПЛР-ампліфікації варіабельної області 16S рРНК з подальшим секвенуванням ампліконів у порівнянні з відповідною первинною структурою, що дозволяє ідентифікувати понад 40 видів мікобактерій.

ПЛР також може бути використана для ідентифікації видів у комплексі мікобактерій туберкульозу, включаючи диференціацію між M. bovis та M. bovis BCG. Це робиться шляхом аналізу наявності або відсутності певних генів у геномних регіонах RD1, RD9 та RD10. RD1 відсутній у M. bovis BCG, але присутній у вірулентних видах, включаючи M. bovis.

Визначення чутливості Mycobacterium tuberculosis до ліків за допомогою ПЛР

Завдання молекулярно-генетичних методів визначення чутливості або резистентності Mycobacterium tuberculosis до ліків зводяться до виявлення мутацій у певних нуклеотидних послідовностях відомих генів. Основні методи базуються або на прямому зчитуванні (секвенуванні) цих послідовностей після ампліфікації, або на гібридизації біотин-мічених фрагментів ДНК, ампліфікованих під час ПЛР, з ДНК-зондами. Обидва варіанти передбачають виявлення замін у нуклеотидних послідовностях, які при використанні ДНК-зондів призводять до відсутності або неповної гібридизації на нітроцелюлозній мембрані за допомогою ферментного кон'югату (стрептавідин-лужна фосфатаза) - метод LIPA-Rif-TB.

Метод вимірювання флуоресценції в локально фіксованих ДНК-зондах на мікрорегіонах, комплементарних відомим мутаціям у ПЛР-ампліфікованих ділянках генів, відповідальних за чутливість або резистентність до ліків, називається методом мікробіочипів. Основний алгоритм проведення цього дослідження такий. Після виділення ДНК з клінічного зразка або культури мікобактерій необхідно провести ПЛР для ампліфікації відповідних фрагментів гена groB, відповідального за чутливість до рифампіцину, або генів katG та inhA, що кодують білки мікобактерій, відповідальні за чутливість до ізоніазиду. Результати ПЛР оцінюються за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, який підтверджує отримання відповідних фрагментів ДНК потрібної довжини. Потім проводиться 2-й раунд ПЛР для введення флуоресцентної мітки в ДНК. Результати ПЛР знову підтверджуються гель-електрофорезом. Після цього проводиться гібридизація (інкубація протягом ночі) з подальшим промиванням отриманого матеріалу на біочіпі, що являє собою велику кількість коротких ланцюгів ДНК (зондів), закріплених на невеликій скляній пластинці, комплементарних нуклеотидним послідовностям лікарсько-чутливого типу мікобактерій туберкульозу в точках можливих мутацій, а також мутантним послідовностям, відповідальним за лікарську стійкість. Розташування ДНК-зондів на пластині суворо визначено, і встановлюється рівень флуоресценції, що спостерігається під час гібридизації, для визначення результату за допомогою спеціального зчитувального пристрою. У зв'язку з цим результати аналізу визначаються за допомогою спеціальної комп'ютерної програми.

В останні роки були розроблені альтернативні методи визначення чутливості Mycobacterium tuberculosis до ліків на основі технології ПЛР у реальному часі, що дозволяє проводити ці дослідження в режимі закритої пробірки.

На рисунку 13-13 показано результат аналізу клінічних культур Mycobacterium tuberculosis при визначенні лікарської стійкості до рифампіцину за допомогою ПЛР у реальному часі: 218 - контрольний зразок (чутливий до рифампіцину); 93 - позитивний контроль на мутацію Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - позитивний контроль на мутацію Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - експериментальні зразки. Результат розрахунку кінетичних кривих ампліфікації для 4 каналів: канал 1: 393 - позитивний контроль на мутацію Ser-Trp TCG-TGG; канал 2: 4482 - позитивний контроль на мутацію Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - експериментальні зразки; канал 4: кінетичні криві ампліфікації всіх зразків, що беруть участь в експерименті. Позитивний контроль реакції ампліфікації. Висновки: Аналіз виявив такі мутації, що визначають стійкість до рифампіцину: у зразках 162, 163, 172, 295 – Ser-Leu TCG-TTG. Той самий принцип було використано для визначення лікарської стійкості до ізоніазиду за генами katG та inhA, які визначають найчастіші мутації.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Ідентифікація штаму Mycobacterium tuberculosis

Найбільш вивченим методом ідентифікації штамів Mycobacterium tuberculosis є технологія, що називається поліморфізмом довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), яка базується на фрагментації (рестрикції) ДНК Mycobacterium tuberculosis ферментом Pvu II та подальшій гібридизації отриманих фрагментів з певними специфічними послідовностями на ДНК її повторюваного елемента IS6110. Внутрішньовидова мінливість реалізується завдяки різній кількості повторів IS6110 та їх розташуванню на ДНК, а також різноманітності відстаней між певними точками атаки рестрикційного ферменту (сайтами рестрикції) та елементом IS6110. Ця технологія є дуже складною та трудомісткою. Після обробки ДНК, виділеної з культури мікобактерій туберкульозу, рестрикційним ферментом проводиться гель-електрофорез, потім фрагменти ДНК різної довжини переносяться на нітроцелюлозну мембрану, гібридизуються з фрагментами елемента IS6110, і результати виявляються за допомогою ферментативної реакції. Отриманий специфічний смуговий малюнок характеризує ДНК конкретного штаму мікобактерій туберкульозу. Комп'ютерний аналіз виявляє ідентичність або спорідненість штамів. Незважаючи на те, що метод ПДРФ є найбільш дискримінаційним, тобто виявляє найбільшу кількість відмінностей у аналізованих штамах, він неефективний при невеликій кількості (менше 5) повторів IS6110, що спостерігається у деяких штамів. На рисунках 13-14 показано результати ПДРФ-типування штамів.

Альтернативою може бути метод споліготипування – аналіз поліморфізму спейсерних послідовностей ДНК – проміжних між прямими повторами DR-області. При проведенні споліготипування штамів ПЛР проводиться з праймерами, що обмежують DR-область, після чого утворюються фрагменти різної довжини, які гібридизуються з варіабельними проміжними ділянками ДНК. Аналіз спейсерних послідовностей DR-області видається, на думку дослідників, простішим, продуктивнішим та придатнішим для первинного скринінгу штамів та попереднього епідеміологічного аналізу, а також для вивчення безпосередньо клінічного матеріалу.

Очевидно, що більш ефективним та технологічно доступним методом є VNTR (скорочення від англійських слів), або метод визначення змінної кількості точних тандемних повторів у ДНК мікобактерій туберкульозу. Цей метод базується лише на використанні ПЛР і не потребує додаткових маніпуляцій. Оскільки кількість тандемних повторів у різних штамах і в різних локусах різна, на отриманій електрофореграмі продуктів ПЛР визначаються та аналізуються фрагменти різного розміру. За словами дослідників, за допомогою VNTR досягається більший ступінь дискримінації штамів, ніж за допомогою методу RFLP.

В останні роки багато уваги приділяється поширенню штамів Mycobacterium tuberculosis родини W-Beijing (іноді їх називають штамом Beijing), які значною мірою стійкі до ліків.

Основні вимоги до якості молекулярно-біологічних досліджень

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Основні нормативні документи для проведення ПЛР

Накази Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації: № 45 від 7.02.2000; № 109 від 21.03.2003; № 64 від 21.02.2000. Методичні вказівки: 1.3.1888-04 "Організація роботи під час ПЛР-дослідження матеріалу, інфікованого патогенними біологічними агентами III-IV груп патогенності"; 1.3.1794-03 "Організація роботи під час ПЛР-дослідження матеріалу, інфікованого мікроорганізмами I-II груп патогенності". 2003; 3.5.5.1034-01 "Дезінфекція досліджуваного матеріалу, інфікованого бактеріями I-IV груп патогенності, при роботі методом ПЛР", 2001. Додаток 11 до Інструкції з уніфікованих методів мікробіологічних досліджень при виявленні, діагностиці та лікуванні туберкульозу.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Персонал

Молекулярно-біологічні дослідження можуть проводити лікарі-клініко-лаборантки, бактеріологи, вірусологи, біологи-клініко-діагностичні лаборантки, а також спеціалісти із середньою медичною освітою, які пройшли спеціалізацію та підвищення кваліфікації у встановленому порядку.

Облаштування лабораторного приміщення

Необхідне наступне лабораторне обладнання:

• Зона обробки зразків – лабораторія, пристосована для роботи з збудниками інфекцій III-IV груп патогенності, відповідно до Методичних вказівок 13.1888-04.
• Зона для приготування реакційних сумішей для ПЛР – це лабораторне приміщення, яке забезпечує захист від внутрішнього лабораторного забруднення – «чиста» зона.
• • Якщо для аналізу продуктів ПЛР використовується електрофорез або гібридизація, лабораторне приміщення, в якому ампліфіковані фрагменти ДНК екстрагуються з ампліфікаційної пробірки та, відповідно, можуть потрапляти в навколишнє середовище, відповідно до вимог до лабораторій ПЛР (Методичні вказівки 1.3.1794-03, Методичні вказівки 1.3.1888-04), має бути повністю ізольоване від приміщень, зазначених у попередніх пунктах. Переміщення будь-якого персоналу, обладнання, будь-яких матеріалів та предметів із зони електрофорезу до зони обробки зразків та «чистої» зони, а також перенесення повітря через вентиляційну систему або внаслідок протягів, має бути виключено. Ця зона не є обов'язковою для флуориметричного виявлення продуктів ПЛР.
• Кімната для документування та обробки результатів обладнана комп'ютерами та необхідним офісним обладнанням. У цій кімнаті може бути обладнання, яке забезпечує виявлення продуктів ПЛР без відкриття пробірки. - флуоресцентні детектори ПЛР та термоциклери для ПЛР у реальному часі.

Санітарно-епідеміологічні вимоги до первинної обробки мокротиння аналогічні стандартним мікробіологічним вимогам до роботи з мікобактеріями туберкульозу.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Повний комплект лабораторного обладнання для ПЛР-діагностики

Лабораторний комплект включає обладнання для наступних кімнат.

• кімната для підготовки зразків, містить наступне обладнання: ламінарний витяжний шкаф II класу захисту "СП-1.2"; твердотільний термостат з кришкою, що підігрівається, для пробірок Eppendorf; мікроцентрифуга на 13 000 об/хв; центрифуга ("Vortex"); холодильник з діапазоном температур від -20 ^° C до +10 ^° C; піпетки змінного об'єму серії "Proline"; насос з колбою-пасткою ОМ-1; штатив для піпеток; штатив для робочої станції 200x0,5 мл; штатив для робочої станції 50x1,5 мл; штативи для зберігання пробірок 80x1,5 мл;
• кімната для підготовки реакційної суміші: захисна камера ПЛР-бокс («Laminar-C. 110 см); центрифуга «Vortex»; піпетки змінного об'єму серії «Proline»; штатив для піпеток; штатив для робочої станції 200x0,2 мл; штативи для зберігання пробірок 80x1,5 мл; холодильник з температурним діапазоном від -20 ^° C до +10 ^° C;
• Кімната для електрофорезу: горизонтальна камера для електрофорезу; джерело живлення; трансілюмінатор;
• ДНК-підсилювач або аналізатор нуклеїнових кислот (ПЛР у реальному часі) з комп'ютером та програмним забезпеченням; можна розмістити в будь-якій доступній кімнаті. Якщо використовується технологія ПЛР у реальному часі, кімната для електрофорезу не потрібна.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Зовнішній контроль якості

Щоб забезпечити отримання об'єктивно достовірних результатів, лабораторії повинні брати участь у системі зовнішньої оцінки якості лабораторних досліджень.

Учасники системи контролю якості отримують: 12 ампул з ліофілізованими суспензіями бактеріальних клітин, дві з яких містять кишкову паличку, 3 ампули з мікобактеріями туберкульозу (авірулентний штам) у концентрації 10² ^/ мл; 3 ампули з клітинами аналогічного штаму у концентрації 10² ^/ мл; по 2 ампули з нетуберкульозними мікобактеріями M. avium-intracellulare та M. kansasii у концентрації 10³ ^/ мл.

Тести, що надсилаються на зовнішню оцінку якості, попередньо перевіряються у двох незалежних лабораторіях, які мають великий досвід у цій галузі.

[ 85 ], [ 86 ]