Молекулярно-генетичні методи діагностика спадкових захворювань

Методи ДНК-технології використовуються для визначення локалізації мутантного гена в певній хромосомі, відповідального за виникнення певних форм спадкової патології. Оскільки ген – це ділянка ДНК, а генна мутація – це пошкодження первинної структури ДНК (під мутацією розуміють усі зміни в послідовності ДНК, незалежно від їх локалізації та впливу на життєздатність особини), то, зондуючи препарати метафазних хромосом пацієнта зі спадковим захворюванням, можна встановити локалізацію патологічного гена. Молекулярно-генетичні методи створюють можливості для діагностики захворювань на рівні зміненої структури ДНК, вони дозволяють визначити локалізацію спадкових порушень. Молекулярно-генетичні методи можуть ідентифікувати мутації, пов'язані із заміною навіть однієї окремої основи.

Найважливішим етапом ідентифікації гена є його виділення. ДНК можна виділити з будь-якого типу тканин і клітин, що містять ядра. Етапи виділення ДНК включають: швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран центрифугуванням, ферментативне руйнування білків та їх екстракцію з розчину за допомогою фенолу та хлороформу, концентрування молекул ДНК шляхом осадження в етанолі.

У генетичних лабораторіях ДНК найчастіше виділяють з лейкоцитів крові, для чого у пацієнта забирають 5-20 мл венозної крові у стерильну пробірку з розчином антикоагулянту (гепарину). Потім лейкоцити відокремлюють та обробляють згідно з вищезазначеними кроками.

Наступний етап підготовки матеріалу до дослідження – це «розрізання» ДНК на фрагменти в ділянках зі строго певною послідовністю основ, яке здійснюється за допомогою бактеріальних ферментів – рестрикційних ендонуклеаз (рестрикційних ферментів). Рестрикційні ферменти розпізнають специфічні послідовності з 4-6, рідше 8-12 нуклеотидів у дволанцюговій молекулі ДНК та розділяють її на фрагменти в місцях розташування цих послідовностей, які називаються сайтами рестрикції. Кількість отриманих рестрикційних фрагментів ДНК визначається частотою зустрічальності сайтів рестрикції, а розмір фрагментів – характером розподілу цих сайтів по довжині вихідної молекули ДНК. Чим частіше розташовані сайти рестрикції, тим коротші фрагменти ДНК після рестрикції. Наразі відомо понад 500 різних типів рестрикційних ферментів бактеріального походження, і кожен з цих ферментів розпізнає свою специфічну нуклеотидну послідовність. У майбутньому сайти рестрикції можуть бути використані як генетичні маркери ДНК. Фрагменти ДНК, що утворюються в результаті рестрикції, можна впорядкувати за довжиною за допомогою електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі, і таким чином визначити їх молекулярну масу. Зазвичай ДНК у гелі ідентифікують за допомогою специфічного забарвлення (зазвичай бромистим етидієм) та перегляду гелю в прохідному ультрафіолетовому світлі. Місця локалізації ДНК забарвлюються в червоний колір. Однак у людини при обробці ДНК кількома рестрикційними ферментами утворюється так багато фрагментів різної довжини, що їх неможливо розділити за допомогою електрофорезу, тобто візуально ідентифікувати окремі фрагменти ДНК на електрофорезі неможливо (отримується рівномірне забарвлення по всій довжині гелю). Тому для ідентифікації потрібних фрагментів ДНК у такому гелі використовується метод гібридизації з міченими ДНК-зондами.

Будь-який одноланцюговий сегмент ДНК або РНК здатний зв'язуватися (гібридизуватися) з комплементарним ланцюгом, причому гуанін завжди зв'язується з цитозином, а аденін - з тиміном. Так утворюється дволанцюгова молекула. Якщо одноланцюгову копію клонованого гена позначити радіоактивною міткою, отримують зонд. Зонд здатний знаходити комплементарний сегмент ДНК, який потім легко ідентифікувати за допомогою авторадиографії. Радіоактивний зонд, доданий до препарату розтягнутих хромосом, дозволяє локалізувати ген на певній хромосомі: за допомогою ДНК-зонда можна ідентифікувати специфічні ділянки під час Саузерн-блоттингу. Гібридизація відбувається, якщо досліджувана ділянка ДНК містить нормальний ген. У випадку, коли присутня аномальна нуклеотидна послідовність, тобто відповідні структури хромосом містять мутантний ген, гібридизація не відбудеться, що дозволяє визначити локалізацію патологічного гена.

Для отримання ДНК-зондів використовується метод клонування генів. Суть методу полягає в тому, що фрагмент ДНК, що відповідає гену або ділянці гена, вставляється в клонуючу частинку, зазвичай це бактеріальна плазміда (кільцева позахромосомна ДНК, присутня в бактеріальних клітинах і несе гени стійкості до антибіотиків), а потім розмножуються бактерії з плазмідою зі вставленим людським геном. Завдяки процесам синтезу в плазміді можна отримати мільярди копій людського гена або його ділянки.

Отримані копії ДНК, мічені радіоактивною міткою або флуорохромами, потім використовуються як зонди для пошуку комплементарних послідовностей серед досліджуваного пулу молекул ДНК.

Наразі існує багато різних методів, що використовують ДНК-зонди для діагностики генних мутацій.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]