Причини туберкульозу

Родина Mycobacteriaceae порядку Actinomycetales містить єдиний рід Mycobacterium. У 1975 році цей рід містив близько 30 видів, а до 2000 року це число вже наближалося до 100. Більшість видів мікобактерій класифікуються як сапрофітні мікроорганізми, широко поширені в навколишньому середовищі.

Група облігатних паразитів незначна, але її практичне значення велике і визначається видами, що викликають туберкульоз у людей і тварин. Існує думка, що попередниками патогенних для людини мікобактерій були давні ґрунтові мікобактерії.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Таксономія мікобактерій

Усі мікобактерії поділяються на патогенні для людини та умовно-патогенні.

У клінічній мікробіології використовується кілька підходів для класифікації мікобактерій:

• за швидкістю та оптимальною температурою росту, здатністю утворювати пігмент;
• для клінічно значущих комплексів.

Види мікобактерій, що викликають туберкульоз, об'єднані в комплекс M. tuberculosis, який включає M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii. Нещодавно до нього були додані M. pinnipedii та M. sarrae, які філогенетично споріднені з M. microti та M. bovis.

Решта мікобактерій, що викликають різні мікобактеріози, класифікуються як нетуберкульозні мікобактерії. З цієї групи виділяють такі комплекси: M. avium, що складається з M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M.fortuitum, включаючи підвиди M.fortuitum та M. chelonae, та M. terrae, включаючи M. terrae, M. triviale та M. nonchromogenicum. Найважливішими групами є збудник прокази M. leprae, а також збудник виразкових уражень бурулі M. ulcerans.

Ця класифікація об'єднує види мікобактерій з однаковим клінічним значенням, коли їхня тонка диференціація не є суттєвою. Для ідентифікації видів у межах груп і комплексів використовуються біологічні, біохімічні та молекулярні методи.

Класифікацію нетуберкульозних мікобактерій, засновану на культурних відмінностях, розробив Руньон у 1959 році. Згідно з нею, виділяють 4 групи мікобактерій.

Група I – фотохромогенні мікобактерії

До цієї групи належать мікобактерії, які не пігментуються при вирощуванні в темряві, але набувають яскраво-жовтої або жовто-помаранчевої пігментації після впливу світла. Потенційно патогенними штамами, що належать до цієї групи, є M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Серед мікобактерій цієї групи є як швидкозростаючі (M. marinum), так і повільнозростаючі (M. asiaticum, M. kansasii). Оптимальна температура росту варіюється від 25 ^° C для M. simiae, 32-33 ^° C для M. marinum до 37 ^° C для M. asiaticum.

Найбільш клінічно значущим видом у нашій країні є M. kansasii, який зустрічається у водоймах. Штам M. kansasii (M. luciflavum) викликає захворювання у людей. Він росте в яєчному середовищі у вигляді шорстких або гладких колоній, з температурним оптимумом 37 ^° C. Морфологічно бактерії мають помірну довжину. На сьогодні описано два варіанти M. kansasii: помаранчевий та білий. При введенні морським свинкам M. kansasii викликає інфільтрати та ущільнення регіональних лімфатичних вузлів.

II група – скотохромогенні мікобактерії (від грецького слова scotos – темрява)

До цієї групи належать мікобактерії, що утворюють пігмент у темряві. Швидкість росту становить 30-60 днів. До цієї групи належать M. aquae (M. gordonae) та M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum вважається потенційно патогенним видом. На яєчному середовищі бактерії цього виду ростуть у вигляді гладких або шорстких колоній оранжевого кольору. Морфологічно мікобактерії мають паличкоподібну форму, короткі або довгі. Вони ростуть за температури 25-37 ^o C. У дітей вони викликають ураження лімфатичних вузлів та легень.

M. aquae (M. gordonae) класифікуються як сапрофітні скотохромогенні мікобактерії. Вони ростуть у яєчному середовищі у вигляді помаранчевих колоній за температури 25-37 °C. Морфологічно мікобактерії мають паличкоподібну форму та помірну довжину (>5 мкм). Вони зустрічаються у водоймах.

Група III – нефотохромогенні мікобактерії

До цієї групи належать мікобактерії, які не утворюють пігменту або мають блідо-жовте забарвлення, яке не посилюється на світлі. Вони ростуть протягом 2-3 або 5-6 тижнів. До них належать: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (птахині мікобактерії) ростуть на середовищі Левенштейна-Єнсена у вигляді пігментованих або слабопігментованих колоній при 37 ^° C та 45 ^° C. Морфологічно це палички середньої довжини. Вони можуть бути патогенними для людини та ряду лабораторних і домашніх тварин (наприклад, свиней). Зустрічаються у воді та ґрунті.

M. xenopi виділено з жаби. Молоді культури ростуть у вигляді непігментованих колоній. Пізніше з'являється жовтий пігмент. Морфологічно це довгі ниткоподібні палички. Вони ростуть за температури 40-45 ^o C. Є умовно патогенними для людини.

M. terrae вперше були виділені з редьки. Вони ростуть на середовищі Левенштейна-Єнсена та у вигляді безпігментних колоній. Оптимальна температура росту становить 37 ^° C. Морфологічно вони представлені паличками помірної довжини, сапрофітами.

Група IV – швидкозростаючі мікобактерії

Мікобактерії, що належать до цієї групи, характеризуються швидким ростом (до 7-10 днів). Вони ростуть у вигляді пігментованих або непігментованих колоній, частіше у вигляді R-форми. Гарний ріст дається протягом 2-5 днів при температурі 25 ^o C. До цієї групи належать потенційно патогенні мікобактерії M.fortuitum, а також сапрофітні мікобактерії, такі як M. phlei, M. smegmatis та ін. M. fortuitum дає видимий ріст на яєчному середовищі на 2-4-й день у вигляді «розетки». Морфологічно мікобактерії представлені короткими паличками. На середовищі Левенштейна-Йенсена вони можуть поглинати малахітовий зелений колір і зеленіти. Вони широко поширені в природі.

Класифікація Раньйона виявилася дуже зручною для ідентифікації найпоширеніших типів мікобактерій. Однак відкриття нових видів та поява все більшої кількості проміжних форм мікобактерій викликає труднощі з їх реєстрацією в тій чи іншій групі Раньйона.

M. tuberculosis – це молоде еволюційне утворення. Останнім часом спостерігається тенденція до поділу M. tuberculosis на кластери або родини. Найважливішими штамами є ті, що належать до родини Beijing, які вирізняються клональною поведінкою та здатністю викликати мікроспалахи туберкульозу.

Морфологія мікобактерій

Мікобактерії – це тонкі паличкоподібні клітини з характерною властивістю кислото- та спиртостійкості (на одній зі стадій росту), аеробні. При забарвленні за Грамом вони слабо грампозитивні. Мікобактерії нерухомі, не утворюють спор. Конідії або капсули відсутні. На щільних поживних середовищах вони ростуть повільно або дуже повільно: за оптимальної температури видимі колонії з'являються через 2-60 днів. Колонії рожеві, помаранчеві або жовті, особливо при вирощуванні на світлі. Пігмент не дифундує. Поверхня колоній зазвичай матова (S-тип) або шорстка (R-тип). Мікобактерії часто ростуть у вигляді слизових або зморшкуватих колоній. На рідких середовищах мікобактерії ростуть на поверхні. Ніжна суха плівка з часом потовщується, стає горбисто-зморшкуватою та набуває жовтуватого відтінку. Бульйон залишається прозорим, і дифузний ріст може бути досягнутий у присутності мийних засобів. У мікроколоніях M. tuberculosis (тобто на ранніх стадіях) утворюються структури, що нагадують тяжі – особливість, яка пов'язана з фактором тяжів.

При забарвленні карболовим фуксином мікобактерії туберкульозу виглядають як тонкі, злегка вигнуті палички малиново-червоного кольору, що містять різну кількість гранул.

Довжина мікобактерій становить приблизно 1-10 мкм, а ширина – 0,2-0,7 мкм. Іноді можуть зустрічатися вигнуті або скручені варіанти. Мікроорганізми, розташовані поодинці, парами або групами, добре виділяються на синьому фоні інших компонентів препарату. Бактеріальні клітини часто можуть бути розташовані у формі римської цифри «V».

Препарат також може виявити змінені кокоїдно-кислотостійкі форми збудника, округлі сферичні або міцеліоподібні структури. У цьому випадку позитивну відповідь необхідно підтвердити додатковими методами.

Будова клітинної стінки мікобактерій

Клітинна стінка мікобактерій є найскладнішою порівняно з іншими прокаріотами.

У той час як грамнегативні бактерії мають дві мембрани, клітинна стінка мікобактерій складається з кількох шарів, деякі з яких містять цукри та характеризуються відносно постійним складом. Зовнішні шари мають змінний хімічний склад і представлені переважно ліпідами, більшість з яких є міколовими кислотами та їх похідними. Як правило, ці шари не видно під електронною мікроскопією. Первинним каркасом клітинної стінки є зшиті пептидні глікани - електроннощільний шар. Шар арабіногалактану повторює шар пептидглікану, утворюючи полісахаридну строму клітинної стінки. Він має точки з'єднання з шаром пептидглікану та структури для приєднання міколових кислот та їх похідних.

Міколові кислоти присутні у формі вільних сульфоліпідів та кордового фактора, наявність яких на поверхні клітин пов'язана з характерним формуванням колоній M. tuberculosis у вигляді джгутиків. Унікальність та ключова роль міколових кислот у структурній організації та фізіології мікобактерій роблять їх чудовою мішенню для етіотропної терапії.

Гліколіпідний шар називається «мікозидами» і іноді порівнюється з мікрокапсулою. Мікозиди структурно та функціонально подібні до ліпополісахаридів зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій, але їм бракує їхньої агресивності; тим не менш, вони токсичні та (як і корд-фактор та сульфоліпіди) викликають утворення гранульом.

Клітинна мембрана та шари клітинної стінки пронизані каналами або порами, серед яких можна виділити пасивні пори з коротким часом життя, що забезпечують контрольовану дифузію речовин, та канали з довшим часом життя, що забезпечують енергозалежний транспорт речовин.

Іншим компонентом клітинної стінки мікобактерій є ліпоарабіноманан. Він закріплений на плазматичній мембрані, проникає через клітинну стінку та виходить на її поверхню. У цьому відношенні він подібний до ліпотейхоєвих кислот грампозитивних бактерій або ліпополісахаридного О-антигену грамнегативних бактерій. Кінцеві фрагменти ліпоарабіноманану, насамперед його манозні радикали, неспецифічно пригнічують активацію Т-лімфоцитів та лейкоцитів у периферичній крові. Це призводить до порушення імунної відповіді на мікобактерії.

Мінливість та форми існування мікобактерій

Персистенція бактерій має особливе патогенетичне значення. Лабораторні експерименти, проведені in vitro та in vivo, показали, що бактерицидні препарати ізоніазид та піразинамід знищують мікобактерії лише у фазі розмноження. Якщо мікобактерії знаходяться у фазі низької метаболічної активності (тобто ріст бактерій майже повністю призупинений і бактерії можна назвати «сплячими»), бактерицидні препарати на них не впливають. Такий стан зазвичай називають латентним, а самі мікроорганізми – персистерами. Персистери не чутливі до хіміотерапевтичних препаратів, тобто поводяться як резистентні мікроорганізми. Фактично, вони можуть зберігати чутливість до ліків.

Потужним стимулом для переходу мікобактеріальних клітин у стан спокою є хіміотерапевтичні препарати, а також фактори імунної системи хазяїна. Персистери здатні залишатися в осередках ураження місяцями або навіть роками. Під час персистенції мікобактерії можуть трансформуватися в L-форми. У цій формі мікобактерії проявляють надзвичайно низьку метаболічну активність, спрямовану, перш за все, на збільшення товщини клітинної стінки та позаклітинного матриксу, що перешкоджає простій дифузії речовин. Крім того, мікобактерії накопичують генетичний матеріал, що підвищує ймовірність відтворення нормально функціонуючої клітини за настання сприятливих умов. Виявлення L-форм стандартними мікробіологічними методами є складним.

Якщо сплячі мікобактерії відновлюють метаболічну активність і починають розмножуватися під час хіміотерапії, вони швидко гинуть. Якщо хіміотерапію завершити, такі «відроджені» мікобактерії продовжують розмножуватися та спричиняють рецидив захворювання. Це пояснює виправданість тривалих курсів хіміотерапії та використання наступних коротких профілактичних, зазвичай сезонних, курсів хіміопрофілактики.

Фізіологія мікобактерій

У царстві прокаріотів мікобактерії є беззаперечними лідерами в галузі синтезу складних органічних сполук. Вони, ймовірно, мають найгнучкіший метаболізм, що забезпечує необхідну мінливість для виживання як у зовнішньому середовищі, так і в макроорганізмі. На сьогодні описано понад 100 ферментативних реакцій, що показують розгалужену та складну природу метаболізму мікобактерій. Для синтезу кінцевих сполук або забезпечення необхідних фізіологічних функцій у мікобактерій можуть здійснюватися паралельні метаболічні шляхи залежно від доступності субстрату, хімічного середовища, забезпечення дихальних циклів необхідними компонентами (іони металів, парціальний тиск кисню, вуглекислого газу тощо).

Біохімічні властивості мікобактерій

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Ліпідний метаболізм

Ліпіди клітинної стінки, які становлять до 60% сухої маси клітини, визначають нестандартні тинкторіальні, фізіологічні та екологічні властивості мікобактерій.

Специфічні ліпіди мікобактерій, описані на сьогоднішній день, поділяються на 7 основних груп за структурними особливостями:

1. похідні жирних кислот вуглеводів (головним чином трегалоза - корд-фактор):
2. фосфатидилміоїнозитолманозиди:
3. похідні жирних кислот пептидів;
4. N-ацилпептидні глікозиди - мікозиди C;
5. ефіри жирних кислот фтіоцеролів;
6. мікозиди A, B. G;
7. гліцеринові міколати.

Ліпіди груп 4-6 містяться лише в мікобактеріях.

Серед унікальних варто відзначити туберкулостеаринову та туберкулопальмітинову кислоти, які є попередниками міколових кислот.

Міколові кислоти – це група високомолекулярних жирних кислот з довжиною ланцюга до 84 атомів вуглецю, структура основного ланцюга яких визначається систематичним положенням мікроорганізму та умовами його росту. Їх низька реакційна здатність забезпечує високу хімічну стійкість клітинної стінки мікобактерій. Міколати пригнічують ферментативне розщеплення клітинної стінки та вільнорадикальні реакції.

Корд-фактор класифікується як ліпідна група 1. Він пов'язаний з високою токсичністю мікобактерій та вірулентністю.

Поверхнево-активні ліпіди, або сульфоліпіди, відіграють важливу роль у внутрішньоклітинній адаптації мікобактерій. Разом з кордовим фактором вони утворюють цитотоксичні мембранотропні комплекси.

Ліпоарабіноманнан — це гетерогенна суміш високомолекулярних ліпополісахаридів: розгалужених полімерів арабінози та манози з діацилгліцериновими похідними пальмітинової та туберкулостеаринової кислот.

Мікозиди C – це пептидні гліколіпіди, що утворюють зовнішню мембрану мікобактерій, яку можна спостерігати під електронною мікроскопією як прозору зону на периферії клітин. Мікозиди – це видоспецифічні сполуки. Антигенні властивості мікобактерій залежать від їхнього типу.

Кількісний та якісний склад ліпідних сполук мікобактерій є динамічним і залежить від віку клітин, складу поживних середовищ та фізико-хімічних характеристик середовища. Молоді мікобактеріальні клітини починають формувати клітинну стінку, синтезуючи ліпополісахариди з відносно короткими аліфатичними ланцюгами. На цьому етапі вони досить вразливі та доступні для імунної системи. У міру зростання клітинної стінки та утворення високомолекулярних ліпідів мікобактерії набувають стійкості та байдужості у своїй взаємодії з імунною системою.

Вуглеводний обмін

Найбільш бажаним джерелом вуглецю для мікобактерій є гліцерин.

Найважливішими вуглеводами є арабіноза, маноза та мальтоза, які складають більше половини всіх сахаридів. Крім того, трегалоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, рамноза та деякі інші сахариди відіграють певну роль у життєдіяльності клітини. У цьому випадку синтез відбувається за гідролазним та альдолазним шляхами. Піруватний шлях використовується для синтезу глікогену. Арабіноза та маноза беруть участь в утворенні важливих структурних сполук. Пентозофосфатний шлях окислення глюкози використовується для отримання енергії. Він забезпечується ферментами малат-, ізоцитрат- та сукцинатдегідрогеназами, що надає гнучкості дихальній системі.

Гліоксилатний шлях, який мікобактерії використовують для включення вільних жирних кислот, що накопичуються під час росту мікобактерій, у цикл трикарбонових кислот, є унікальним. Цей цикл привернув увагу дослідників як можливий механізм хемотаксису мікобактерій під час персистенції.

Метаболізм азоту та амінокислот

Швидкість використання нітратів, нітритів та гідроксиламінів мікобактеріями може бути використана для ідентифікації видів. Мікобактерії віддають перевагу аспарагіну як джерелу азоту. Синтез амінокислот є енергозалежним процесом і забезпечується групою ферментів, які дозволяють використовувати інші амінокислотні сполуки, такі як глутамат.

Активність нітрит- та нітратредуктази

Мікобактерії туберкульозу можуть утворювати аденозинтрифосфат (АТФ), переносячи електрони вздовж ланцюга носіїв, що закінчуються на NO3 _, а не на O2 _. Ці реакції відновлюють NO3 _до NH3 _у кількостях, необхідних для синтезу амінокислот, пуринових та піримідинових основ. Це досягається завдяки послідовній дії нітрат- та нітритредуктаз.

Активність каталази та пероксидази

Каталаза запобігає накопиченню перекису водню, який утворюється під час аеробного окислення відновлених флавопротеїнів. Активність ферменту залежить від pH середовища та температури. За температури 56 °C каталаза не активна. Існують тести на приналежність до патогенного комплексу мікобактерій, засновані на термолабільності каталази.

Відомо, що 70% штамів Mycobacterium tuberculosis, стійких до ізоніазиду, втрачають свою каталазну та пероксидазну активність.

Пероксидазна та каталазна активність здійснюється одним і тим самим ферментним комплексом.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Вітаміни та коферменти

M. tuberculosis містить вітаміни групи В (рибофлавін, піридоксин, ціанокобаламін, тіамін), вітаміни С і К, параамінобензойну кислоту, пантотенову та нікотинову кислоти, біотин та фолієву кислоту.

Метаболізм, живлення та дихання мікобактерій

У нормальних, сприятливих умовах мікобактерії туберкульозу є строгими аеробами та мезофілами, тобто вони ростуть за наявності кисню та в діапазоні температур 30-42 ^o C, найкраще при 37 ^o C. За несприятливих зовнішніх умов та/або дефіциту кисню мікобактерії туберкульозу проявляють себе як мікроаерофіли та навіть як анаероби. При цьому їхній метаболізм зазнає значних змін.

_{За споживанням кисню та розвитком оксидазних систем мікобактерії подібні до справжніх грибів. Вітамін К9} служить сполучною ланкою між НАДН-дегідрогеназою та цитохромом b у системі переносу роду Mycobacterium. Ця цитохромна система нагадує мітохондріальну. Вона чутлива до динітрофенолу, як і у вищих організмів.

Описаний тип дихання не є єдиним джерелом утворення АТФ. Окрім О2 кінцевих, мікобактерії можуть використовувати дихальні ланцюги, що переносять електрони та закінчуються нітратами (NO3- ₎^. Резервом дихальної системи мікобактерій є гліоксилатний цикл.

Аноксичне (ендогенне) дихання, яке відбувається в атмосфері з концентрацією кисню менше 1%, стимулюється азидними сполуками, які зменшують окислення пірувату або трегалози.

Ріст і розмноження мікобактерій

Мікобактерії туберкульозу розмножуються надзвичайно повільно: період подвоєння становить 18-24 години (нормальні бактерії діляться кожні 15 хвилин). Тому для отримання видимого росту типових колоній потрібно щонайменше 4-6 тижнів. Однією з причин повільного розмноження мікобактерій вважається їхня виражена гідрофобність, що ускладнює дифузію поживних речовин. Більш імовірно, що це генетично обумовлено та пов'язано з більш складною структурою мікобактерій. Відомо, наприклад, що більшість бактерій мають кілька копій оперону рибосомної рибонуклеїнової кислоти (рРНК). Повільно зростаючі мікобактерії (M. tuberculosis, M. leprae) мають одну копію оперону, а швидкозростаючі (M. smegmatis) - лише дві копії.

При культивуванні в рідких середовищах мікобактерії ростуть на поверхні. Ніжна суха плівка з часом потовщується, стає горбистою та зморшкуватою, набуває жовтуватого відтінку, який часто порівнюють з кольором слонової кістки. Бульйон залишається прозорим, а дифузний ріст може бути досягнутий лише за наявності детергентів, таких як Tween-80. У мікроколоніях (тобто на ранніх стадіях) утворюються структури, що нагадують пучки, – особливість, пов’язана з фактором шнура M. tuberculosis.

Генетика мікобактерій

Рід Mycobacterium генетично дуже різноманітний. На відміну від багатьох сапрофітних та нетуберкульозних мікобактерій, Mycobacterium tuberculosis не містить позахромосомних включень (наприклад, плазмід). Усе різноманіття властивостей Mycobacterium tuberculosis визначається її хромосомою.

Геном комплексу M. tuberculosis надзвичайно консервативний. Його представники мають гомологію ДНК на рівні 85-100%, тоді як ДНК інших видів мікобактерій гомологічна M. tuberculosis лише на 4-26%.

Представники роду Mycobacteria мають великі геноми порівняно з іншими прокаріотами – 3,1-4,5x10⁻⁹ ^Да. Однак геноми патогенних видів менші, ніж у інших мікобактерій (у M. tuberculosis – 2,5x10⁻⁹ ^Да ). Класичний збудник туберкульозу людини, M. tuberculosis, має більше генів, ніж M. africanum та M. bovis, які втратили частину свого генетичного матеріалу в процесі еволюції.

У 1998 році було опубліковано нуклеотидну послідовність хромосоми штаму H37Rv M. tuberculosis. Її довжина становить 4 411 529 пар основ. Хромосома мікобактерії туберкульозу має кільцеву структуру. Вона містить близько 4000 генів, що кодують білки, а також 60 кодуючих функціональних компонентів РНК: унікальний рибосомний РНК-оперон, 10Sa РНК, що бере участь у деградації білків з атиповою матричною РНК, 45 транспортних РНК (тРНК), понад 90 ліпопротеїнів.

Більше 20% геному зайнято генами метаболізму жирних кислот клітинної стінки, включаючи міколові кислоти, багаті на гліцин кислотні поліпептиди (родини PE та PPE), що кодуються поліморфними ділянками геному PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) та MPTR (Major polymorphic tandem repeat) відповідно (п'яте та четверте кільця геномної карти хромосом). Мінливість цих ділянок геному забезпечує відмінності в антигенах та здатність пригнічувати імунну відповідь. Геном Mycobacterium tuberculosis широко містить гени, що контролюють фактори вірулентності.

Mycobacterium tuberculosis синтезує всі компоненти, необхідні для метаболізму: незамінні амінокислоти, вітаміни, ферменти та кофактори. Порівняно з іншими видами бактерій, M. tuberculosis має підвищену активність ферментів ліпогенезу. Два гени кодують гемоглобіноподібні білки, які діють як антиоксидантні захисники або пастки для надлишку клітинного кисню. Ці особливості сприяють швидкій адаптації Mycobacterium tuberculosis до різких змін умов навколишнього середовища.

Відмінною особливістю геному комплексу M. tuberculosis є велика кількість повторюваних послідовностей ДНК. Так, хромосома M. tuberculosis H37Rv містить до 56 копій IS-елементів (інсерційних послідовностей), які забезпечують поліморфізм ДНК Mycobacterium tuberculosis. Більшість з них, за винятком елемента IS6110, незмінні. Хромосоми різних штамів Mycobacterium tuberculosis зазвичай містять від 5 до 20 копій IS6110, але є штами, які не мають цього елемента. Поряд з IS-елементами, геном містить кілька типів коротких нуклеотидних повторів (PGRS та MPTR), а також прямі повтори DR (Direct Repeat), розташовані в області DR та розділені варіабельними послідовностями - спейсерами (шосте кільце на карті хромосом). Відмінності в кількості копій та локалізації на хромосомі цих генетичних елементів використовуються для диференціації штамів Mycobacterium tuberculosis в молекулярній епідеміології. Найдосконаліші схеми генотипування мікобактерій базуються на виявленні геномного поліморфізму, спричиненого елементом IS6110, а також DR та їх спейсерами. Характерно, що дивергенція видів M. tuberculosis відбувається, як правило, внаслідок рекомбінацій між копіями елемента IS6110, які фланкують різні гени.

У геномі H37Rv було виявлено два профаги, phiRv1 та phiRv2. Як і поліморфний сайт Dral, вони, ймовірно, пов'язані з факторами патогенності, оскільки ці ділянки геному відрізняються від аналогічних ділянок авірулентних штамів M. tuberculosis H37Ra та M. bom BCG. Були ідентифіковані ділянки геному (mutT, ogt-гени), відповідальні за збільшення частоти мутацій та адаптацію мікобактерій туберкульозу в умовах пресування. Відкриття тригерних генів спокою мікобактерій туберкульозу змінило уявлення про латентну туберкульозну інфекцію.

Вивчення поліморфізму генів, що кодують каталазу, пероксидазу та А-субодиницю ДНК-гірази. У комплексі M. tuberculosis було виявлено три генотипічні групи. Найдавнішою (з точки зору еволюції) є група I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis та M. microti. Групи II та III включають різні штами M. tuberculosis, які набули широкого поширення в деяких географічних регіонах. Клональна поведінка характерна для груп I та II, а штами групи III надзвичайно рідко викликають масові захворювання. Генетичні родини M. tuberculosis, що отримали назви Гарлемська, Африканська, Філіппінська, поширені в різних регіонах світу.

Особливе місце займає родина Beijing, вперше виявлена в гістологічних препаратах легеневої тканини пацієнтів у передмістях Пекіна в 1956-1990 роках. На сьогоднішній день штами цієї родини виявлені в азійських країнах, Південній Африці, Карибському басейні та США. Поширення цього генотипу на різних територіях визначається етнічними особливостями корінного населення та мігрантів. Нещодавно отримано дані про поширення штамів генотипу SI/Beijing на північному заході європейської частини Росії (Санкт-Петербург) та в регіонах Сибіру.

Резистентність мікобактерій

Протягом еволюції мікобактерії туберкульозу виробили різні механізми подолання або інактивації несприятливих факторів навколишнього середовища. По-перше, це потужна клітинна стінка. По-друге, це широкі метаболічні можливості. Вони здатні інактивувати багато клітинних токсинів та речовин (різні пероксиди, альдегіди та інші), що руйнують клітинну мембрану. По-третє, це морфологічна пластичність, яка полягає в трансформації мікобактерій (утворенні L-форм сплячих клітин). За своєю стійкістю, після спороутворюючих бактерій, вони займають провідне місце в царстві прокаріотів.

Збудник залишається життєздатним у сухому стані до 3 років. При нагріванні мікобактерії туберкульозу можуть витримувати температури значно вищі за 80°C. Сьогодні вважається, що мікобактерії туберкульозу, виявлені в мокротинні, залишаються життєздатними, якщо останню відкрито кип'ятити протягом 5 хвилин.

Мікобактерії туберкульозу стійкі до органічних та неорганічних кислот, лугів, багатьох окислювачів, а також низки антисептичних та дегідратуючих речовин, що згубно впливають на інші патогенні мікроорганізми. Мікобактерії проявляють стійкість до дії спиртів та ацетону.

Зазначається, що препарати на основі четвертинного амонію не проявляють протитуберкульозної активності. За певних умов концентрації хлору та кисневих радикалів до 0,5% також не мають шкідливого впливу на мікобактерії туберкульозу. Це означає неможливість використання таких препаратів для стерилізації мокротиння та інших інфікованих біологічних матеріалів.

Мікобактерії туберкульозу нечутливі до розсіяного сонячного світла та можуть існувати в зовнішньому середовищі більше року, не втрачаючи життєздатності. Короткохвильове ультрафіолетове випромінювання має універсальну бактерицидну дію на всі мікроорганізми. Однак у реальних умовах, коли мікобактерії туберкульозу суспендовані у вигляді клітинних агломератів з частинками пилу, їх стійкість до ультрафіолетового випромінювання підвищується.

Високий рівень виживання мікобактерій туберкульозу сприяє надзвичайно широкому поширенню цієї інфекції серед населення незалежно від кліматичних умов. Однак це не єдиний фактор, що сприяє глобалізації проблеми – мікобактерії туберкульозу можуть тривалий час зберігатися в організмі людини та реактивуватися через необмежену кількість проміжків часу.

Локалізація мікобактерії туберкульозу всередині макрофагів забезпечує достатню стабільність субстрату, враховуючи «довговічність» мононуклеарних фагоцитів та тривалість реплікації мікобактерій, а також ізоляцію від ефекторів гуморального імунітету. Водночас збудник вибирає біотоп, неприйнятний для більшості мікроорганізмів через його потенційну небезпеку. Цей симбіоз забезпечується низкою адаптивних механізмів мікобактерій.

Процес пошкодження макрофагів та паразитизму в ньому виглядає так: проникнення мікобактерій у макрофаг без його активації; пригнічення формування фаголізосом або перетворення їх у комфортну для бактерій зону; прорив з фагосом у цитоплазму з інактивацією антимікробних факторів; втручання в життєдіяльність клітини; ослаблення чутливості макрофагів до активуючих сигналів Т-лімфоцитів; зниження антигенпрезентуючої функції макрофагів та пов'язане з цим ослаблення реакцій цитотоксичних Т-лімфоцитів, налаштованих на знищення інфікованих клітин.

Звичайно, особливості клітинної стінки відіграють важливу роль у забезпеченні цього, як і метаболічні та функціональні можливості. При першому контакті з мікобактеріями імунні системи макроорганізму не здатні активувати гуморальний імунітет, швидко нейтралізувати та вивести клітину з організму, оскільки рухомі аліфатичні ланцюги мікобактеріальної стінки не дозволяють оцінити поверхневі структури збудника та передавати відповідну інформацію для синтезу необхідного набору антитіл.

Висока гідрофобність мікобактерій забезпечує неспецифічні, тобто рецептор-незалежні, контакти з макрофагами. Утворюючи фагосому навколо клітини мікобактерії, макрофаг розміщує її всередину себе. Поверхневі комплекси мікозиду та ліпоарабіноманану можуть розпізнаватися рецепторами, але сигнали, що запускаються через них, не активують або слабо активують макрофаги. В результаті фагоцитоз не супроводжується вивільненням вільнорадикальних форм кисню та азоту. Вважається, що це більш характерно для вірулентних штамів M. tuberculosis, які завдяки структурним особливостям ліпоарабіноманану ініціюють «неагресивний» фагоцитоз. Інші рецептори макрофагів, зокрема CD14 та рецептори компонента комплементу C3 (CR1-CR3), також беруть участь у розпізнаванні M. tuberculosis.

Проникнувши всередину макрофага, мікобактерія включає ряд механізмів, що перешкоджають утворенню фаголізосоми: продукування амонію, який подщелачує середовище всередині фагосоми, синтез сульфоліпідів, що призводить до утворення негативного заряду на поверхні фагосоми, що перешкоджає злиттю фагосоми та лізосоми.

Якщо утворюється фаголізосома, мікобактерія, завдяки своїй потужній воскоподібній оболонці, здатна гасити вільнорадикальні реакції, спричинені бактерицидними речовинами фагоцитів. Амоній подщелачує середовище, блокуючи активність лізосомальних ферментів, а сульфоліпіди нейтралізують мембранотропні катіонні білки. Крім того, туберкульозні мікобактерії продукують високоактивні ферменти з каталазною та пероксидазною активністю, які конкурують з пероксидазними системами макрофагів, та одночасно інактивують гідропероксиди лізосом. Все це підвищує стійкість мікобактерій до оксидативного стресу.

Подальша адаптація мікобактерій полягає у використанні залізовмісних сполук макрофагів для своїх ферментних систем та блокуванні імуноспецифічних функцій макрофагів. Макрофаги є одним з основних резервуарів заліза, надлишок якого накопичується у формі феритину. Вміст заліза в альвеолярних макрофагах у 100 разів вищий, ніж у моноцитах крові, що, безумовно, сприяє їх колонізації мікобактеріями туберкульозу.

Мікобактерії здійснюють токсичну дію на макрофаги за допомогою ендотоксинів та неспецифічних факторів. Обидва вони в першу чергу впливають на дихальну систему макрофагів – мітохондрії. До ендотоксинів належать міколові арабіноліпіди, які пригнічують мітохондріальне дихання. До неспецифічних токсинів належать продукти синтезу ліпідної частини мікобактеріальної клітини – фтієнова та фтіонова кислоти, що викликають роз'єднання окисного фосфорилювання. Посилення метаболічних процесів за цих умов не супроводжується належним синтезом АТФ. Клітини-господарі починають відчувати енергетичне голодування, що призводить до пригнічення їхньої життєдіяльності, а згодом до цитолізу та апоптозу.

Можливо, що деякі фактори патогенності утворюються лише всередині інфікованих клітин, як це відбувається з іншими бактеріями, які віддають перевагу внутрішньоклітинному способу життя. Наприклад, сальмонели, паразитуючи всередині макрофагів, додатково експресують понад 30 генів. Незважаючи на повний опис геному мікобактерії туберкульозу, 30% кодонів пов'язані з білками з невідомими властивостями.

Резистентність мікобактерій до ліків

З клінічної точки зору, чутливість мікроорганізму до ліків визначає, чи можна використовувати стандартну хіміотерапію зазначеним препаратом для лікування захворювання, спричиненого ізольованим штамом. Резистентність «прогнозує невдачу лікування досліджуваним препаратом». Іншими словами, використання стандартної хіміотерапії, яка призводить до системної концентрації препарату, що зазвичай ефективна за нормальних умов, не пригнічує проліферацію «резистентних мікроорганізмів».

У мікробіології визначення чутливості до ліків або лікарської стійкості базується на популяційному підході, який передбачає різний ступінь стійкості пулу (гетерогенного набору) мікробних клітин. Лікарська стійкість оцінюється за кількісними характеристиками, такими як «мінімальна інгібуюча концентрація» (МІК). Наприклад, при МІК-90 гине 90% мікроорганізмів (бактеріостатична концентрація). Таким чином, під стійкістю слід розуміти її ступінь у частини мікробної популяції, що зумовлює невдачу лікування в більшості випадків. Загальновизнано, що 10% резистентних штамів серед усієї мікробної популяції пацієнта можуть мати патогенний ефект. У фтизіобактеріології для протитуберкульозних препаратів першого ряду це 1%, або 20 колонієутворюючих одиниць - КУО). Така частина мікробної популяції здатна за місяць витіснити початкову та утворити ураження. Для протитуберкульозних препаратів другого ряду критерієм стійкості є 10% збільшення мікробної популяції.

Розвиток лікарської стійкості у мікроорганізмів пов'язаний з відбором у присутності антибіотика та з переважним виживанням частини мікробної популяції, яка має механізми захисту від антибактеріального агента. Кожна популяція містить невелику кількість мутантних клітин (зазвичай 106-109 ^), стійких до певного препарату. Під час хіміотерапії чутливі мікробні клітини гинуть, а стійкі розмножуються. В результаті чутливі клітини замінюються стійкими.

Мікобактерії спочатку мають високу природну стійкість до багатьох антибактеріальних препаратів широкого спектру дії, але різні види мають різні спектри та ступені цієї чутливості.

Справжня природна резистентність розуміється як постійна видоспецифічна характеристика мікроорганізмів, пов'язана з відсутністю мішені для дії антибіотика або недоступністю мішені через початково низьку проникність клітинної стінки, ферментативну інактивацію речовини чи інші механізми.

Набута резистентність – це здатність окремих штамів залишатися життєздатними за концентрацій антибіотиків, що пригнічують ріст основної частини мікробної популяції. Набуття резистентності у всіх випадках є генетично обумовленим: появою нової генетичної інформації або зміною рівня експресії власних генів.

Наразі виявлено різні молекулярні механізми резистентності Mycobacterium tuberculosis:

• інактивація антибіотиків (інактивація ферментів), наприклад, β-лактамазами;
• модифікація мішені дії (зміна просторової конфігурації білка внаслідок мутації відповідної ділянки геному):
• гіперпродукція мішені, що призводить до зміни співвідношення агент-мішень та вивільнення частини життєзабезпечуючих білків бактерій;
• активне виведення препарату з мікробної клітини (ефлюкс) внаслідок активації механізмів стресового захисту:
• зміни параметрів проникності зовнішніх структур мікробної клітини, що блокують здатність антибіотика проникати в клітину;
• включення «метаболічного шунта» (обхідного метаболічного шляху).

Окрім прямого впливу на метаболізм мікробних клітин, багато антибактеріальних препаратів (бензилпеніцилін, стрептоміцин, рифампіцин) та інші несприятливі фактори (біоциди імунної системи) призводять до появи змінених форм мікобактерій (протопластів, L-форм), а також переводять клітини у стан спокою: інтенсивність клітинного метаболізму знижується, і бактерія стає нечутливою до дії антибіотика.

Усі механізми формують різний ступінь резистентності, забезпечуючи стійкість до різних концентрацій хіміотерапевтичних препаратів, тому виникнення резистентності у бактерій не завжди супроводжується зниженням клінічної ефективності антибіотика. Для оцінки ефективності та прогнозу лікування важливо знати ступінь резистентності.

Наразі для кожного протитуберкульозного препарату першого ряду та для більшості резервних препаратів ідентифіковано щонайменше один ген. Специфічні мутації в якому призводять до розвитку резистентних варіантів мікобактерій. При широкому поширенні лікарської резистентності у мікобактерій важливе значення має висока частота мутацій in vivo, більша, ніж in vitro.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Типи лікарської стійкості мікобактерій

Розрізняють первинну та набуту лікарську резистентність. До мікроорганізмів з первинною резистентністю належать штами, виділені від пацієнтів, які не отримували специфічної терапії або отримували препарати протягом місяця чи менше. Якщо неможливо з'ясувати факт застосування протитуберкульозних препаратів, використовується термін «початкова резистентність».

Первинна лікарська резистентність має велике клінічне та епідеміологічне значення, тому для її правильної оцінки необхідно не призначати хіміотерапію вперше діагностованому хворому на туберкульоз до мікробіологічного дослідження діагностичного матеріалу. Частота первинної лікарської резистентності розраховується як відношення кількості вперше діагностованих пацієнтів з первинною резистентністю до кількості всіх вперше діагностованих пацієнтів, яким було проведено тестування на лікарську чутливість протягом року. Якщо у пацієнта під час протитуберкульозної терапії, що проводиться протягом місяця або більше, виділено резистентний штам, резистентність вважається набутою. Частота первинної лікарської резистентності характеризує епідеміологічний стан популяції збудника туберкульозу.

Набута лікарська стійкість у вперше діагностованих пацієнтів є результатом невдалого лікування (неправильний підбір препаратів, недотримання режиму лікування, зниження дозування препаратів, нестабільне постачання та низька якість препаратів). Ці фактори призводять до зниження системної концентрації препаратів у крові та їх ефективності, одночасно «запускаючи» захисні механізми в клітинах мікобактерій.

Для епідеміологічних цілей розраховується частота раніше лікованих випадків. Для цього враховуються пацієнти, зареєстровані для повторного лікування після невдалого курсу хіміотерапії або рецидивів. Розраховується співвідношення кількості резистентних культур Mycobacterium tuberculosis до кількості всіх штамів, протестованих на лікарську стійкість протягом року серед пацієнтів цієї групи на момент їх реєстрації.

У структурі лікарської резистентності Mycobacterium tuberculosis виділяють:

Монорезистентність – стійкість до одного з протитуберкульозних препаратів, чутливість до інших препаратів збережена. При використанні комплексної терапії монорезистентність виявляється досить рідко і, як правило, до стрептоміцину (у 10-15% випадків серед вперше діагностованих пацієнтів).

Полірезистентність – це стійкість до двох або більше препаратів.

Множинна лікарська резистентність – це резистентність до ізоніазиду та рифампіцину одночасно (незалежно від наявності резистентності до інших препаратів). Зазвичай вона супроводжується резистентністю до стрептоміцину тощо. Наразі МЛР збудників туберкульозу стала епідеміологічно небезпечним явищем. Розрахунки показують, що виявлення збудників з МЛР у понад 6,6% випадків (серед вперше діагностованих пацієнтів) вимагає зміни стратегії Національної протитуберкульозної програми. Згідно з даними моніторингу лікарської резистентності, частота МЛР серед вперше діагностованих пацієнтів коливається від 4 до 15%, серед рецидивів – 45-55%, а серед випадків невдалого лікування – до 80%.

Суперрезистентність – це множинна лікарська резистентність, що поєднується з резистентністю до фторхінолонів та одного з ін'єкційних препаратів (канаміцин, амікацин, капреоміцин). Туберкульоз, спричинений штамами з суперрезистентністю, становить пряму загрозу для життя пацієнтів, оскільки інші протитуберкульозні препарати другої лінії не мають вираженого антибактеріального ефекту. З 2006 року в деяких країнах організовано спостереження за поширенням штамів мікобактерій з суперрезистентністю. За кордоном цей варіант MDR зазвичай позначається як XDR.

Перехресна резистентність – це коли резистентність до одного препарату призводить до резистентності до інших препаратів. У M. tuberculosis мутації, пов'язані з резистентністю, зазвичай не взаємопов'язані. Розвиток перехресної резистентності зумовлений подібністю хімічної структури деяких протитуберкульозних препаратів. Перехресна резистентність особливо часто виявляється в межах однієї групи препаратів, таких як аміноглікозиди. Для прогнозування перехресної резистентності необхідні генетичні дослідження мікобактеріальних культур у поєднанні з мікробіологічними дослідженнями резистентності.

Нетуберкульозні мікобактерії

Нетуберкульозні мікобактерії передаються від людини до людини вкрай рідко. Частота виділення деяких їх видів з матеріалу від хворих порівнянна з частотою виділення цих видів з об'єктів навколишнього середовища. Джерелами інфекції можуть бути сільськогосподарські тварини та птахи, необроблені продукти. Мікобактерії знаходяться в післязабійному матеріалі та молоці великої рогатої худоби.

За даними бактеріологічних лабораторій, поширеність нетуберкульозних мікобактерій у 2004-2005 роках становила 0,5-6,2% серед усіх мікобактерій у вперше діагностованих пацієнтів. Частота, ймовірно, може бути дещо вищою, оскільки метод, який використовується для обробки діагностичного матеріалу, не є оптимальним для нетуберкульозних мікобактерій. Сапрофітні мікобактерії можуть бути присутніми в діагностичному матеріалі, якщо не дотримуються правил збору або через характеристики матеріалу (наприклад, M. smegmatis може бути виділена з сечі пацієнтів чоловічої статі).

У зв'язку з цим важливо неодноразово підтвердити виявлений тип мікобактерій з матеріалу пацієнта.

Мікобактерії вражають шкіру, м’які тканини, а також можуть спричиняти мікобактеріоз легень, який особливо часто зустрічається при імунодефіцитних станах. При легеневій локалізації частіше виявляється у чоловіків похилого віку з наявністю в анамнезі хронічних захворювань легень, включаючи грибкові ураження.

З усіх мікобактерій комплекс M. avium-intracellulare є найпоширенішим збудником легеневого мікобактеріозу у людини. Він викликає захворювання легень, периферичних лімфатичних вузлів та дисеміновані процеси. На півночі Європейського регіону припадає близько 60% легеневих мікобактеріозів. Переважають фіброзно-кавернозні та інфільтративні процеси, що приймають хронічний перебіг через високу резистентність до протитуберкульозних препаратів.

M. kansasii є збудниками хронічних захворювань легень, схожих на туберкульоз. Хіміотерапія є більш ефективною через вищу чутливість M. kansasii до антибактеріальних препаратів. M. xenopi та M. malmoense спричиняють переважно хронічні захворювання легень. Вони можуть забруднювати системи гарячого та холодного водопостачання. Середовище існування M. malmoens до кінця не встановлено. M. xenopi демонструють досить добру чутливість до протитуберкульозної терапії. M. malmoense демонструють досить високу чутливість до антибіотиків in vitro, але консервативне лікування часто неефективне і навіть призводить до летального результату. M. fortuitum та M. chelonae визнані збудниками захворювань кісток і м'яких тканин внаслідок прямого забруднення рани під час травми, операції та проникаючих поранень. Вони спричиняють до 10% легеневих мікобактеріозів. Він протікає як хронічне деструктивне двостороннє ураження, часто смертельне. Протитуберкульозні препарати та антибіотики широкого спектру дії неактивні або мають незначну активність проти цих видів мікобактерій.

У південних регіонах поширені мікобактеріози шкіри та м’яких тканин, спричинені M. leprae, M. ulceranse. Ідентифікація нетуберкульозних мікобактерій проводиться в лабораторіях провідних протитуберкульозних установ країни. Це вимагає високої кваліфікації та доброго оснащення лабораторій.