Роль ферментів і цитокінів у патогенезі остеоартрозу

В останні роки значна увага дослідників зосереджена на ідентифікації протеаз, відповідальних за деградацію позаклітинного матеріалу суглобового хряща при остеоартрозі. Згідно з сучасними уявленнями, матриксні металопротеїнази (ММП) відіграють важливу роль у патогенезі остеоартрозу. У пацієнтів з остеоартрозом виявляється підвищений рівень трьох ММП – колагеназ, стромелізинів та желатиназ. Колагеназа відповідає за деградацію нативного колагену, стромелізин – колагену IV типу, протеогліканів та ламініну, желатиназа – за деградацію желатину, колагенів IV, Vh XI типів, еластину. Крім того, передбачається наявність ще одного ферменту – агреканази, який має властивості ММП та відповідає за протеоліз агрегатів хрящових протеогліканів.

У суглобовому хрящі людини було виявлено три типи колагеназ, рівні яких значно підвищені у пацієнтів з остеоартритом: колагеназа-1 (MMP-1), колагеназа-2 (MMP-8) та колагеназа-3 (MMP-13). Співіснування трьох різних типів колагеназ у суглобовому хрящі свідчить про те, що кожен з них відіграє свою специфічну роль. Дійсно, колагенази-1 та -2 локалізуються переважно в поверхневій та верхній проміжній зоні суглобового хряща, тоді як колагеназа-3 знаходиться в нижній проміжній зоні та в глибокій зоні. Більше того, результати імуногістохімічного дослідження показали, що в міру прогресування остеоартриту рівень колагенази-3 досягає плато і навіть знижується, тоді як рівень колагенази-1 поступово зростає. Є дані, що при остеоартриті колагеназа-1 переважно бере участь у запальному процесі в суглобовому хрящі, тоді як колагеназа-3 бере участь у ремоделюванні тканин. Колагеназа-3, що експресується в хрящі пацієнтів з остеоартритом, руйнує колаген II типу інтенсивніше, ніж колагеназа-1.

З представників другої групи металопротеїназ у стромелізині людини також ідентифіковано три: стромелізин-1 (MMP-3), стромелізин-2 (MMP-10) та стромелізин-3 (MMP-11). Сьогодні відомо, що лише стромелізин-1 бере участь у патологічному процесі при остеоартрозі. Стромелізин-2 не виявляється в синовіальній оболонці пацієнтів з остеоартрозом, але він виявляється у дуже невеликих кількостях у синовіальних фібробластах пацієнтів з ревматоїдним артритом. Стромелізин-3 також виявляється в синовіальній оболонці пацієнтів з ревматоїдним артритом поблизу фібробластів, особливо в зонах фіброзу.

У групі желатиназ у хрящовій тканині людини ідентифіковано лише дві: желатиназу 92 кДа (желатиназу B, або MMP-9) та желатиназу 72 кДа (желатиназу A, або MMP-2); у пацієнтів з остеоартритом визначається підвищення рівня желатинази 92 кДа.

Нещодавно було виявлено ще одну групу ММП, які локалізуються на поверхні клітинних мембран і називаються ММП мембранного типу (ММП-МТ). До цієї групи входять чотири ферменти – ММП-МТ1 – ММП-МТ-4. Експресію ММП-МТ було виявлено в суглобовому хрящі людини. Хоча ММП-МТ-1 має колагеназні властивості, обидва ферменти, ММП-МТ-1 та ММП-МТ-2, здатні активувати желатиназу-72 кДа та колагеназу-3. Роль цієї групи ММП у патогенезі остеоартриту потребує уточнення.

Протеїнази секретуються у формі зимогену, який активується іншими протеїназами або органічними сполуками ртуті. Каталітична активність ММП залежить від наявності цинку в активній зоні ферменту.

Біологічна активність ММП контролюється специфічними ТІМП. На сьогоднішній день ідентифіковано три типи ТІМП, які знаходяться в суглобових тканинах людини: ТІМП-1–ТІМП-3. Четвертий тип ТІМП був ідентифікований та клонований, але він ще не виявлений у суглобових тканинах людини. Ці молекули специфічно зв'язуються з активним центром ММП, хоча деякі з них здатні зв'язуватися з активним центром прожелатинази 72 кДа (ТІМП-2, -3, -4) та прожелатинази 92 кДа (ТІМП-1 та -3). Дані свідчать про те, що при остеоартрозі існує дисбаланс між ММП та ТІМП у суглобовому хрящі, що призводить до відносного дефіциту інгібіторів, можливо, частково через підвищення рівня активних ММП у тканині. ТІМП-1 та -2 знаходяться в суглобовому хрящі та синтезуються хондроцитами. При остеоартрозі в синовіальній оболонці та синовіальній рідині виявляється лише ТІМП I типу. TIMP-3 міститься виключно в позаклітинному матриксі (ECM). TIMP-4 має майже 50% спільної амінокислотної послідовності з TIMP-2 та 38% з TIMP-1. В інших клітинах-мішенях TIMP-4 відповідає за модуляцію активації прожелатинази 72 kD на поверхні клітини, що вказує на важливу роль як тканинно-специфічного регулятора ремоделювання ECM.

Іншим механізмом контролю біологічної активності ММП є їхня фізіологічна активація. Вважається, що ферменти з родини серинових та цистеїнових протеаз, такі як АП/плазмін та катепсин B відповідно, є фізіологічними активаторами ММП. Підвищений рівень урокінази (уАП) та плазміну був виявлений у суглобовому хрящі пацієнтів з остеоартритом.

Незважаючи на те, що в тканинах суглобів виявлено кілька типів катепсинів, катепсин-B вважається найімовірнішим активатором ММП у хрящі. Фізіологічні інгібітори серинових та цистеїнових протеаз були виявлені в тканинах суглобів людини. Активність інгібітора AP-1 (IAI-1), а також цистеїнових протеаз, знижена у пацієнтів з остеоартритом. Подібно до MMP/TIMP, саме дисбаланс між сериновими та цистеїновими протеазами та їх інгібіторами може пояснити підвищену активність ММП у суглобовому хрящі пацієнтів з остеоартритом. Крім того, ММП здатні активувати одна одну. Наприклад, стромелізин-1 активує колагеназу-1, колагеназу-3 та желатиназу 92 кДа; колагеназа-3 активує желатиназу 92 кДа; MMP-MT активує колагеназу-3, а желатиназа-72 кДа посилює цю активацію; MMP-MT також активує желатиназу 72 кДа. Цитокіни можна розділити на три групи – деструктивні (запальні), регуляторні (включаючи протизапальні) та анаболічні (фактори росту).

Типи цитокінів (за van den Berg WB et al.)

Руйнівний	Інтерлейкін-1 ФНП-α Фактор інгібування лейкемії Інтерлейкін-17
Регуляторний	Інтерлейкін-4 Інтерлейкін-10 Інтерлейкін-13 Інгібітори ферментів
Анаболічний	Інсуліноподібні фактори росту TGF-β Кісткові морфогенетичні білки Морфогенетичні білки, отримані з хряща

Деструктивні цитокіни, зокрема IL-1, індукують збільшення вивільнення протеаз та пригнічують синтез протеогліканів та колагенів хондроцитами. Регуляторні цитокіни, зокрема IL-4 та -10, пригнічують продукцію IL-1, збільшують продукцію антагоніста рецептора IL-1 (IL-1RA) та знижують рівень NO-синтази в хондроцитах. Таким чином, IL-4 протидіє IL-1 у трьох напрямках: 1) зменшує продукцію, запобігаючи його впливу, 2) збільшує продукцію основного «поглинача» IL-1RA та 3) зменшує продукцію основного вторинного «мессенджера» NO. Крім того, IL-4 зменшує ферментативну деградацію тканин. In vivo оптимальний терапевтичний ефект досягається при комбінації IL-4 та IL-10. Анаболічні фактори, такі як TGF-β та IGF-1, насправді не перешкоджають виробленню або дії IL-1, але проявляють протилежну активність, наприклад, стимулюючи синтез протеогліканів та колагену, пригнічуючи активність протеаз, а TGF-β також пригнічує вивільнення ферментів та стимулює їх інгібітори.

Прозапальні цитокіни відповідають за підвищений синтез та експресію ММП у суглобових тканинах. Вони синтезуються в синовіальній оболонці, а потім дифундують у суглобовий хрящ через синовіальну рідину. Прозапальні цитокіни активують хондроцити, які, у свою чергу, також здатні продукувати прозапальні цитокіни. У суглобах, уражених остеоартрозом, роль ефектора запалення відіграють переважно клітини синовіальної оболонки. Саме синовоцити макрофагального типу секретують протеази та медіатори запалення. Серед них у патогенезі остеоартрозу найбільше «задіяні» IL-f, TNF-α, IL-6, фактор інгібування лейкемії (LIF) та IL-17.

Біологічно активні речовини, що стимулюють деградацію суглобового хряща при остеоартриті

• Інтерлейкін-1
• Інтерлейкін-3
• Інтерлейкін-4
• ФНП-α
• Колонієстимулюючі фактори: макрофаги (моноцити) та гранулоцитарно-макрофаги
• Речовина П
• СТЕР ₂
• Активатори плазміногену (тканинного та урокіназного типу) та плазмін
• Металопротеїнази (колагенази, елластази, стромелізини)
• Катепсини А та В
• Трільсін
• Бактеріальні ліпополісахариди
• Фосфоліпаза Ag

Літературні дані свідчать про те, що IL-1 та, можливо, TNF-α є основними медіаторами руйнування тканин суглобів при остеоартрозі. Однак досі невідомо, чи діють вони незалежно один від одного, чи між ними існує функціональна ієрархія. Тваринні моделі остеоартрозу показали, що блокада IL-1 ефективно запобігає руйнуванню суглобового хряща, тоді як блокада TNF-α призводить лише до зменшення запалення в тканинах суглобів. Підвищені концентрації обох цитокінів були виявлені в синовіальній оболонці, синовіальній рідині та хрящі пацієнтів. У хондроцитах вони здатні збільшувати синтез не тільки протеаз (головним чином MMP та AP), але й другорядних колагенів, таких як I та III типи, та зменшувати синтез колагенів II та IX типів та протеогліканів. Ці цитокіни також стимулюють активні форми кисню та медіатори запалення, такі як PGE2 _. Результатом таких макромолекулярних змін у суглобовому хрящі при остеоартрозі є неефективність репаративних процесів, що призводить до подальшої деградації хряща.

Вищезгадані прозапальні цитокіни модулюють процеси пригнічення/активації ММП при остеоартрозі. Наприклад, дисбаланс між рівнями TIMP-1 та ММП у хрящі при остеоартрозі може бути опосередкований IL-1, оскільки дослідження in vitro продемонструвало, що збільшення концентрації IL-1 бета призводить до зниження концентрації TIMP-1 та збільшення синтезу ММП хондроцитами. Синтез AP також модулюється IL-1 бета. Стимуляція хондроцитів суглобового хряща IL-1 in vitro викликає дозозалежне збільшення синтезу AP та різке зниження синтезу iAP-1. Здатність IL-1 знижувати синтез iAP-1 та стимулювати синтез AP є потужним механізмом генерації плазміну та активації ММП. Крім того, плазмін є не тільки ферментом, який активує інші ферменти, він також бере участь у процесі деградації хряща шляхом прямого протеолізу.

IL-ip синтезується як неактивний попередник масою 31 кДа (пре-IL-ip), а потім, після розщеплення сигнального пептиду, перетворюється на активний цитокін масою 17,5 кДа. У тканинах суглобів, включаючи синовіальну мембрану, синовіальну рідину та суглобовий хрящ, IL-ip знаходиться в активній формі, і дослідження in vivo продемонстрували здатність синовіальної мембрани при остеоартрозі секретувати цей цитокін. Деякі серинові протеази здатні перетворювати пре-IL-ip у його біоактивну форму. У ссавців такі властивості були виявлені лише в однієї протеази, яка належить до сімейства цистеїн-аспартат-специфічних ферментів і називається IL-1β-перетворюючим ферментом (ICF, або каспаза-1). Цей фермент здатний специфічно перетворювати пре-IL-ip у біологічно активний «зрілий» IL-ip масою 17,5 кДа. ICF - це профермент (p45) масою 45 кДа, який локалізується в клітинній мембрані. Після протеолітичного розщеплення проферменту p45 утворюються дві субодиниці, відомі як p10 та p20, які характеризуються ферментативною активністю.

ФНП-α також синтезується як мембранозв'язаний попередник з масою 26 кДа; шляхом протеолітичного розщеплення він вивільняється з клітини у вигляді активної розчинної форми з масою 17 кДа. Протеолітичне розщеплення здійснюється ферментом, що перетворює ФНП-α (ФНП-АЦ), який належить до родини адамалізинів. А. Р. Амін та ін. (1997) виявили підвищену експресію мРНК ФНП-АЦ у суглобовому хрящі пацієнтів з остеоартритом.

Біологічна активація хондроцитів та синовоцитів IL-1 та TNF-α опосередковується зв'язуванням зі специфічними рецепторами на поверхні клітин – IL-R та TNF-R. Для кожного цитокіну ідентифіковано два типи рецепторів – IL-IP I та II типів та TNF-R I (p55) та II (p75). IL-1PI та p55 відповідають за передачу сигналу в клітинах тканин суглобів. IL-1R I типу має дещо вищу спорідненість до IL-1β, ніж до IL-1a; IL-1R II типу, навпаки, має вищу спорідненість до IL-1a, ніж до IL-ip. Залишається незрозумілим, чи може IL-IP II типу опосередковувати сигнали IL-1, чи він служить лише для конкурентного гальмування асоціації IL-1 з IL-1R I типу. Хондроїтиди та синовіальні фібробласти пацієнтів з остеоартрозом містять велику кількість IL-1PI та p55, що, у свою чергу, пояснює високу чутливість цих клітин до стимуляції відповідними цитокінами. Цей процес призводить як до посилення секреції протеолітичних ферментів, так і до руйнування суглобового хряща.

Не можна виключати участі IL-6 у патологічному процесі при остеоартриті. Це припущення ґрунтується на наступних спостереженнях:

• IL-6 збільшує кількість запальних клітин у синовіальній оболонці,
• IL-6 стимулює проліферацію хондроцитів,
• IL-6 посилює дію IL-1, збільшуючи синтез MMP та пригнічуючи синтез протеогліканів.

Однак, IL-6 здатний індукувати вироблення TIMP, але не впливає на вироблення MMP, тому вважається, що цей цитокін бере участь у процесі пригнічення протеолітичної деградації суглобового хряща, який здійснюється за механізмом зворотного зв'язку.

Ще одним членом родини IL-6 є LIF, цитокін, що виробляється хондроцитами, отриманими від пацієнтів з остеоартрозом, у відповідь на стимуляцію прозапальними цитокінами IL-1β та TNF-α. LIF стимулює резорбцію протеогліканів хряща, а також синтез MMP та продукцію NO. Роль цього цитокіну в остеоартрозі до кінця не з'ясована.

IL-17 – це гомодимер 20-30 кДа з ефектом, подібним до IL-1, але значно менш вираженим. IL-17 стимулює синтез і вивільнення низки прозапальних цитокінів, включаючи IL-1β, TNF-α, IL-6 та MMP, у клітинах-мішенях, таких як макрофаги людини. Крім того, IL-17 стимулює продукцію NO хондроцитами. Як і LIF, роль IL-17 у патогенезі остеоартриту вивчена недостатньо.

Неорганічний вільний радикал NO відіграє важливу роль у деградації суглобового хряща при остеоартриті. Хондроцити, виділені від пацієнтів з остеоартритом, виробляють більшу кількість NO як спонтанно, так і після стимуляції прозапальними цитокінами порівняно з нормальними клітинами. Високий вміст NO було виявлено в синовіальній рідині та сироватці крові пацієнтів з остеоартритом – це результат підвищеної експресії та синтезу індукованої NO-синтази (hNOC), ферменту, відповідального за продукцію NO. Нещодавно було клоновано ДНК хондроцитно-специфічної hNOC та визначено амінокислотну послідовність ферменту. Амінокислотна послідовність вказує на 50% ідентичність та 70% подібність з hNOC, специфічним для ендотелію та нервової тканини.

NO пригнічує синтез макромолекул позаклітинного матеріалу суглобового хряща та стимулює синтез MMP. Більше того, збільшення продукції NO супроводжується зниженням синтезу антагоніста IL-IP (IL-1RA) хондроцитами. Таким чином, підвищення рівня IL-1 та зниження IL-1RA призводить до гіперстимуляції NO в хондроцитах, що, у свою чергу, призводить до посилення деградації хрящового матриксу. Є повідомлення про терапевтичний ефект in vivo селективного інгібітора hNOC на прогресування експериментального остеоартрозу.

Природні інгібітори цитокінів здатні безпосередньо запобігати зв'язуванню цитокінів з рецепторами клітинних мембран, зменшуючи їхню прозапальну активність. Природні інгібітори цитокінів можна розділити на три класи залежно від їхнього механізму дії.

До першого класу інгібіторів належать антагоністи рецепторів, які запобігають зв'язуванню ліганду з його рецептором, конкуруючи за місце зв'язування. На сьогоднішній день такий інгібітор знайдено лише для IL-1 – це згаданий вище конкурентний інгібітор системи IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA блокує багато ефектів, що спостерігаються в тканинах суглобів при остеоартриті, включаючи синтез простагландинів синовіальними клітинами, продукцію колагенази хондроцитами та деградацію кісткової тканини суглобового хряща.

IL-1RA зустрічається в різних формах – одній розчинній (rIL-1RA) та двох міжклітинних (μIL-lPAI та μIL-1RAP). Афінність розчинної форми IL-1RA у 5 разів вища, ніж у міжклітинних форм. Незважаючи на інтенсивні наукові дослідження, функція останньої залишається невідомою. Експерименти in vitro показали, що пригнічення активності IL-1β вимагає концентрації IL-1RA в 10-100 разів вищої за норму, тоді як умови in vivo вимагають тисячократного збільшення концентрації IL-1RA. Цей факт може частково пояснити відносний дефіцит IL-1RA та надлишок IL-1 у синовіальній оболонці пацієнтів з остеоартрозом.

Другим класом природних інгібіторів цитокінів є розчинні рецептори цитокінів. Прикладами таких інгібіторів у людей, що пов'язані з патогенезом остеоартриту, є rIL-1R та pp55. Розчинні рецептори цитокінів є скороченими формами нормальних рецепторів; коли вони зв'язуються з цитокінами, вони запобігають їх зв'язуванню з мембраноасоційованими рецепторами клітин-мішеней, діючи за механізмом конкурентного антагонізму.

Основним попередником розчинних рецепторів є мембранозв'язаний IL-1RP. Афінність rIL-IP до IL-1 та IL-1RA різна. Таким чином, rIL-1RN має вищу афінність до IL-1β, ніж до IL-1RA, а rIL-1PI виявляє вищу афінність до IL-1RA, ніж до IL-ip.

Також існує два типи розчинних рецепторів для TNF – pp55 та pp75, подібно до розчинних рецепторів IL-1, вони утворюються шляхом «скидання». In vivo обидва рецептори знаходяться в тканинах уражених суглобів. Роль розчинних рецепторів TNF у патогенезі остеоартрозу є предметом дискусій. Передбачається, що в низьких концентраціях вони стабілізують тривимірну структуру TNF та збільшують період напіввиведення біоактивного цитокіну, тоді як високі концентрації pp55 та pp75 можуть знижувати активність TNF шляхом конкурентного антагонізму. Ймовірно, pp75 може діяти як переносник TNF, сприяючи його зв'язуванню з мембраноасоційованим рецептором.

Третій клас природних інгібіторів цитокінів представлений групою протизапальних цитокінів, до яких належать TGF-бета, IL-4, IL-10 та IL-13. Протизапальні цитокіни зменшують продукцію прозапальних та деяких протеаз, а також стимулюють продукцію IL-1RA та TIMP.