Роль ферментів і цитокінів в патогенезі остеоартрозу

В останні роки велика увага дослідників фокусується на ідентифікації протеаз, відповідальних за деградацію ВКМ суглобового хряща при остеоартрозі. Відповідно до сучасних уявлень, важливу роль в патогенезі остеоартрозу відіграють матриксні металопротеази (ММП). У хворих на остеоартроз виявляють підвищений рівень трьох представників ММП - коллагеназ, стромелізіна і желатинази. Коллагеназа відповідальна за деградацію нативного колагену, стромелизин - колагену IV типу, протеогліканів і ламініну, ажелатіназа - за деградацію желатину, колагену IV, Vh XI типів, еластину. Крім того, припускають наявність ще одного ферменту - аггреканази, який має властивості ММП і відповідає за протеолиз хрящових протеогліканових агрегатів.

В суглобовому хрящі людини ідентифіковані три типи коллагеназ, рівень яких значно підвищений у хворих на остеоартроз, - коллагеназа-1 (ММП-1), коллагеназа-2 (ММП-8) і коллагеназа-3 (ММП-13). Співіснування трьох різних типів коллагеназ в суглобовому хрящі свідчить про те, що кожна з них грає свою специфічну роль. Дійсно, колагенази-1 і -2 локалізуються головним чином в поверхневої і верхньої частини проміжної зони суглобного хряща, тоді як коллагеназу-3 виявляють в нижній частині проміжної і в глибокій зонах. Більш того, результати імуногістохімічного дослідження продемонстрували, що в процесі прогресування остеоартрозу рівень колагенази-3 досягає плато і навіть знижується, тоді як рівень колагенази-1 поступово підвищується. Є дані про те, що при остеоартрозі коллагеназа-1 головним чином бере участь в запальному процесі в суглобовому хрящі, тоді як коллагеназа-3 - в ремоделюванні тканини. Експрессіруемим в хрящі хворих з ОА коллагеназа-3 здійснює деградацію колагену II типу більш інтенсивно, ніж коллагеназа-1.

З представників другої групи металлопротеаз, стромелізінову людини ідентифіковані також три - стромелизин-1 (ММП-3), стромелизин-2 (ММП-10) і стромелизин-3 (ММП-11). Сьогодні відомо, що тільки стромелизин-1 залучений в патологічний процес при остеоартрозі. У синовіальній мембрані хворих на остеоартроз не визначається стромелизин-2, проте він виявлений в дуже малій кількості в синовіальних фибробластах хворих на ревматоїдний артрит. Стромелизин-3 також виявлений в синовіальній оболонці хворих на ревматоїдний артрит поблизу фібробластів, особливо в зонах фіброзу.

У групі желатинази в хрящової тканини людини ідентифіковано лише дві - желатинази 92 кД (желатинази В, або ММП-9) і желатинази 72 кД (желатинази А, або ММП-2); у хворих на остеоартроз визначають підвищення рівня желатинази 92 кД.

Не так давно була ідентифікована ще одна група ММП, які локалізуються на поверхні клітинних мембран і називаються ММП мембранного типу (ММП-МТ). До цієї групи належать чотири ферменту - ММП-МТ1 - ММП-МТ-4. Експресія ММП-МТ виявлена в суглобовому хрящі людини. Хоча ММП-МТ-1 має властивості колагенази, обидва ферменту ММП-МТ-1 і ММП-МТ-2 здатні актівіроватьжелатіназу-72 кД і коллагеназу-3. Роль цієї групи ММП в патогенезі ОА потребує уточнень.

Протеїнази секретируются в формі зимогена, який активується іншими протеиназами або органічними сполуками ртуті. Каталітична активність ММП залежить від наявності цинку в активній зоні ферменту.

Біологічна активність ММП контролюється специфічними ТІМП. До теперішнього часу ідентифіковано три типу ТІМП, які виявляють в суглобових тканинах у людини, - ТІМП-1-ТІМП-3. Четвертий тип ТІМП ідентифікований і клонований, проте він досі не був виявлений в суглобових тканинах людини. Ці молекули специфічно зв'язуються з активним центром ММП, хоча деякі з них здатні зв'язувати активний центр прожелатінази 72 кД (ТІМП-2, -3, -4) і прожелатінази 92 кД (ТІМП-1 і -3). Дані свідчать про те, що при ОА в суглобовому хрящі існує дисбаланс між ММП та ТІМП, результатом якого є відносний дефіцит інгібіторів, що, можливо, частково пов'язане з підвищенням рівня активних ММП в тканини. ТІМП-1 і -2 виявляють в суглобовому хрящі, вони синтезуються хондроцітамі. При остеоартрозі в синовіальній оболонці і синовіальній рідині виявлено тільки перший тип ТІМП. ТІМП-3 виявляють виключно в ВКМ. ТІМП-4 майже на 50% має ідентичну амінокислотну послідовність з ТІМП-2 і-Зіна 38% - Стімпі-1. В інших клітинах-мішенях ТІМП-4 відповідальний за модуляцію активації прожелатінази 72 кД на поверхні клітин, що свідчить про важливу роль в якості тканеспеціфіческіе регулятора ремоделювання ВКМ.

Іншим механізмом контролю біологічної активності ММП є їх фізіологічна активація. Існує думка, що ферменти з сімейства серинових і цистеїнових протеаз, таких, як АП / плазмин і катепсини В відповідно, і є фізіологічними активаторами ММП. В суглобовому хрящі хворих на остеоартроз виявлено підвищений рівень урокінази (УАП) і плазміну.

Незважаючи на те, що в тканинах суглоба виявляють кілька типів катепсинов, найбільш імовірним активатором ММП в хрящі вважають катепсини-В. У тканинах суглоба людини виявлені фізіологічні інгібітори серинових і цистеїнових протеаз. Активність інгібітору АП-1 (ІАП-1), а також цистеїнових протеаз знижена у хворих на остеоартроз. Аналогічно ММП / ТІМП - саме дисбалансом між серинові і цистеїнових протеазами і їх інгібіторами можна пояснити підвищену активність ММП в суглобовому хряші хворих на остеоартроз. Крім того, ММП здатні активувати один одного. Наприклад, стромелизин-1 активує коллагеназу-1, коллагеназу-3 і желатинази 92 кД; коллагеназа-3 активує желатинази 92 кД; ММП-МТ активує коллагеназу-3, а желатинази-72 кД потенциирует цю активацію; ММП-МТ також активує желатинази 72 кД. Цитокіни можна розділити на три групи - деструктивні (провос-палітельние), регуляторні (в тому числі протизапальні) і анаболічні (фактори росту).

Типи цитокінів (по van den Berg WB et al)

Деструктивні	Інтерлейкін-1 ФНО-а Лейкемічний інгібуючий фактор Інтерлейкін-17
Регуляторні	Інтерлікін-4 Інтерлейкін-10 Інтерлейкін-13 Інгібітори ферментів
Анаболічні	Мнсуліноподобние фактори росту ТФР-б Кісткові морфогенетичні білки Морфогенетические білки, отримані з хряща

Деструктивні цитокіни, зокрема ІЛ-1, індукують збільшення вивільнення протеаз і пригнічують синтез протеогліканів і колагену хондроцітамі. Регуляторні цитокіни, зокрема ІЛ-4 і -10, пригнічують продукцію ІЛ-1, збільшують продукцію антагоніста рецептора ІЛ-1 (ІЛ-1 РА) і знижують рівень і NO-синтази в хондроцитах. Таким чином, ІЛ-4 протидіє ІЛ-1 за трьома напрямками: 1) знижує продукцію, перешкоджає його ефектів, 2) збільшує продукцію основного «скавенджера» ІЛ-1РА і 3) знижує продукцію основного вторинного «мессенджера» NO. Крім того, ІЛ-4 знижує ферментативну деградацію тканини. В умовах in vivo оптимальний терапевтичний ефект досягається при комбінації ІЛ-4 і ІЛ-10. Анаболічні фактори, такі, какТФР-р і ІФР-1, реально не перешкоджають продукції або дії ІЛ-1, а проявляють протилежну активність, наприклад, стимулюють синтез протеогліканів і колагену, пригнічують активність протеаз, а ТФР- (3 ще і пригнічує вивільнення ферментів і стимулює їх інгібітори.

Прозапальні цитокіни відповідають за підвищений синтез і експресію ММП в суглобових тканинах. Вони синтезуються в синовіальній оболонці, а потім дифундують в суглобовий хрящ через синовіальну рідину. Прозапальні цитокіни активують хондроцити, які в свою чергу також здатні виробляти прозапальні цитокіни. В уражених остеоартрозом суглобах роль ефектора запалення відіграють головним чином клітини синовіальної мембрани. Саме сіновіціти макрофагального типу секретують протеази і медіатори запалення. Серед них в патогенезі остеоартрозу в найбільшій мірі «задіяні» ІЛ-ф, ФНП-а, ІЛ-6, лейкемічний інгібуючий фактор (ліф) та ІЛ-17.

Біологічно активні речовини, що стимулюють деградацію суглобного хряща при остеоартрозі

• Інтерлейкін-1
• Інтерлікін-3
• Інтерлікін-4
• ФНО-а
• Колонієстимулюючі фактори: макрофагальний (моноцитарний) і гранулоцитарно-макрофагальний
• субстанція Р
• ПГЕ ₂
• Активатори плазміногену (тканинний і урокіназного типи) і плазміну
• Металопротеази (колагенази. Елластази, стромелізіна)
• Катепсини А і В
• трилер
• бактеріальні ліпополісахариди
• Фосфоліпаза Ag

Дані літератури свідчать, що ІЛ-ip і, можливо ФНО-а, - головні медіатори деструкції суглобових тканин при остеоартрозі. Однак до сих пір не відомо, чи діють вони незалежно один від одного або між ними існує функціональна ієрархія. На моделях остеоартроз у тварин показано, що блокада ІЛ-1 ефективно запобігає деструкцію суглобового хряща, тоді як блокада ФНО-а призводить лише до ослаблення запалення в тканинах суглоба. У синовіальній мембрані, синовіальної рідини і хрящі хворих виявлені підвищені концентрації обох цитокінів. У хондроцитах вони здатні збільшувати синтез не тільки протеаз (головним чином ММП і АП), але і мінорних колагену, наприклад I і III типів, а також зменшувати синтез колагену II та IX типів і протеогліканів. Ці цитокіни також стимулюють активні форми кисню і такі медіатори запалення, як ПГЕ ₂. Результатом таких макромолекулярних змін в суглобовому хрящі при остеоартрозі є неефективність репаративних процесів, що призводить до подальшої деградації хряща.

Вищеназвані прозапальні цитокіни модулюють процеси гноблення / активації ММП при остеоартрозі. Наприклад, дисбаланс між рівнями ТІМП-1 і ММП в хрящі при остеоартрозі може опосередковано ІЛ-ip, так як дослідження in vitro продемонструвало, що підвищення концентрації ІЛ-1 бета призводить до зниження концентрації ТІМП-1 і збільшення синтезу ММП хондроцітамі. Синтез АП також модулюється ІЛ-1бета. Стимуляція in vitro хондроцитів суглобового хряща з використанням ІЛ-1 визивет дозозалежне збільшення синтезу АП і різке зниження синтезу ІАП-1. Здатність ІЛ-1 зменшувати синтез ІАП-1 і стимулювати синтез АП є потужним механізмом генерації плазміну і активації ММП. Крім того, плазмін є не тільки ферментом, що активізує інші ферменти, він також бере участь в процесі деградації хряща шляхом прямого протеолізу.

ІЛ-ip синтезується у вигляді неактивного попередника з масою 31 кД (пре-ІЛ-ip), Азат, після відщеплення сигнального пептиду, перетворюється в активний цитокин з масою 17,5 кД. У тканинах суглобів, включаючи синовіальну мембрану, синовіальнурідину і суглобовий хрящ, ІЛ-ip виявляють в активній формі, а в дослідженнях in vivo продемонстрована здатність синовіальної мембрани при остеоартрозі секретировать цей цитокін. Деякі серинові протеази здатні перетворювати пре-ІЛ-ip в його біоактивну форму. У ссавців такі властивості виявлені лише в однієї протеази, яка відноситься до родини цістеінових аспартатспеціфіческіх ферментів і називається ІЛ-1р-конвертує фермент (ІКФ, або каспаза-1). Цей фермент здатний специфічно перетворювати пре-ІЛ-ip в біологічно активний «зрілий» ІЛ-ip з масою 17,5 кД. ІКФ - це профермент з молекулярної масою 45 кД (Р45), який локалізується в клітинній мембрані. Після протеолітичного розщеплення проензиму Р45 з утворенням двох субодиниць, відомих як р10 і р20, яким властива ферментативна активність.

ФНО-а також синтезується у вигляді мембранно-зв'язаного попередника з масою 26 кД; шляхом протеолітичного відщеплення він вивільняється з клітки у вигляді активної розчинної форми з масою 17 кД. Протеолітичні відщеплення здійснюється ФНО-а-конвертує ферментом (ФНП-КФ), який відноситься до родини адамалізінов. AR Amin і співавтори (1997) виявили підвищену експресію мРНК ФНП-КФ в суглобовому хрящі хворих на остеоартроз.

Біологічна активація хондроцитов і сіновіцітов ІЛ-1 і ФНП-а опосередковується зв'язуванням зі специфічними рецепторами на поверхні клітин - ІЛ-Р і ФНО-Р. Для кожного цитокіну ідентифіковано два типи рецепторів - ІЛ-IP I і II типів і ФНО-Р I (р55) і II (р75) типів. За передачу сигналів в клітинах тканин суглобів відповідають ІЛ-1PI і р55. ІЛ-1Р I типу має дещо більшою афінності до ІЛ-1бета, ніж до ІЛ-1а; ІЛ-1Р II типу - навпаки, має більшу спорідненість до ІЛ 1а, ніж до ІЛ ip. До сих пір залишається неясним, чи може ІЛ-IP II типу опосредовать сигнали ІЛ-1 або він служить тільки для конкурентного гальмування зв'язку ІЛ-1 з ІЛ-1РI типу. У хондроіітах і синовіальних фибробластах хворих на остеоартроз виявляють велику кількість ІЛ-1PI і р55, що в свою чергу пояснює високу чутливість цих клітин до стимуляції відповідними цитокінами. Цей процес призводить як до підвищення секреції протеолітичних ферментів, так і до деструкції суглобового хряща.

Не виключається участь ІЛ-6 в патологічному процесі при остеоартрозі. В основі цього припущення лежать наступні спостереження:

• ІЛ-6 збільшує кількість клітин запалення в синовіальній мембрані,
• ІЛ -6 стимулює проліферацію хондроцитів,
• ІЛ-6 підсилює ефекти ІЛ-1 щодо підвищення синтезу ММП і пригнічення синтезу протеогліканів.

Однак ІЛ-6 здатний індукувати продукцію ТІМП, але не впливає на продукцію ММП, тому вважають, що саме цей цитокін бере участь в процесі стримування протеолітичної деградації суглобового хряща, який здійснюється за механізмом зворотного зв'язку.

Ще одним представником сім'ї ІЛ-6 є Ліф - цитокін, який виробляється хондроцітамі, отриманими від хворих на остеоартроз, у відповідь на стимуляцію прозапальних цитокінів ІЛ-ip і ФНО-а. Л ІФ стимулює резорбцію протеогліканів хряща, а також синтез ММП і продукцію NO. Роль цього цитокіну при остеоартрозі остаточно не з'ясована.

ІЛ-17 - гомодимер масою 20-30 кД, що володіє ІЛ-1-подібним дією, проте значно менш вираженим. ІЛ-17 стимулює синтез і виділення ряду прозапальних цитокінів, в їх числі ІЛ-ip, ФНП-а, ІЛ-6, а також ММП в клітинах-мішенях, наприклад в макрофагах людини. Крімтого, ІЛ-17 стимулює продукцію NО хондроцітамі. Подібно ліф, роль ІЛ-17 в патогенезі ОА мало вивчена.

Неорганічний вільний радикал NО грає важливу роль в деградації суглобового хряща при ОА. Хондроцити, отримані від хворих на остеоартроз, виробляють більшу кількість NО як спонатанно, так і після стимуляції прозапальних цитокінів в порівнянні з нормальними клітинами. Високий вміст NO виявлено в синовіальній рідині і сироватці крові хворих на остеоартроз - це результат збільшення експресії і синтезу індукованої NO-синтази (hNOC) - ферменту, відповідального за продукцію NO. Нещодавно була клонована ДНК хондроцітспеціфіческой hNOC, визначена амінокислотна послідовність ферменту. Амінокислотна послідовність вказує на 50% ідентичність і 70% схожість з hNOC, специфічною для ендотелію і нервової тканини.

NO пригнічує синтез макромолекул ВКМ суглобового хряща і стимулює синтез ММП. Більш того, збільшення продукції NО супроводжується зниженням синтезу антагоніста ІЛ-IP (ІЛ-1РА) хондроцітамі. Таким чином, підвищення рівня ІЛ-1 і зниження - ІЛ-1 РА призводить до гіперстимуляції NО хондроцитов, що в свою чергу веде до посилення деградації хрящового матриксу. Є повідомлення про терапевтичному ефекті in vivo селективного інгібітора hNOC щодо прогресування експериментального остеоартрозу.

Природні інгібітори цитокінів здатні безпосередньо перешкоджати зв'язуванню цитокінів з рецепторами клітинних мембран, знижуючи їх прозапальну активність. Природні інгібітори цитокінів можна розділити на три класи за способом їх дії.

До першого класу інгібіторів відносять антагоністи рецепторів, які перешкоджають зв'язуванню ліганда з його рецептором шляхом конкуренції за що зв'язує центр. До теперішнього часу такий інгібітор знайдений тільки для ІЛ-1 - це вищезгаданий конкурентний інгібітор системи ІЛ-1 / ІЛIP ІЛ-1 PA. ІЛ-1 РА блокує багато ефекти, які спостерігаються в тканинах суглобів при остеоартриті, включаючи синтез простагландинів синовіальними клітинами, продукцію колагенази хондроцітамі і деградацію В КМ суглобового хряща.

ІЛ-1РА виявляють в різних формах - однієї розчинної (рІЛ-1РА) і двох міжклітинних (мкІЛ-lPAI і мкІЛ-1РАП). Афінність розчинної форми ІЛ-1РА в 5 разів перевищує таку у міжклітинних форм. Незважаючи на інтенсивний науковий пошук, функція останніх залишається невідомою. Експерімет in vitro показали, що для пригнічення активності ІЛ-1бета необхідна концентрація ІЛ-1РА, в 10-100 разів перевищує норму, в умовах in vivo потрібне тисячократно підвищення концентрації ІЛ-1РА. Цей факт може частково пояснити відносний дефіцит ІЛ-1 РА і надлишок ІЛ-1 в синовії хворих на остеоартроз.

Другий клас природних інгібіторів цитокінів представлений розчинними рецепторами цитокінів. Прикладом таких інгібіторів у людини, що мають відношення до патогенезу остеоартроу, є рІЛ-1Р і рр55. Розчинні рецептори цитокінів є укорочені форми нормальних рецепторів, зв'язуючись з цитокінами, вони перешкоджають їх зв'язування з мембранно-асоційованими рецепторами клітин-мішеней, діючи за механізмом конкурентного антагонізму.

Основним попередником розчинних рецепторів є мембранно-зв'язані ІЛ-1рП. Афінність рІЛ-IP по відношенню до ІЛ-1 і ІЛ-1 РА різна. Так, рІЛ-1РН має більшу спорідненість до ІЛ-1 р, ніж до ІЛ-1 РА, а рІЛ-1PI - проявляє велику афінність до ІЛ-1РА, ніж до ІЛ-ip.

Для ФНП також існують два типи розчинних рецепторів - рр55 і рр75, як і розчинні рецептори ІЛ-1, вони утворюються шляхом «шеддінга» (скидання). В умовах in vivo обидва рецептора виявляють в тканинах уражених суглобів. Роль розчинних рецепторів ФНП в патогенезі остеоартрозу дискутується. Припускають, що в низьких концентраціях вони стабілізують тривимірну структуру ФНО і підвищують період напіввиведення биоактивного цитокина, тоді як високі концентрації рр55 і рр75 можуть знижувати активність ФНП шляхом конкурентного антагонізму. Ймовірно, рр75 може виступати як переносник ФНП, полегшуючи його зв'язування з мембранно-асоційованим рецептором.

Третій клас природних інгібіторів цитокінів представлений групою протизапальних цитокінів, до яких відносять ТФР-бета, ІЛ-4, ІЛ-10 та ІЛ-13. Протизапальні цитокіни знижують продукцію прозапальних, а також деяких протеаз, стимулюють продукцію ІЛ-1РА і ТІМП.