Роль відкладення кристалів у патогенезі остеоартрозу

Кристали основного фосфату кальцію (ОФК) виявляються в синовіальній рідині 30-60% пацієнтів з остеоартритом. За даними А. Свана та ін. (1994), кристали, що містять кальцій, виявляються в синовіальній рідині значно більшої кількості пацієнтів з остеоартритом; однак через надзвичайно малий розмір кристалів або їх невелику кількість вони не ідентифікуються за допомогою звичайних методів. Наявність кристалів ОФК у синовіальній рідині корелює з рентгенологічними ознаками дегенерації суглобового хряща та пов'язана з більшим об'ємом випоту порівняно з випотом у колінних суглобах без кристалів. Дослідження факторів, що впливають на рентгенографічне прогресування гонартрозу, показало, що відкладення кристалів дигідрату пірофосфату кальцію (ОПФК) є предиктором несприятливого клінічного та рентгенологічного результату. У дослідженні пацієнтів похилого віку було виявлено, що остеоартрит пов'язаний з хондрокальцинозом, особливо в латеральному великогомілковому відділі коліна та перших трьох п'ястно-фалангових суглобах. Нерідко у пацієнтів з остеоартритом виявляються обидва типи кристалів, OFC та PFC.

Клінічно дегенерація суглобового хряща, спричинена відкладенням кристалів кальцію, відрізняється від тієї, що спостерігається при первинному остеоартрозі. Якби кристали були простим епіфеноменом дегенерації хряща, вони б виявлялися в суглобах, які найчастіше уражаються первинним остеоартрозом, тобто колінних, стегнових та дрібних суглобах кистей. Навпаки, захворювання, пов'язані з відкладенням кристалів, найчастіше вражають суглоби, нетипові для первинного остеоартрозу, такі як плечовий, зап'ястний та ліктьовий. Наявність кристалів у суглобовій (випотній) рідині пов'язана з більш тяжкою дегенерацією суглобового хряща. Питання про те, що є причиною, а що наслідком, відкладення кристалів чи дегенерація хряща, є предметом дискусій. Проміжне положення займає таке припущення: первинна аномалія в метаболізмі хряща призводить до його дегенерації, а вторинне відкладення кристалів прискорює його деградацію (так звана теорія петлі ампліфікації).

Точний механізм пошкодження кристалами кальцію суглобового хряща невідомий, коротко описаний нижче. Теоретично, кристали кальцію можуть безпосередньо пошкоджувати хондроцити. Однак гістологічне дослідження рідко виявляє кристали поблизу хондроцитів, і ще рідше вони ними поглинаються. Найбільш імовірним механізмом є фагоцитоз кристалів клітинами синовіальної оболонки з подальшим вивільненням протеолітичних ферментів або секрецією цитокінів, що стимулюють вивільнення ферментів хондроцитами. Цю концепцію підтверджує дослідження ролі синовіту, індукованого PFKD, у розвитку швидко прогресуючого остеоартриту при пірофосфатній артропатії. У цьому дослідженні кристали дигідрату пірофосфату кальцію (1 або 10 мг) щотижня вводили в праве коліно кроликів з остеоартритом, викликаним частковою латеральною меніскектомією. Виявилося, що після 8 ін'єкцій правий колінний суглоб показав значно серйозніші зміни порівняно з лівим. Інтенсивність синовіального запалення корелювала з внутрішньосуглобовими ін'єкціями кристалів дигідрату пірофосфату кальцію та їх дозою. Незважаючи на те, що дози кристалів CPPD, використані в цьому дослідженні, перевищують дози in vivo, результати вказують на роль запалення, індукованого CPPD, у прогресуванні остеоартриту при пірофосфатній артропатії.

Потенційні механізми індукції пошкодження суглобового хряща кристалами, що містять кальцій, пов'язані з їхніми мітогенними властивостями, здатністю індукувати ММП та стимулювати синтез простагландинів.

Мітогенний ефект кристалів, що містять кальцій. При артропатіях, пов'язаних з кристалами, часто спостерігається проліферація клітин синовіальної оболонки, причому самі кристали лише частково відповідають за цей процес. Збільшення кількості синовіальних клітин супроводжується підвищеною секрецією цитокінів, які сприяють хондролізу та індукують секрецію протеолітичних ферментів. Кристали OFC у концентраціях, що зустрічаються при патології суглобів людини, дозозалежно стимулюють мітогенез культур фібробластів шкіри у стані спокою та синовіальних фібробластів собак і мишей. Кристали дигідрату, урату, сульфату, карбонату та фосфату кальцію пірофосфату стимулюють ріст клітин. Початок та пік включення ( ^3H )-тимідину, індуковані цими кристалами, зміщуються на 3 години порівняно зі стимуляцією клітин сироваткою крові. Цей період часу може бути необхідним для фагоцитозу та розчинення кристалів. Додавання контрольних кристалів того ж розміру (наприклад, алмазного пилу або частинок латексу) не стимулювало мітогенез. Кристали моногідрату урату натрію мали слабкі мітогенні властивості та значно поступалися властивостям урата кальцію, що вказує на важливість вмісту кальцію в кристалах у мітогенезі. Синтетичні кристали OFC мали такі ж мітогенні властивості, як і кристали, отримані від пацієнтів з хондрокальцинозом. Мітогенний ефект кристалів, що містять кальцій, не був результатом збільшення вмісту кальцію в навколишньому поживному середовищі in vitro, оскільки розчинення основних кристалів фосфату кальцію в поживному середовищі не стимулювало включення ( ^3H )-тимідину фібробластами.

Один із запропонованих механізмів мітогенезу, індукованого OFC, полягає в тому, що аномальна проліферація синовіальних клітин може бути зумовлена, принаймні частково, ендоцитозом та внутрішньоклітинним розчиненням кристалів, що збільшує цитоплазматичну концентрацію Ca2 ⁺ та активує кальцій-залежний шлях, що веде до мітогенезу. Ця концепція підтверджується вимогою прямого контакту клітини з кристалами для стимуляції мітогенезу, оскільки вплив кристалів на клітинні культури індукував ріст клітин, тоді як вплив клітин, позбавлених такого контакту, - ні. Для вивчення вимоги до фагоцитозу кристалів після взаємодії клітини з кристалами клітини культивували з ⁴⁵ Ca-OPC та ( ^3H )-тимідином. Було виявлено, що клітини, що містять ⁴⁵ Ca-OPC, включали значно більше ( ^3H )-тимідину, ніж клітини без мічення основним фосфатом кальцію. У культурах макрофагів інгібування ендоцитозу кристалів цитохалазином призводило до інгібування розчинення кристалів, що ще раз підкреслює необхідність фагоцитозу.

Кристали, що містять кальцій, розчинні в кислоті. Після фагоцитозу кристали розчиняються в кислому середовищі фаголізосом макрофагів. Хлорохін, хлорид амонію, бафіломіцин А1 та всі лізосомотропні агенти, що підвищують pH лізосом, дозозалежно пригнічують внутрішньоклітинне розчинення кристалів та поглинання (3H)-тимідину ^у фібробластах, культивованих з основними кристалами фосфату кальцію.

Додавання кристалів OFC до моношарової культури фібробластів викликало негайне десятикратне збільшення внутрішньоклітинного кальцію, яке повернулося до вихідного рівня через 8 хвилин. Джерелом кальцію був переважно позаклітинний іон, оскільки основні кристали фосфату кальцію були додані до середовища для культивування без кальцію. Наступне збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію спостерігалося через 60 хвилин і тривало щонайменше 3 години. Тут джерелом кальцію були фагоцитовані кристали, розчинені у фаголізосомах.

Було виявлено, що мітогенний ефект кристалів OFC подібний до ефекту PDGF як фактора росту; подібно до останнього, кристали OFC демонструють синергізм з IGF-1 та плазмою крові. Блокування IGF-1 знижує мітогенез клітин у відповідь на OFC. П. Г. Мітчелл та ін. (1989) показали, що індукція мітогенезу у фібробластах Balb/c- _{3 T3кристалами} OFC вимагає присутності серин/треонінової протеїнкінази C (PKC), одного з основних медіаторів сигналів, що генеруються під час зовнішньої стимуляції клітин гормонами, нейромедіаторами та факторами росту. Зниження активності PKC у клітинах Balb/c-3 T3 _{пригнічуєOFC} -опосередковану індукцію протоонкогенів c-fos та c-myc, але не впливає на стимуляцію цих онкогенів, опосередковану PDGF.

Збільшення внутрішньоклітинного кальцію після розчинення фагоцитованих кристалів не є єдиним сигнальним шляхом мітогенезу. Коли фактори росту, такі як PDGF, зв'язуються зі своїм мембранним рецептором, стимулюється фосфоліпаза С (фосфодіестераза), яка гідролізує фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфат з утворенням внутрішньоклітинних месенджерів інозитол-3-фосфату та діацилгліцерину. Перший вивільняє кальцій з ендоплазматичного ретикулуму, модулюючи активність кальцій-залежних та кальцій/кальмодулін-залежних ферментів, таких як протеїнкінази та протеази.

Р. Ротенберг та Х. Чеунг (1988) повідомили про посилення деградації фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату фосфоліпазою С у синовіальних клітинах кроликів у відповідь на стимуляцію кристалами OFC. Останні значно збільшили вміст інозитол-1-фосфату в клітинах з міченим ( ^3H )-інозитолом; пік досягався протягом 1 хвилини та зберігався близько 1 години.

Діацилгліцерол є потенційним активатором дигідрату пірофосфату кальцію. Оскільки кристали OFC збільшують активність фосфоліпази C, що призводить до накопичення діацилгліцерину, отже, можна очікувати збільшення активації PKC. П. Г. Мітчелл та ін. (1989) порівнювали вплив кристалів OFC та PDGF на синтез ДНК _{фібробластами Balb/c-3T3}. У клітинній культурі PKC інактивували шляхом інкубації клітин з форболовим діестером (TPD), аналогом діацилгліцерину, що підтримує пухлину. Тривала стимуляція низькими дозами TPD знижувала активність PKC, тоді як одноразова стимуляція високою дозою активувала її. Стимуляція синтезу ДНК кристалами OFC пригнічувалася після інактивації PKC, що вказує на важливість цього ферменту в мітогенезі, індукованому OFC. Раніше Г. М. Маккарті та ін. (1987) продемонстрували зв'язок між мітогенною реакцією фібробластів людини на кристали OFC та активацією PKC. Однак кристали OFC не активують фосфатидилінозитол-3-кіназу або тирозинкінази, що підтверджує селективність механізму активації клітин кристалами OFC.

Проліферація клітин контролюється групою генів, які називаються протоонкогенами. Білки foe та mye, продукти протоонкогенів c-fos та c-myc, локалізовані в ядрі клітини та зв'язані зі специфічними послідовностями ДНК. Стимуляція фібробластів 3T3 кристалами OFC призводить до експресії c-fos протягом кількох хвилин, яка досягає максимуму через 30 хвилин після стимуляції. Індукція транскрипції c-myc кристалами OFC або PDGF відбувається протягом 1 години та досягає максимуму через 3 години після стимуляції. Клітини підтримують підвищений рівень транскрипції c-fos та c-myc протягом щонайменше 5 годин. У клітинах з інактивованою PCD стимуляція c-fos та c-myc кристалами OFC або TFD значно пригнічується, тоді як індукція цих генів PDGF не змінюється.

Члени родини мітоген-активованих протеїнкіназ (MAP K) є ключовими регуляторами різних внутрішньоклітинних сигнальних каскадів. Один підклас цієї родини, p42/p44, регулює проліферацію клітин через механізм, що включає активацію протоонкогенів c-fos та c-jun. Кристали OFC та PFKD активують сигнальний шлях протеїнкінази, який включає як p42, так і p44, що свідчить про роль цього шляху в мітогенезі, індукованому кристалами, що містять кальцій.

Зрештою, мітогенез, індукований OFC, включає ядерний фактор транскрипції κB (NF-κB), який вперше був описаний як ген легкого ланцюга імуноглобуліну κ (IgK). Це індукований фактор транскрипції, важливий у багатьох сигнальних шляхах, оскільки він регулює експресію різних генів. Індукція NF-κB зазвичай поєднується з вивільненням інгібіторних білків, які називаються IκB, з цитоплазми. Індукція NF-κB супроводжується транслокацією активного фактора транскрипції до ядра. Кристали OFC індукують NF-κB у фібробластах Balb/c- _3T3 та фібробластах шкіри людини.

Кілька шляхів можуть бути задіяні в передачі сигналу після активації NF-κB, але всі вони включають протеїнкінази, які фосфорилюють (і таким чином деградують) IκB. На основі досліджень in vitro раніше вважалося, що IκB служить субстратом для кіназ (наприклад, PKC та протеїнкінази A). Однак нещодавно було ідентифіковано комплекс кінази IκB з великою молекулярною масою. Ці кінази специфічно фосфорилюють серинові залишки IκB. Активація NF-κB за допомогою TNF-α та IL-1 вимагає ефективної дії NF-κB-індукуючої кінази (NIK) та IκB-кінази. Молекулярний механізм активації NIK наразі невідомий. Хоча кристали OFC активують як PKC, так і NF-κB, ступінь, до якої ці два процеси можуть бути пов'язані, невідома. Оскільки модифікація GκB-кінази відбувається через фосфорилювання, роль PKC в індукції NF-κB кристалами OFC через фосфорилювання та активацію GκB-кінази не можна виключити. Цю концепцію підтверджує пригнічення мітогенезу, індукованого кристалами OFC, та експресії NF-κB інгібітором PKC ставроспорином. Аналогічно, ставроспорин може пригнічувати кіназу GκB, і таким чином пригнічує протеїнкіназу А та інші протеїнкінази.

Таким чином, механізм мітогенезу, індукованого кристалами OFC, у фібробластах включає щонайменше два різні процеси:

• швидка мембранозв'язана подія, що призводить до активації PKC та MAP K, індукції NF-κB та протоонкогенів,
• повільніше внутрішньоклітинне розчинення кристалів, що призводить до збільшення внутрішньоклітинного вмісту Ca2 ⁺, а потім до активації низки кальційзалежних процесів, що стимулюють мітогенез.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Індукція кристалами, що містять MMP-кальцій

Медіаторами пошкодження тканин кристалами, що містять кальцій, є ММП – колагеназа-1, стромелізин, желатиназа 92 кДа та колагеназа-3.

Враховуючи зв'язок між вмістом кристалів OFC та руйнуванням тканин суглобів, була висунута гіпотеза про те, що кристали OFC та, можливо, деякі колагени фагоцитуються синовіальними клітинами. Стимульовані синовоцити проліферують та секретують протеази. Цю гіпотезу було перевірено in vitro шляхом додавання природних або синтетичних кристалів OFC, PFCD та інших до культивованих синовоцитів людини або собак. Активність нейтральних протеаз та колагеназ зростала дозозалежно та була приблизно в 5-8 разів вищою, ніж у контрольній культурі клітин, вирощеній без кристалів.

У клітинах, культивованих у середовищі, що містить кристали, було виявлено коіндукцію мРНК колагенази-1, стромелізину та желатинази-92 кДа, а потім секрецію ферментів у середовище.

Кристали OFC також індукували накопичення мРНК колагенази-1 та колагенази-2 у зрілих хондроцитах свиней, після чого відбувалася секреція ферментів у середовище.

Г. М. Маккарті та ін. (1998) вивчали роль внутрішньоклітинного розчинення кристалів у кристалоіндукованому виробленні ММП. Підвищення pH лізосом за допомогою бафіломіцину А пригнічувало внутрішньоклітинне розчинення кристалів, а також послаблювало проліферативну відповідь фібробластів людини на кристали OFC, але не пригнічувало синтез та секрецію ММП.

Ні основний фосфат кальцію, ні кристали PFCD не індукували продукцію IL-1 in vitro, але кристали урату натрію це зробили.

Сучасні дані чітко вказують на пряму стимуляцію продукції ММП фібробластами та хондроцитами при контакті з кристалами, що містять кальцій.

Симптоми остеоартриту вказують на значну роль ММП у прогресуванні захворювання. Наявність кристалів, що містять кальцій, посилює дегенерацію тканин уражених суглобів.

Стимуляція синтезу простагландинів

Поряд зі стимуляцією росту клітин та секрецією ферментів, кристали, що містять кальцій, викликають вивільнення простагландинів з культур клітин ссавців, особливо ПГЕ2 _. Вивільнення ПГЕ2 _у всіх випадках відбувається протягом першої години після впливу кристалів на клітини. Р. Ротенберг (1987) визначив, що основними джерелами арахідонової кислоти для синтезу ПГЕ2 _є фосфатидилхолін та фосфатидилетаноламін, а також підтвердив, що фосфоліпаза А2 _та NOX є домінуючими шляхами _{продукування} ПГЕ2.

ПГЕ1 також може вивільнятися у відповідь на кристали OFA. Г. М. Маккарті та ін. (1993, 1994) вивчали вплив ПГЕ2 _, ПГЕ та його аналога мізопростолу на мітогенну відповідь фібробластів людини на кристали OFA. Всі три агенти пригнічували мітогенну відповідь дозозалежним чином, причому ПГЕ та мізопростол проявляли більш виражену інгібуючу активність. ПГЕ2 та мізопростол, але не ПГЕ2 _, пригнічували накопичення мРНК колагенази у відповідь на кристали OFA.

М. Г. Маккарті та Х. Чеунг (1994) досліджували механізм активації клітин, опосередкованої кристалами OFC, за допомогою PGE. Автори показали, що PGE, потужніший індуктор внутрішньоклітинного цАМФ, ніж PGE2 _та PGE, пригнічує індукований OFC мітогенез та продукцію MMP через цАМФ-залежний шлях передачі сигналу. Можливо, що збільшення продукції PGE, індуковане кристалами OFC, послаблює їхні інші біологічні ефекти (мітогенез та продукцію MMP) через механізм зворотного зв'язку.

Запалення, викликане кристалами

Кристали, що містять кальцій, часто виявляються в синовіальній рідині пацієнтів з остеоартрозом, проте епізоди гострого запалення з лейкоцитозом трапляються рідко як при остеоартрозі, так і при артропатіях, пов'язаних з кристалами (наприклад, синдром плеча Мілуоккі). Флогістичний потенціал кристалів може бути модифікований низкою інгібіторних факторів. Р. Теркельтауб та ін. (1988) продемонстрували здатність сироватки крові та плазми суттєво пригнічувати реакцію нейтрофільних гранулоцитів на кристали основного фосфату кальцію. Факторами, що викликають таке пригнічення, є кристалозв'язуючі білки. Дослідження одного з цих білків, ₂ -HS глікопротеїну (AHSr), показало, що AHSr є найпотужнішим та специфічним інгібітором реакції нейтрофільних гранулоцитів на кристали OFC. AHSr - це сироватковий білок печінкового походження; відомо, що порівняно з іншими сироватковими білками він міститься у відносно високих концентраціях у кістковій та мінералізуючій тканинах. Крім того, AHSr присутній у "незапаленій" синовіальній рідині, а також був виявлений на кристалах основного фосфату кальцію в нативній синовіальній рідині. Таким чином, не можна виключати можливість модуляції AHSr флогогенного потенціалу основних кристалів фосфату кальцію in vivo.

Підсумовуючи все вищесказане, наведемо дві схеми патогенезу остеоартриту, запропоновані WB van den Berg et al. (1999) і M. Carrabba et al. (1996), які поєднують механічні, генетичні та біохімічні фактори.