Роль відкладення кристалів в патогенезі остеоартрозу

У 30-60% хворих на остеоартроз виявляють кристали основного фосфату кальцію (ОФК) в суглобової рідини. На думку A. Swan і співавторів (1994), кальцій кристали знаходяться в суглобової рідини у набагато більшої кількості хворих на остеоартроз, однак через надмірно дрібних розмірів кристалів або їх малу кількість вони не ідентифікуються за допомогою загальноприйнятих методик. Наявність кристалів основного фосфату кальцію в суглобової рідини корелює з рентгенологічними ознаками дегенерації суглобового хряща і асоціюється з великим об'ємом випоту в порівнянні з випотом в колінних суглобах без кристалів. Вивчення факторів, що впливають на рентгенологічне прогресування гонартрозу, показало, що відкладення кристалів пірофосфату кальцію дигідрату (ПФКД) є предиктором несприятливого клінічного і рентгенологічного результату. При дослідженні пацієнтів похилого віку виявили, що остеоартроз асоціюється з хондрокальциноз, особливо в латеральному тібіофеморальном відділі колінного суглоба і в перших трьох п'ястно-фалангових суглобах. Нерідко у хворих на остеоартроз виявляють обидва типи кристалів - ОФК і ПФКД.

Клінічно дегенерація суглобового хряща, обумовлена відкладенням кальцийсодержащих кристалів, відрізняється від такої при первинному остеоартрозі. Якби кристали були простим епіфеноменом дегенерації хряща, їх виявляли б в суглобах, які найчастіше уражаються первинним остеоартрозом, тобто в колінних, тазостегнових, дрібних суглобах кистей. Навпаки, хвороби відкладення кристалів частіше вражають нетипові для первинного остеоартрозу суглоби - плечові, променевозап'ястні, ліктьові. Наявність кристалів в суглобової (випітної) рідини асоціюється з більш важкої дегенерацією суглобового хряща. Обговорюється питання про те, що є причиною, а що наслідком - відкладення кристалів або дегенерація хряща. Проміжну позицію займає наступне припущення: первинна аномалія метаболізму хряща веде до його дегенерації, а вторинне відкладення кристалів прискорює його деградацію (так звана теорія ампліфікаціонних петлі).

Точний механізм пошкодження суглобового хряші кальцийсодержащими кристалами ніхто не знає, його окремі елементи приведені нижче. Теоретично кальцій кристали можуть безпосередньо ушкоджувати хондроцити. Однак під час гістологічного дослідження кристали рідко локалізуються поблизу хондроцитов, ще рідше поглинаються ними. Найбільш вірогідним є фагоцитоз кристалів клітинами синовіальної вистилання з подальшим виділенням ними протеолітичних ферментів або секрецією цитокінів, що стимулюють виділення ферментів хондроцітамі. Ця концепція підтверджується дослідженням ролі ПФКД-індукованого синовіту в розвитку швидко прогресуючого остеоартрозу при пірофосфатной артропатии. В ході цього дослідження кроликам на остеоартроз, індукованим часткової латеральної меніскектомія, в правий колінний суглоб вводили кристали пірофосфату кальцію дигідрату (1 або 10 мг) 1 раз на тиждень. Виявилося, що після 8 ін'єкцій в правому колінному суглобі були значно більш серйозні зміни в порівнянні з лівим. Інтенсивність синовиального запалення корелювала з внутрішньосуглобових ін'єкціями кристалів пірофосфату кальцію дигідрату і їх дозою. Незважаючи на те, що використані в даному дослідженні дози кристалів ПФКД перевищують такі in vivo, результати свідчать про роль ПФКД-індукованого запалення в прогресуванні остеоартрозу при пірофосфатной артропатии.

Потенційні механізми індукування кальцийсодержащими кристалами пошкодження суглобового хряща пов'язані з їх мітогеном властивостями, здатністю індукувати ММП і стимулювати синтез простагландинів.

Мітогенний ефект кальцийсодержащих кристалів. При крісталлас-соціірованних артропатиях часто виявляють проліферацію клітин синовіальної вистилання, причому самі кристали лише частково відповідальні за цей процес. Збільшення кількості синовіальних клітин супроводжується посиленням секреції цитокінів, які сприяють хондроліз і викликають секрецію протеолітичних ферментів. Кристали ОФК в концентраціях, які виявляються при патології суглобів у людини, дозозависимо стимулюють мітогенез культури покояться фібробластів шкіри, синовіальних фібробластів собак і мишей. Кристали пірофосфату кальцію дигідрату, урата, сульфату, карбонату і чи фосфату кальцію стимулюють ріст клітин. Початок і пік включення ( ³ Н) -тімідіна, індуковані цими кристалами, зміщені на 3 год в порівнянні зі стимуляцією клітин сироваткою крові. Можливо, цей відрізок часу необхідний для фагоцитозу і розчинення кристалів. Додавання контрольних кристалів того ж розміру (наприклад, діамантового пилу або частинок латексу) не стимулювала мітогенез. Кристали урати натрію моногідрату володіли слабкими мітогеном властивостями і значно поступалися таким урата кальцію, що свідчить про важливе значення в мітогенез вмісту кальцію в кристалах. Синтетичні кристали ОФК володіли такими ж мітогеном властивостями, як і кристали, отримані від пацієнтів з хондрокальциноз. Мітогенний ефект кальцийсодержащих кристалів ні результатом підвищення вмісту кальцію в навколишньому клітку живильному середовищі in vitro, так як при розчиненні кристалів основного фосфату кальцію в живильному середовищі не стимулювало включення ( ³ Н) -тімідіна фибробластами.

Одним з імовірних механізмів ОФК-індукованого мито-генезу є наступний: аномальна проліферація синовіальних клітин може бути пов'язана (принаймні частково) з ендоцитозу і внутрішньоклітинним розчиненням кристалів, що призводить до підвищення концентрації Са ²⁺ в цитоплазмі клітин і до активації кальційзалежних шляху, що веде до мітогенез. На підтримку цієї концепції виступає необхідність прямого контакту клітина - кристал для стимуляції мітогенез, так як експозиція культури клітин кристалів викликала зростання клітин, а експозиція клітин, позбавлених можливості такого контакту, не викликало їх зростання. Для вивчення необхідності фагоцитозу кристалів, наступного за взаємодією клітина - кристал, клітини культивували з ⁴⁵ Са-ОФК і ( ³ Н) -тімідіном. Виявилося, що містять ⁴⁵ Са-ОФК клітини включали набагато більшу кількість ( ³ Н) -тімідіна, ніж клітини без мічених основним фосфатом кальцію. У культурі макрофагів пригнічення цитохалазином ендоцитозу кристалів викликало інгібіцію розчинення кристалів, що також підкреслює необхідність фагоцитозу.

Кальцій кристали розчиняються в кислоті. Після фагоцитозу кристали розчиняються в кислому середовищі фаголізосом макрофагів. Хлорохін, амонію хлорид, бафіломіцін А1 і все лізосомотрофние агенти, що підвищують лізосомальних рН, дозозависимо пригнічують внутрішньоклітинний розчинення кристалів і поглинання ( ³ Н) -тімідіна в фибро-бластах, культивованих з кристалами основного фосфату кальцію.

Додавання ОФК-кристалів до монослойной культурі фібробластів викликало негайне десятикратне підвищення вмісту внутрішньоклітинного кальцію, яке повернулося до вихідного рівня через 8 хв. Джерелом кальцію переважно був позаклітинний іон, так як кристали основного фосфату кальцію були додані в бескальциевом живильне середовище. Наступне підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію спостерігалося через 60 хв і тривало не менше 3 ч. Тут джерелом кальцію були фагоцитовані кристали, розчинені в фаголізосомах.

Встановлено, що мітогенний ефект ОФК-кристалів схожий на такий у ФРПТ як фактора росту; подібно до останнього, ОФК-кристали проявляють синергізм по відношенню до ІФР-1 і плазмі крові. Блокада ІФР-1 знижує мітогенез клітин у відповідь на ОФК. PG Mitchell і співавтори (1989) показали, що індукція ОФК-кристалами мітогенез фібробластів Balb / c- ₃ T ₃ вимагає наявності серинових / треонінових протеїнкінази С (ПКС) - одного з головних медіаторів сигналів, генерованих при зовнішній стимуляції клітин гормонами, нейротрансмиттерами і факторами зростання. Зниження активності ПКС в клітинах Balb / c- ₃ T ₃ пригнічує ОФК-опосередковану індукцію протоонкогенов c-fos і з-тус, але не впливає на стимуляцію цих онкогенів, опосередковану ФРПТ.

Підвищення змісту внутрішньоклітинного кальцію після розчинення фагоцитованих кристалів - не єдиний сигнальний шлях для мітогенез. Коли фактори росту, такі, як ФРПТ, зв'язуються зі своїм мембранним рецептором, стимулюється фосфоліпаза С (фосфо-діестераза), яка гідролізіруетфосфатіділінозітол 4,5-бісфосфат з утворенням внутрішньоклітинних месенджерів - інозитол-3-фосфату ідіацілгліцерола. Перший вивільняє кальцій з ендоплазматичної мережі, модулюючи активність кальційзалежних і кальцій / кальмодулінзавісімих ферментів, таких, як протеїнкінази і протеази.

R. Rothenberg і Н. Cheung (1988) повідомили про підвищену деградації фосфолипазой З фосфатидилинозитола 4,5-біфосфату в синовіальних клітинах кроликів у відповідь на стимуляцію ОФК-кристалами. Останні значно підвищують вміст инозитол-1-фосфату в клітинах з міченим ( ³ Н) -інозітолом; пік досягався протягом 1 хв і зберігався близько 1 ч.

ДІАЦ-гліцерин - потенційний активатор пірофосфату кальцію дигідрату. Так як ОФК-крістатли підвищують активність фосфоліпази С, що веде до акумуляції діацілгліцерола, отже, можна очікувати підвищення активації ПКС. PG Mitchell і співавтори (1989) порівнювали вплив ОФК-кристалів і ФРПТ на синтез ДНК фибробластами Balb / c- ₃ T ₃. У культурі клітин ПКС була інактивована инкубацией клітин з туморподцержівающім форболовим діефір (ТФД), аналогом діацілгліцерола. Тривала стимуляція низькими дозами ТФД знижує активність ПКС, тоді як одноразова стимуляція високою дозою - активує. Стимуляція ОФК-кристалами синтезу ДНК була пригнічена після інактивації ПКС, що свідчить про важливість цього ферменту в ОФК-індукованому мітогенез. Раніше GM McCarthy і співавтори (1987) продемонстрували зв'язок мітогенного відповіді фібробластів людини на ОФК-кристали з активацією ПКС. Однак ОФК-кристали не активують фосфатидилинозитол-3-киназу або тирозинкінази, підтверджуючи той факт, що механізм активації клітин кристалами ОФК селективен.

Проліферацію клітин контролює група генів, які називаються протоонкогенів. Білки foe і туї, продукти протоонкогенов c-fos і з-шус локалізовані в клітинному ядрі і пов'язані зі специфічними послідовностями ДНК. Стимуляція ЗТЗ-фібробластів ОФК-кристалами призводить до експресії c-fos протягом декількох хвилин, яка досягає максимуму через 30 хв після стимуляції. Індукція транскрипції з-mус ОФК-кристалами або ФРПТ відбувається протягом 1 год і досягає максимуму через 3 години після стимуляції. Не менш 5 ч клітини підтримують підвищений рівень транскрипції c-fos і c-myc. У клітинах з інактивованої ПКС стимуляція c-fos і з-mус кристалами ОФК або ТФД значно пригнічена, в той час як індукція цих генів ФРПТ не змінюється.

Представники сімейства мітогенактівірованних протеинкиназ (МАП К) - ключові регулятори різних внутрішньоклітинних сигнальних каскадів. Один з підкласів даного сімейства - р42 / Р44 - регулює проліферацію клітин за допомогою механізму, що включає активацію протоонкогенов c-fos і c-jun. ОФК- і ПФКД-кристали активують протеінкіназной шлях передачі сигналу, в якому беруть участь обидва р42 і Р44, що свідчить про роль цього шляху в мітогенез, индуцированном кальцій-містять кристалами.

Нарешті, в ОФК-індукованому мітогенез бере участь транскрипційні ядерний фактор кВ (NF-kB), який вперше був описаний як ген легкого ланцюга імуноглобуліну до (IgK). Це індукований транскрипційні фактор, важливий для багатьох сигнальних шляхів, оскільки він регулює експресію різних генів. Індукція NF-kB зазвичай пов'язана з вивільненням з цитоплазми інгібіторних білків, званих 1 кВ. Слідом за індуціей NF-kB відбувається транслокація активного транскрипційного фактора в ядро. Кристали ОФК індукують NF-kB в Balb / c- ₃ T ₃ фибробластах і фібробластах шкіри людини.

Кілька шляхів можуть бути залучені в передачу сигналу після активації NF-кВ, однак всі вони включають протеїнкінази, які фосфорилируют (і таким чином деградують) 1 кВ. Грунтуючись на результатах досліджень in vitro, раніше припускали, що 1 кВ служить субстратом для киназ (наприклад, ПКС і протеинкиназа А). Однак нещодавно був ідентифікований 1 кВ-кіназного комплекс великої молекулярної маси. Ці кінази специфічно фосфорилируют серинові залишки 1 кВ. Активація NF-кВ ФНО-а та ІЛ-1 вимагає ефективної дії NF-кВ-индуцирующей кінази (НІК) і 1 кВ-кінази. Молекулярний механізм активації НІК в даний час ніхто не знає. Незважаючи на те, що кристали ОФК активують і ПКС і NF-кВ, невідомо, якою мірою ці два процеси можуть бути пов'язані. Так як модифікація ГКВ-кінази здійснюється шляхом фосфорилювання, не виключається роль ПКС в індукції кристалами ОФК NF-кВ шляхомфосфорилювання і активації ГКВ-кінази. На підтримку цієї концепції може служити пригнічення інгібітором ПКС стауроспоріном ОФК-крісталліндуцірованного мітогенез і експресії NF-кВ. Аналогічно стауроспорін може пригнічувати ГКВ-киназу, а значить, пригнічує протеінкіназуА і інші протеїнкінази.

Таким чином, механізм ОФК-крісталліндуцірованного мітогенез в фібробластах включає не менше двох різних процесів:

• швидке мембранно-пов'язане подія, яка призводить до активації ПКС і МАП К, індукції NF-кВ і протоонкогенов,
• більш повільне внутрішньоклітинний розчинення кристалів, що веде до підвищення внутрішньоклітинного вмісту Са ²⁺, а потім до активації ряду кальційзалежних процесів, що стимулюють мітогенез.

[1], [2], [3]

Івдукція ММП-кальцій-містять кристалами

Медіаторами пошкодження тканини кальцийсодержащими кристалами є ММП - коллагеназа-1, стромелизин, желатинази 92 кД і коллагеназа-3.

З урахуванням зв'язку між вмістом кристалів ОФК і деструкції тканин суглобів була висловлена гіпотеза, згідно з якою кристали ОФК і, можливо, деякі колаген фагоцитируются синовіальними клітинами. Стимульовані сіновіціти пролиферируют і сек-Ретіро протеази. Ця гіпотеза була перевірена in vitro шляхом додавання природних або синтетичних кристалів ОФК, ПФКД і інших в культуру сіновіцітов людини або собаки. Рівень активності нейтральних протеаз і коллагеназ дозозависимо зріс і був приблизно в 5-8 разів вище в порівнянні з контрольною культурою клітин, які культивували без кристалів.

У клітинах, культивованих в крісталлсодержащей середовищі, виявлено коіндукція мРНК колагенази-1, стромелизина і желатинази-92 кД з подальшою секрецією ферментів в середу.

Кристали ОФК також викликали акумуляцію мРНК колагенази-1 і колагенази-2 в зрілих хондроцитах свині з подальшою секрецією ферментів в середу.

GM McCarty і співавтори (1998) вивчали роль внутрішньоклітинного розчинення кристалів в крісталліндуцірованной продукції ММП. Підвищення лизосомального рН за допомогою бафіломіціна А, гнітило внутрішньоклітинний розчинення кристалів, а також послаблювало проліферативний відповідь фібробластів людини на кристали ОФК, але не гнітило синтез і секрецію ММП.

Ні кристали основного фосфату кальцію, ні ПФКД НЕ индуцировали продукцію ІЛ-1 in vitro, на відміну від кристалів урати натрію.

Сучасні дані чітко свідчать про прямий стимуляції продукції ММП фибробластами і хондроцітамі при контакті з кальцій-містять кристалами.

Симптоми остеоартрозу свідчить про значну роль ММП в прогресуванні хвороби. Наявність кальційсодержашіх кристалів посилює дегенерацію тканин уражених суглобів.

Стимуляція синтезу простагландинів

Поряд зі стимуляцією росту клітин, секрецією ферментів кальцій кристали викликають вивільнення простагландинів з культур клітин ссавців, особливо ПГЕ ₂. Вивільнення ПГЕ ₂ у всіх випадках відбувається протягом першої години після експозиції клітин кристалів. R. Rothenberg (l 987) визначив, що основними джерелами арахідонової кислоти для синтезу ПГЕ ₂ є фосфатіділхолін і фосфатіділетаноламін, а також підтвердив, що фосфоліпаза А ₂ і НІГ - домінуючі шляхи продукції ПГЕ ₂.

У відповідь на дію кристалів ОФК також може виділятися ПГЕ1. GM McCarty і співавтори (1993,1994) вивчали вплив ПГЕ ₂, ПГЕ, і його аналога мизопростола на мітогенний відповідь фібробластів людини на кристали ОФК. Всі три агента гнобили мітогенний відповідь дозозалежним шляхом, причому ПГЕ, і мізопростал проявляли більш виражену ингибиторную активність. ПГЕ, і мізопростол, але не ПГЕ ₂ гнобили акумуляцію мРНК колагенази у відповідь на дію кристалів ОФК.

MG McCarty і Н. Cheung (1994) досліджували механізм ОФК-опосередкованої активації клітин ПГЕ. Автори показали, що ПГЕ, - більш потужний індуктор внутрішньоклітинного цАМФ, ніж ПГЕ ₂, і ПГЕ, пригнічує ОФК-індукований мітогенез і продукцію ММП через цАМФ-залежний шлях передачі сигналу. Можливо, підвищення продукції ПГЕ, індуковане кристалами ОФК, послаблює їх інші біологічні ефекти (мітогенез і продукцію ММП) за механізмом зворотного зв'язку.

Запалення, індуковане кристалами

Кальцій кристали часто виявляють у синовіальній рідині у хворих на остеоартроз, проте епізоди гострого запалення з лейкоцитозом зустрічаються рідко як при остеоартрозі, так і при крісталлассоціірованних артропатиях (наприклад, синдромі «плечовий суглоб Мілуокі»). Флогістіческій потенціал кристалів може бути модифікований поруч інгібіторних факторів. R. Terkeltaub і співавтори (1988) продемонстрували здатність сироватки і плазми крові значно пригнічувати відповідь нейтрофільних гранулоцітовов на кристали основного фосфату кальцію. Факторами, які викликають таке пригнічення, є крісталлсвязивающіе білки. Дослідження одного з таких білків - a ₂ -HS глікопротеїну (AHSr) - показало, що АНSГ є найбільш потужним і специфічним інгібітором відповіді нейтрофілів на кристали ОФК. AHSr - сироватковий протеїн печінкового походження; відомо, що в порівнянні з іншими білками сироватки крові він у відносно високих концентраціях міститься в кістковій і мінералізуюча тканини. Крім того, AHSr присутній в «невоспаленной» синовіальної рідини, а також виявлений на кристалах основного фосфату кальцію в нативної синовіальної рідини. Таким чином, не виключається ймовірність модулювання AHSr флогогенного потенціалу кристалів основного фосфату кальцію в умовах in vivo.

Резюмуючи все вищесказане, наведемо дві схеми патогенезу остеоартрозу, запропоновані WB van den Berg і співавторами (1999) і М. Саrrabba і співавторами (1996), які об'єднують механічні, генетичні і біохімічні фактори.