Штучні клапани серця

Сучасні, доступні для клінічного використання біологічні штучні клапани серця, за винятком пульмонального аутографта, являють собою нежиттєздатні структури, у яких відсутній потенціал до зростання і репарація тканин. Це накладає суттєві обмеження для їх використання особливо у дітей при корекції клапанної патології. Тканинна інженерія сформувалася протягом останніх 15 років. Метою цього наукового напрямку є створення в штучних умовах таких структрур, як штучні клапани серця з тромборезістентность поверхнею і життєздатним інтерстіцием.

[1], [2],

Як розробляються штучні клапани серця?

Наукова концепція тканинної інженерії заснована на ідеї заселення і вирощування живих клітин (фібробластів, стовбурових клітин та ін.) В синтетичному або природному розсмоктується каркасі (матриці), що представляє собою тривимірну клапанну конструкцію, а також використання сигналів, що регулюють експресію генів, організацію і продуктивність пересаджених клітин протягом періоду формування екстрацелюлярного матриксу.

Такі штучні клапани серця інтегруються з тканиною хворого для остаточного відновлення і подальшого підтримання своєї структури і функції. При цьому на вихідній матриці в результаті функціонування клітин (фібробластів, миофибробластов і ін.) Формується новий коллагеноеластіновий каркас або, точніше, матрикс. У підсумку, оптимальні штучні клапани серця, створені методом тканинної інженерії, повинні по анатомічної структурі і своєї функції наближатися до нативному, а також володіти биомеханической адаптованість, здатністю до репарації і зростання.

Тканинна інженерія розробляє штучний клапан серця з використанням різних джерела забору клітин. Так, можуть застосовуватися ксеногенні або алогенних клітини, хоча перші пов'язані з ризиком перенесення зоонозів людині. Знизити антигенность і запобігти реакції відторгнення організму можливо генетичною модифікацією алогенних клітин. Для тканинної інженерії необхідний надійний джерело отримання клітин. Таким джерелом є аутогенні клітини, що забираються безпосередньо від пацієнта і не дають імунних реакцій під час реимплантации. Ефективні штучні клапани серця зроблені на основі аутологічних клітин, отриманих з кровоносних судин (артерій і вен). Для отримання чистих клітинних культур розроблений метод, заснований на використанні флюоресцентактівірованной сортування клітин - FACS. Змішана клітинна популяція, отримана з кровоносної судини, метится ацетильованим, що володіє зниженою щільністю, ліпопротеїновими маркером, який вибірково абсорбується на поверхні ендотеліоцитів. Ендотеліоцити згодом можна легко відокремити від основної маси клітин, отриманих з судин, яка буде представлена сумішшю з гладких клітин, миофибробластов і фібробластів. Джерело клітин, будь то артерія або вена, буде впливати на властивості кінцевої конструкції. Так, штучні клапани серця з матрицею, засіяної венозними клітинами, за ступенем сформованості колагену і механічної стабільності перевершують конструкції, засіяні артеріальними клітинами. Вибір периферичних вен видається більш зручним джерелом забору клітин.

Міофібробласти також можуть забиратися з сонних артерій. Разом з тим, клітини, отримані з судин, істотно відрізняються своїми характеристиками від природних клітин інтерстицію. В якості альтернативного джерела клітин можуть бути використані аутогенні клітини пуповини.

Штучні клапани серця на основі стовбурових клітин

Прогресу тканинної інженерії в останні роки сприяють дослідження стовбурових клітин. Використання стовбурових клітин червоного кісткового мозку має свої переваги. Зокрема, простота забору біоматеріалу та культивування in vitro з наступною диференціацією в різні типи мезенхімальних клітин дозволяє уникнути використання інтактних судин. Стовбурові клітини є плюрипотентними джерелами клітинних паростків, мають унікальні імунологічні характеристики, що сприяють їх стабільності в алогенних умовах.

Людські стовбурові клітини червоного кісткового мозку отримують за допомогою стернальной пункції або пункції гребеня клубової кістки. Їх виділяють з 10-15 мл аспирата грудини, відокремлюють від інших клітин і культивують. Після досягнення необхідного числа клітин (зазвичай протягом 21-28 діб) проводять їх засівання (колонізацію) на матриці, культивують в живильному середовищі в статичному положенні (протягом 7 діб в зволоженому інкубаторі при 37 ° С в присутності 5% СО2). Надалі стимуляція клітинного росту здійснюється через купьтуральную середу (біологічні стимули) або через створення фізіологічних умов зростання тканини при її ізометричної деформації в апараті репродукції з пульсуючим потоком - біореакторі (механічні стимули). Фібробласти чутливі до механічних стимулів, які сприяють їх росту і функціональної активності. Пульсуючий потік викликає збільшення як радіальних, так і окружних деформацій, що призводить до орієнтації (витягнутості) заселених клітин в напрямку дії таких напружень. Це призводить, в свою чергу, до формування орієнтованих волоконних структур стулок. Постійний потік викликає тільки дотичні напруження на стінках. Пульсуючий потік благотворно позначається на клітинної морфології, проліферації і складі екстрацелюлярного матриксу. Характер потоку живильного середовища, фізико-хімічні умови (рН, рО2 і рСО2) в біореакторі також істотно впливають на продукцію колагену. Так, ламінарний потік, циклічні вихрові струми збільшують продукцію колагену, що призводить до поліпшення механічних властивостей.

Інший підхід у вирощуванні тканинних структур полягає в створенні ембріональних умов в біореакторі замість моделювання фізіологічних умов людського організму. Вирощені на основі стовбурових клітин із тканини біоклапани мають рухливі і пластичні стулки, функціонально заможні при впливі високого тиску і потоку, що перевищує фізіологічний рівень. Гістологічне і гістохімічне дослідження стулок цих структур показали наявність в них активно протікають процесів біодеструкції матриці і заміщення її життєздатною тканиною. Тканина організована по шаруватому типу з характеристиками протеїнів екстрацелюлярного матриксу, подібними характеристиками нативной тканини наявністю колагену I і III типу і глікозаміногліканів. Однак не було отримано типового тришарової будови стулок - вентрикулярного, спонгиозного і фіброзного шарів. Виявлені у всіх фрагментах ASMA-позитивні клітини, які експресують виментин мали характеристики, схожі з характеристиками миофибробластов. При електронній мікроскопії були виявлені клітинні елементи з ознаками, характерними для життєздатних, секреторно активних миофибробластов (актин / міозіновие філаменти, колагенові нитки, еластин), а на поверхні тканини - ендотеліальні клітини.

На стулках були виявлені колаген I, III типів, ASMA і виментин. Механічні властивості стулок тканинних і нативних структур можна було порівняти. Тканинні штучні клапани серця показували чудову продуктивність протягом 20 тижнів і нагадували природні анатомічні структури за своєю мікроструктурі, біохімічному профілем і формуванню протеїнового матриксу.

Всі штучні клапани серця, отримані методом тканинної інженерії, имплантировались тваринам в легеневу позицію, оскільки їх механічні характеристики не відповідають навантаженням в аортальной позиції. Експлантірованние від тварин тканинні клапани за своєю структурою близькі до нативним, що свідчить про подальше їх розвитку та розбудові в умовах in vivo. Чи буде процес перебудови і дозрівання тканини тривати в фізіологічних умовах після того, як штучні клапани серця імплантуються, як це спостерігалося в експериментах на тваринах, покажуть подальші дослідження.

Ідеальні штучні клапани серця повинні володіти пористістю не менше 90%, оскільки це суттєво для клітинного росту, доставки поживних речовин і видалення продуктів метаболізму клітин, Крім біологічної сумісності і здатності до біодеструкції, штучні клапани серця повинні мати хімічно сприятливу для засівання клітин поверхню і відповідати механічним властивостями природної тканини. Рівень біодеструкції матриці повинен бути керованим і пропорційним рівню утворення нової тканини для забезпечення гарантії механічної стабільності протягом певного часу.

В даний час ведуться розробки синтетичних і біологічних матриць. Найбільш поширеними біологічними матеріалами для створення матриць є донорскіеанатоміческіе структури, колаген і фібрин. Полімерні штучні клапани серця розробляються таким чином, щоб біодеградіровать після імплантації, як тільки імплантовані клітини почнуть виробляти і організовувати свою власну позаклітинне матричну мережу. Формування нової матричної тканини можна регулювати або стимулювати за допомогою факторів росту, цитокінів або гормонів.

[3], [4], [5], [6], [7]

Донорські штучні клапани серця

Донорські штучні клапани серця, отримані від людини або тварин і позбавлені клітинних антигенів шляхом децеллюлярізаціі для зниження їх імуногенності, можна використовувати в якості матриць. Збережені протеїни екстрацелюлярного матриксу є основою для подальшої адгезії засіваються клітин. Існують наступні способи видалення клітинних елементів (ацеллюлярізаціі): заморожування, обробка трипсин / EDTA, детергентами - додецил сульфатом натрію, деоксіколатом натрію, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, а також багатостадійні способи ферментативної обробки. При цьому видаляються мембрани клітин, нуклеїнові кислоти ліпіди, цитоплазматические структури і розчинні молекули матриксу зі збереженням колагену і еластину. Однак ідеального способу поки не знайдено. Тільки додецил сульфат натрію (0,03-1%) або деоксіколат натрію (0,5-2%) приводили до повного видалення клітин після 24 год обробки.

Гістологічне дослідження віддалених децеллюлярізованних біоклапанов (аллографта і ксенографта) в експерименті на тварин (собаки і свині) показало, що відбуваються часткові ендотелізація і вростання миофибробластов реципієнта в основу, відсутні ознаки його кальциноза. Відзначено помірно виражена запальна інфільтрація. Однак при клінічних випробуваннях децеллюлярізованного клапана SynerGraftTM розвивалася рання недостатність. У матриксі біопротеза визначалася виражена запальна реакція, яка спочатку була неспецифічної і супроводжувалася лимфоцитарной реакцією. Дисфункція і дегенерація біопротеза розвивалися протягом одного року. Заселення матриксу клітинами не було відзначено, однак були виявлені кальциноз стулок і передімплантаційної залишки клітин.

Засіяні ендотеліальними клітинами безклітинні матриці і культивовані в умовах in vitro і in vivo утворювали цілісний шар на поверхні стулок, а засіяні інтерстиціальні клітини нативной структури показали свою здатність до диференціації. Однак досягти необхідного фізіологічного рівня колонізації клітин на матриксе в динамічних умовах біореактора не вдавалося, а імплантовані штучні клапани серця супроводжувалися досить швидким (три місяці) потовщенням за рахунок прискореної клітинної проліферації і утворення екстрацелюлярного матриксу. Таким чином, на даному етапі використання донорських безклітинних матриць для їх колонізації клітинами має ряд невирішених проблем, 8 тому числі імунологічного і інфекційного характеру робота над децеллюлярізованнимі біопротез триває.

Слід зазначити, що колаген також є одним з потенційних біологічних матеріалів для виготовлення матриць, здатних до біодеградації. Він може використовуватися у вигляді піни, гелю або пластин, губок і в якості заготовки на волоконної основі. Однак застосування колагену пов'язано з рядом технологічних труднощів. Зокрема, його важко отримати від хворого. Тому в даний час більшість колагенових матриць має тваринне походження. Уповільнена биодеградация тваринного колагену може нести підвищений ризик зараження зоонозами, викликати імунологічні та запальні реакції.

Фібрин - ще один біологічний матеріал, який має керовані характеристики біодеградації. Оскільки фібринові гелі можуть бути виготовлені з крові пацієнта для подальшого виготовлення аутологічної матриці, то імплантація такої структури не викличе його токсичної деградації і запальної реакції. Однак фібрину притаманні такі недоліки, як дифузія і вимивання в навколишнє середовище і низькі механічні характеристики.

[8], [9], [10], [11], [12]

Штучні клапани серця з синтетичних матеріалів

Штучні клапани серця виготовляють також з синтетичних матеріалів. Кілька спроб виготовлення матриць клапанів були засновані на використанні поліглактіна, полігликолевою кислоти (PGA), полілактіческой кислоти (PLA), сополимера PGA і PLA (PLGA) і полігідроксіалканоатов (РНА). Високопористий синтетичний матеріал може бути отриманий з плетеного або неплетені волокна і з використанням технології сольового вилуговування. Перспективний композитний матеріал (PGA / Р4НВ) для виготовлення матриць отримано з неплетені петель полігликолевою кислоти (PGA), покритих полі-4-гидроксибутирата (Р4НВ). Виготовлені штучні клапани серця з цього матеріалу стерилізуються оксидом етилену. Однак значна початкова жорсткість і товщина петель цих полімерів, їх швидка і безконтрольна деградація, що супроводжується виділенням кислих цитотоксичних продуктів, вимагають подальших досліджень і пошуку інших матеріалів.

Використання пластин тканинних культур аутологічних миофибробластов, культивованих на каркасі, з метою формування опорних матриць за рахунок стимулювання продукції цих клітин дозволило отримати зразки клапанів з активними життєздатними клітинами, оточеними позаклітинним матриксом. Однак механічні властивості тканин цих клапанів поки недостатні для їх імплантації.

Необхідний рівень проліферації і регенерації тканини створюваного клапана може бути не досягнутий шляхом тільки об'єднання клітин і матриці. Експресія клітинного гена і формування тканини може регулюватися або стимулюватися додаванням чинників зростання, цитокінів або гормонів, мітогенних факторів або факторів адгезії в матрицях і матриксу. Вивчається можливість впровадження цих регуляторів в біоматеріали матриці. В цілому, є істотний недолік досліджень з регулювання процесу формування тканинного клапана біохімічними стимулами.

Безклітковий свинячий ксеногенний легеневий біопротез Matrix P складається з децеллюлярізованной тканини, обробленої за допомогою спеціальної запатентованої процедури AutoTissue GmbH, що включає обробку антибіотиками, деоксихолат натрію і спиртом Даний спосіб обробки, затверджений Міжнародною організацією зі стандартизації, усуває всі живі клітини і постклеточние структури (фібробласти, ендотеліоцити, бактерії, віруси, грибки, мікоплазми), зберігає архітектоніку екстрацелюлярного матриксу, знижує рівень ДНК і РНК в тканинах до мінім ма, що зводить до нуля ймовірність трансмісії свинячого ендогенного ретровірусу (PERV) людині. Біопротез Matrix P складається виключно з колагену і еластину зі збереженою структурної інтеграцією.

В ході експериментів на вівцях була зареєстрована мінімальна реакція з боку оточуючих тканин через 11 місяців після імплантації біопротеза Matrix Р з хорошими показниками його приживлюваності, що, зокрема, виявлялося в блискучій поверхні його ендокарда. Фактично відсутні запальні реакції, потовщення і вкорочення стулок клапана. Також був зареєстрований найнижчий рівень кальцію тканини біопротеза Matrix P, різниця була статистично значуща в порівнянні з обробленими глутаровий альдегідом.

Штучні клапани серця Matrix P адаптується до індивідуальних умов пацієнта протягом декількох місяців після його імплантації. При дослідженні після закінчення контрольного терміну виявлені інтактний позаклітинний матрикс і зливний ендотелій. Ксенографт Matrix R імплантований при операції Росса, виконаної у 50 пацієнтів з вродженими вадами в період з 2002 по 2004 р, показав чудову продуктивність і більш низькі трансклапанний градієнти тиску в порівнянні з консервованими і децеллюлярізованнимі аллографтамі SynerGraftMT, а також безкаркасними біопротез, обробленими глутаровий альдегідом. Штучні клапани серця Matrix P призначений для протезування клапана легеневої артерії при реконструкції вихідного тракту правого шлуночка в хірургії вроджених і набутих вад і при протезуванні легеневого клапана в ході процедури Росса, доступний в 4 типорозмірах (по внутрішньому діаметру): для новонароджених (15-17 мм ), для дітей (18-21 мм), проміжний (22-24 мм) і дорослий (25-28 мм).

Прогрес в розробці клапанів на основі тканинної інженерії буде залежати від успіхів клапанної клітинної біології (включаючи питання експресії гена і регуляцію), вивчення ембріогенного і вікового розвитку клапанів (включаючи ангіогенние і неврогенні фактори), точного знання біомеханіки кожного клапана, ідентифікації адекватних клітин для заселення, розробки оптимальних матриць. Для подальшої розробки досконаліших тканинних клапанів необхідно повне розуміння взаємини між механічними та структурними характеристиками нативних клапанів і стимулів (біологічних і механічних) для відтворення цих характеристик in vitro.

[13], [14], [15], [16]