Штучні клапани серця

Сучасні біологічні штучні клапани серця, доступні для клінічного використання, за винятком легеневого аутотрансплантата, є нежиттєздатними структурами, які не мають потенціалу для росту та репарації тканин. Це накладає значні обмеження на їх використання, особливо у дітей, для корекції клапанної патології. Тканинна інженерія розвивалася протягом останніх 15 років. Метою цього наукового напрямку є створення в штучних умовах таких структур, як штучні клапани серця з тромборезистентною поверхнею та життєздатним інтерстицієм.

[ 1 ], [ 2 ]

Як розробляються штучні клапани серця?

Наукова концепція тканинної інженерії базується на ідеї заселення та вирощування живих клітин (фібробластів, стовбурових клітин тощо) у синтетичному або природному розсмоктуючому каркасі (матриці), що являє собою тривимірну клапанну структуру, а також використання сигналів, що регулюють експресію генів, організацію та продуктивність трансплантованих клітин у період формування позаклітинного матриксу.

Такі штучні клапани серця інтегруються з тканинами пацієнта для остаточного відновлення та подальшого підтримання їхньої структури та функції. У цьому випадку на вихідному матриксі в результаті функціонування клітин (фібробластів, міофібробластів тощо) формується новий колагено-еластиновий каркас або, точніше, позаклітинний матрикс. В результаті оптимальні штучні клапани серця, створені методами тканинної інженерії, повинні бути близькими до нативних за анатомічною будовою та функцією, а також мати біомеханічну адаптивність, здатність до репарації та росту.

Тканинна інженерія розробляє штучні клапани серця, використовуючи різні джерела збору клітин. Таким чином, можуть використовуватися ксеногенні або алогенні клітини, хоча перші пов'язані з ризиком передачі зоонозів людині. Знизити антигенність та запобігти реакціям відторгнення організму можна шляхом генетичної модифікації алогенних клітин. Тканинна інженерія вимагає надійного джерела клітин. Таким джерелом є аутогенні клітини, взяті безпосередньо у пацієнта, і не викликають імунних реакцій під час реімплантації. Ефективні штучні клапани серця виготовляються на основі аутологічних клітин, отриманих з кровоносних судин (артерій та вен). Для отримання чистих клітинних культур розроблено метод, заснований на використанні флуоресцентно-активованого сортування клітин - FACS. Змішана популяція клітин, отримана з кровоносної судини, мічена ацетильованим маркером ліпопротеїнів низької щільності, який вибірково абсорбується на поверхні ендотеліоцитів. Ендотеліальні клітини потім можна легко відокремити від основної маси клітин, отриманих із судин, яка буде сумішшю гладком'язових клітин, міофібробластів та фібробластів. Джерело клітин, артерія чи вена, впливатиме на властивості кінцевої конструкції. Таким чином, штучні клапани серця з матрицею, засіяною венозними клітинами, мають кращі показники утворення колагену та механічної стабільності, ніж конструкції, засіяні артеріальними клітинами. Вибір периферичних вен видається зручнішим джерелом збору клітин.

Міофібробласти також можна отримати з сонних артерій. Однак клітини, отримані з судин, мають суттєво відмінні характеристики від природних інтерстиціальних клітин. Аутологічні клітини пуповини можна використовувати як альтернативне джерело клітин.

Штучні клапани серця на основі стовбурових клітин

В останні роки прогрес у тканинній інженерії був сприятливий завдяки дослідженням стовбурових клітин. Використання стовбурових клітин червоного кісткового мозку має свої переваги. Зокрема, простота збору біоматеріалу та культивування in vitro з подальшою диференціацією в різні типи мезенхімальних клітин дозволяє уникнути використання інтактних судин. Стовбурові клітини є плюрипотентними джерелами клітинних ліній та мають унікальні імунологічні характеристики, що сприяють їхній стабільності в алогенних умовах.

Стовбурові клітини червоного кісткового мозку людини отримують шляхом стернальної пункції або пункції гребеня клубової кістки. Їх виділяють з 10-15 мл аспірату грудини, відокремлюють від інших клітин та культивують. Після досягнення необхідної кількості клітин (зазвичай протягом 21-28 днів) їх висівають (колонізують) на матриці та культивують у поживному середовищі у статичному положенні (протягом 7 днів у зволоженому інкубаторі при 37 °C у присутності 5% CO2). Згодом ріст клітин стимулюють через купрумальне середовище (біологічні подразники) або шляхом створення фізіологічних умов для росту тканини під час її ізометричної деформації в репродуктивному апараті з пульсуючим потоком - біореакторі (механічні подразники). Фібробласти чутливі до механічних подразників, що сприяють їх росту та функціональній активності. Пульсуючий потік викликає збільшення як радіальних, так і окружних деформацій, що призводить до орієнтації (подовження) заселених клітин у напрямку таких напружень. Це, у свою чергу, призводить до утворення орієнтованих волокнистих структур стулок. Постійний потік викликає лише тангенціальні напруження на стінках. Пульсуючий потік позитивно впливає на клітинну морфологію, проліферацію та склад позаклітинного матриксу. Характер потоку поживного середовища, фізико-хімічні умови (pH, pO2 та pCO2) у біореакторі також суттєво впливають на вироблення колагену. Таким чином, ламінарний потік, циклічні вихрові струми збільшують вироблення колагену, що призводить до покращення механічних властивостей.

Інший підхід до вирощування тканинних структур полягає у створенні ембріональних умов у біореакторі замість імітації фізіологічних умов людського організму. Тканинні біовалти, вирощені на основі стовбурових клітин, мають рухливі та гнучкі клапті, функціонально здатні під впливом високого тиску та потоку, що перевищує фізіологічний рівень. Гістологічні та гістохімічні дослідження клаптів цих структур показали наявність активних процесів біодеструкції матриксу та його заміщення життєздатною тканиною. Тканина організована за шаруватим типом з характеристиками білків позаклітинного матриксу, подібними до характеристик нативної тканини, наявністю колагену I та III типів та глікозаміногліканів. Однак типова тришарова структура клаптів - шлуночковий, губчастий та фіброзний шари - не була отримана. ASMA-позитивні клітини, що експресують віментин, виявлені у всіх фрагментах, мали характеристики, подібні до характеристик міофібробластів. Електронна мікроскопія виявила клітинні елементи з ознаками, характерними для життєздатних, секреторно активних міофібробластів (актинові/міозинові філаменти, колагенові нитки, еластин) та ендотеліальні клітини на поверхні тканини.

На стулках було виявлено колаген I, III типів, ASMA та віментин. Механічні властивості стулок тканинних та нативних структур були порівнянними. Тканинні штучні клапани серця продемонстрували чудову продуктивність протягом 20 тижнів та нагадували природні анатомічні структури за своєю мікроструктурою, біохімічним профілем та формуванням білкової матриці.

Усі штучні клапани серця, отримані методом тканинної інженерії, були імплантовані тваринам у легеневій позиції, оскільки їхні механічні характеристики не відповідають навантаженням в аортальній позиції. Тканинні клапани, експлантовані у тварин, за структурою близькі до нативних, що свідчить про їх подальший розвиток та перебудову in vivo. Чи продовжиться процес перебудови та дозрівання тканин у фізіологічних умовах після імплантації штучних клапанів серця, як це спостерігалося в експериментах на тваринах, покажуть подальші дослідження.

Ідеальні штучні клапани серця повинні мати пористість щонайменше 90%, оскільки це необхідно для росту клітин, доставки поживних речовин та видалення продуктів клітинного метаболізму. Окрім біосумісності та біорозкладності, штучні клапани серця повинні мати хімічно сприятливу поверхню для посіву клітин та відповідати механічним властивостям природної тканини. Рівень біорозкладу матриксу повинен бути контрольованим та пропорційним рівню утворення нової тканини, щоб забезпечити механічну стабільність з часом.

Наразі розробляються синтетичні та біологічні матриці. Найпоширенішими біологічними матеріалами для створення матриць є донорські анатомічні структури, колаген та фібрин. Полімерні штучні клапани серця розробляються таким чином, щоб біорозкладатися після імплантації, як тільки імплантовані клітини починають виробляти та організовувати власну мережу позаклітинного матриксу. Формування нової матричної тканини може регулюватися або стимулюватися факторами росту, цитокінами або гормонами.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Донорські штучні клапани серця

Як матриці можна використовувати донорські штучні клапани серця, отримані від людей або тварин та знесилені клітинними антигенами шляхом децелюляризації для зниження їхньої імуногенності. Збережені білки позаклітинного матриксу є основою для подальшої адгезії засіяних клітин. Існують такі методи видалення клітинних елементів (ацелюляризації): заморожування, обробка трипсином/ЕДТА, детергенти - додецилсульфат натрію, дезоксиколат натрію, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, а також багатостадійні ферментативні методи обробки. У цьому випадку видаляються клітинні мембрани, нуклеїнові кислоти, ліпіди, цитоплазматичні структури та розчинні молекули матриксу, зберігаючи при цьому колаген та еластин. Однак ідеальний метод поки що не знайдено. Лише додецилсульфат натрію (0,03-1%) або дезоксиколат натрію (0,5-2%) призвели до повного видалення клітин після 24 годин обробки.

Гістологічне дослідження видалених децелюляризованих біологічних клапанів (алотрансплантата та ксенотрансплантата) в експерименті на тваринах (собака та свиня) показало часткову ендотелізацію та вростання міофібробластів реципієнта в основу без ознак кальцифікації. Було відзначено помірну запальну інфільтрацію. Однак під час клінічних випробувань децелюляризованого клапана SynerGraft™ розвинулася рання недостатність. У матриці біопротеза було виявлено виражену запальну реакцію, яка спочатку була неспецифічною та супроводжувалася лімфоцитарною реакцією. Дисфункція та дегенерація біопротеза розвивалися протягом одного року. Колонізації матриці клітинами не відзначалося, але було виявлено кальцифікацію клапанів та залишки преімплантаційних клітин.

Безклітинні матриці, засіяні ендотеліальними клітинами та культивовані in vitro та in vivo, утворювали когерентний шар на поверхні клапанів, а засіяні інтерстиціальні клітини нативної структури демонстрували свою здатність до диференціації. Однак досягти необхідного фізіологічного рівня колонізації клітин на матриці в динамічних умовах біореактора не вдалося, а імплантовані штучні клапани серця супроводжувалися досить швидким (три місяці) потовщенням через прискорену проліферацію клітин та формування позаклітинного матриксу. Таким чином, на даному етапі використання донорських безклітинних матриць для їх колонізації клітинами має низку невирішених проблем, зокрема імунологічних та інфекційних; робота над децелюляризованими біопротезами триває.

Слід зазначити, що колаген також є одним із потенційних біологічних матеріалів для виробництва матриць, здатних до біодеградації. Його можна використовувати у вигляді піни, гелю або пластин, губок та як заготовку на основі волокон. Однак використання колагену пов'язане з низкою технологічних труднощів. Зокрема, його важко отримати від пацієнта. Тому наразі більшість колагенових матриць мають тваринне походження. Повільна біодеградація тваринного колагену може нести підвищений ризик зараження зоонозами, викликати імунологічні та запальні реакції.

Фібрин – це ще один біологічний матеріал з контрольованими характеристиками біодеградації. Оскільки фібринові гелі можна виготовляти з крові пацієнта для подальшого виробництва аутологічної матриці, імплантація такої структури не спричинить її токсичної деградації та запальної реакції. Однак фібрин має такі недоліки, як дифузія та вимивання в навколишнє середовище, а також низькі механічні властивості.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Штучні клапани серця, виготовлені з синтетичних матеріалів

Штучні клапани серця також виготовляються із синтетичних матеріалів. Кілька спроб виготовлення матриць клапанів були засновані на використанні поліглактину, полігліколевої кислоти (PGA), полімолочної кислоти (PLA), сополімеру PGA та PLA (PLGA) та полігідроксиалканоатів (PHA). Високопористий синтетичний матеріал можна отримати з плетеного або неплетеного волокна та за допомогою технології сольового вилуговування. Перспективний композитний матеріал (PGA/P4HB) для виготовлення матриць отримують з неплетених петель полігліколевої кислоти (PGA), покритих полі-4-гідроксибутиратом (P4HB). Штучні клапани серця, виготовлені з цього матеріалу, стерилізують оксидом етилену. Однак значна початкова жорсткість і товщина петель цих полімерів, їх швидка та неконтрольована деградація, що супроводжується виділенням кислих цитотоксичних продуктів, вимагають подальших досліджень та пошуку інших матеріалів.

Використання аутологічних пластин для культури тканин міофібробластів, культивованих на каркасі, для формування опорних матриць шляхом стимуляції вироблення цих клітин дозволило отримати зразки клапанів з активними життєздатними клітинами, оточеними позаклітинним матриксом. Однак механічні властивості тканин цих клапанів все ще недостатні для їх імплантації.

Необхідний рівень проліферації та регенерації тканин створюваного клапана може бути досягнутий лише поєднанням клітин та матриксу. Експресію генів клітин та формування тканин можна регулювати або стимулювати додаванням факторів росту, цитокінів або гормонів, мітогенних факторів або факторів адгезії до матриксів та каркасів. Можливість введення цих регуляторів у матриксні біоматеріали вивчається. Загалом, існує значна нестача досліджень щодо регуляції формування тканинних клапанів біохімічними стимулами.

Ацелюлярний ксеногенний біопротез легень свині Matrix P складається з децелюляризованої тканини, обробленої за спеціальною запатентованою процедурою AutoTissue GmbH, що включає обробку антибіотиками, дезоксихолатом натрію та спиртом. Цей метод обробки, схвалений Міжнародною організацією зі стандартизації, усуває всі живі клітини та постклітинні структури (фібробласти, ендотеліальні клітини, бактерії, віруси, грибки, мікоплазму), зберігає архітектуру позаклітинного матриксу, зводить до мінімуму рівень ДНК та РНК у тканинах, що зводить до нуля ймовірність передачі ендогенного ретровірусу свині (PERV) людині. Біопротез Matrix P складається виключно з колагену та еластину зі збереженою структурною інтеграцією.

В експериментах на вівцях через 11 місяців після імплантації біопротеза Matrix P було зафіксовано мінімальну реакцію навколишніх тканин з хорошими показниками виживання, що було особливо помітно на блискучій внутрішній поверхні його ендокарда. Запальні реакції, потовщення та вкорочення стулок клапана практично були відсутні. Також було зафіксовано низький рівень кальцію в тканинах біопротеза Matrix P, причому різниця була статистично значущою порівняно з тими, хто отримував глутаральдегід.

Штучний серцевий клапан Matrix P адаптується до індивідуальних умов пацієнта протягом кількох місяців після імплантації. Обстеження наприкінці контрольного періоду виявило неушкоджений позаклітинний матрикс та конфлюентний ендотелій. Ксенотрансплантат Matrix R, імплантований 50 пацієнтам з вродженими вадами під час процедури Росса між 2002 і 2004 роками, продемонстрував кращу продуктивність та нижчі градієнти трансклапанного тиску порівняно з кріоконсервованими та децелюляризованими алотрансплантатами SynerGraftMT та безкаркасними біопротезами, обробленими глутаральдегідом. Штучні серцеві клапани Matrix P призначені для заміни легеневого клапана під час реконструкції вихідного тракту правого шлуночка в хірургії вроджених та набутих вад, а також під час заміни легеневого клапана під час процедури Росса. Вони доступні в 4 розмірах (за внутрішнім діаметром): для новонароджених (15-17 мм), для дітей (18-21 мм), середнього (22-24 мм) та дорослих (25-28 мм).

Прогрес у розробці тканинно-інженерних клапанів залежатиме від досягнень у біології клітин клапанів (включаючи питання експресії та регуляції генів), досліджень ембріогенного та вікового розвитку клапанів (включаючи ангіогенні та нейрогенні фактори), точного знання біомеханіки кожного клапана, ідентифікації адекватних клітин для посіву та розробки оптимальних матриць. Подальший розвиток більш досконалих тканинних клапанів вимагатиме глибокого розуміння взаємозв'язку між механічними та структурними характеристиками нативних клапанів та стимулами (біологічними та механічними) для відтворення цих характеристик in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]