Ембріональні стовбурові клітини

Відкриття ембріональних стовбурових клітин - виникло не випадково, а з'явилося на підготовленому грунті наукових досліджень в області біології розвитку. Термін "стовбурова клітина" був введений в медицину ще в 1908 році на з'їзді гематологічного суспільства в Берліні Олександром Максимовим стосовно до гемопоетичних клітин. Задовго до виділення і отримання стабільних ліній плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин в дослідженнях процесів раннього розвитку застосовувалися стовбурові терато- (ембріо- карціномние клітини, за допомогою яких вивчалися невідомі механізми ембріогенезу, в тому числі послідовність експресії ранніх генів і білкових продуктів їх діяльності.

Але безповоротно чи втрачена в процесі еволюції тотипотентність генома людини? Ні, і ембріогенез тому доказ. Раз це так, то коли зможе, в принципі, реалізуватися другий шлях еволюційного розвитку? Ймовірно, при виході людини в Космос, де умови навколишнього середовища будуть відносно постійні досить тривалий час. Втраті кісткової тканини (демінералізація кісток в стані невагомості), дуже повільно піддається ремоделированию і регенерації, можна розглядати як перший крок до процесу адаптації людини, як виду, для існування в умовах Космосу. Однак плата за другий шлях еволюційного розвитку буде інший - платою за повернення всіх клітин тотіпотентності і абсолютної пластичності буде стерильність. Так що розмножуватися в цьому світі "еволюційних хамелеонів" доведеться без мейозу, отпочкованием. Зате жити будемо довго. Теломеразной безсмертя - це безсмертя амеби. У багатоклітинних організмі субстратом кількісного і якісного довголіття є стовбурові клітини.

[1], [2], [3], [4]

Джерела ембріональних стовбурових клітин

Сьогодні джерелами ембріональних стовбурових клітин для лабораторних досліджень є лінії мишачої тератокарціноми (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) і тератокарціноми людини (NTERA-2, TERA-2 , H-9 clone), а також лінії ЕСК Траунеона. Однак наявність докладного клітинного паспорта із зазначенням імунного фенотипу, результатів хромосомного аналізу, профілів експресії мРНК, експонованих рецепторів і білків внутрішньоклітинної сигналізації не заповнюють істотних недоліків тератокарціномних ліній ЕСК - швидкої втрати тотіпотентності і неможливості застосування в клінічних випробуваннях, а змішана диференціювання в культурі дуже ускладнює виділення чистої спеціалізованої лінії з гетерогенної популяції клітин. Тому зазвичай джерелом ліній ЕСК, створюваних для клінічних потреб, служить внутрішня клітинна маса бластоцисти, окремі бластомери зародків 8-клітинної стадії розвитку, клітини морули більш пізніх стадій, а також первинні статеві клітини.

Слід зауважити, що клітини тератокарціноми, хоча і мають властивість плюріпотентності, в порівнянні з ЕСК характеризуються значно нижчими плюрипотентні потенціалом. Їх інтеграція з клітинами ембріонів рідко призводить до формування химер, у яких, до того ж, ніколи не утворюються гамети з генотипом тератокарціномних клітин. Вважається, що це зумовлено частим появою при культивуванні клітин тератокарціном хромосомних аномалій: втрата У-хромосоми, різноманітні трисомії, делеції або транслокації.

Спроби виділити лінію ЕСК людини робилися неодноразово, однак це завдання не вдавалося вирішити, оскільки нормальні бластоцисти людини є важкодоступними об'єктами. Крім того, у людини частота хромосомних аномалій вище, ніж в ембріогенезі тварин. У переважної більшості ранніх зародків людини, отриманих після запліднення in vitro, виявляється хаотичний хромосомний мозаїцизм і часто зустрічаються числові і структурні аберації. Навіть пізніше, на стадії бластоцисти, лише 20-25% зародків людини складаються з клітин з нормальним каріотипом. Використовувати таких зародків для створення ЕСК було практично неможливо, оскільки зиготи, як правило, культивувалися до стадій двох або чотирьох бластомерів і потім трансплантувати в матку. Лише відносно недавно була розроблена надійна техніка культивування запліднених яйцеклітин людини до стадії бластоцисти. Впровадження цієї техніки в практику екстракорпорального запліднення не тільки підвищило частоту успішного результату імплантації, але і зробило нормальні бластоцисти більш доступним об'єктом.

Ще одним плюрипотентних стовбурових клітинним джерелом є первинні статеві клітини, які, на відміну від більш просунутих прогеніторних популяцій герменатівного епітелію, не мають на своїй поверхні бета-інтегринів, але експресують високу активність шелочной фосфатази. Треба зауважити, що в експерименті популяції стовбурових клітин, які утворилися з первинних статевих клітин, досліджуються з 80-х років минулого століття. Тоді ж була розроблена і техніка виділення первинних статевих клітин з зачатка гонади мишачого зародка. Перші невдалі результати культивування первинних статевих клітин in vitro наводили на думку про безперспективність цих спроб, оскільки клітини, хоча і виживали, але не проліферіровать і гинули протягом першої доби. Надалі було встановлено, що мишачі первинні статеві клітини розмножуються in vitro тільки при наявності в культуральному середовищі розчинних і пов'язаних з мембранами специфічних поліпептидних ростових факторів. Результати численних досліджень свідчили про те, що для виживання і проліферації первинних статевих клітин необхідна наявність в культуральному середовищі не тільки LIF, але і мембранозв, а також розчинних Steel-факторів (SIF). Ці пептиди виробляються соматичними клітинами зародків, гомозиготних по мутації Steel, і один з них є лігандом протоонкогена cKit.

Первинні статеві клітини ссавців і людини мають внегонадного походження і є джерелом клонального розвитку лінії статевих клітин. Початок лінії первинних статевих клітин, як і всіх тканин ембріона, а також внезародишевой мезодермі дає епібласт (первинна ектодерма) ранніх зародків, що має мозаїчну структурну організацію. Методом мікрохірургічного видалення різних частин раннього зародка встановлена зона локалізації в Епібласт клону коммітірованних попередників первинних статевих клітин. За допомогою родаміндекстрана, який використовували в якості клітинного маркера, встановлено, що попередники первинних статевих клітин локалізовані в проксимальної області епібласта, поруч з внезародишевой ектодермою. Лінія первинних статевих клітин виникає з 45-клітинного клону, алокація якого відбувається в самому початку гаструляції. Потім настає сегрегація клону, а в процесі гаструляції первинні статеві клітини потрапляють у внезародишевую мезодерму і виявляються в підставі зачатка аллантоиса, позаду від первинної смужки. Звідти первинні статеві клітини мігрують у напрямку вентральної частини ентодерми задньої кишки і далі активно переміщаються по брижі, заселяючи в кінці міграції статеві валики. В процесі міграції, а також в перші 2-3 дні локалізації в зародку гонад первинні статеві клітини активно проліферують і проходять вісім реплікативних циклів. Якщо на початку міграції налічується близько 50 первинних статевих клітин, то в статевих валиках мишачих зародків дванадцятиденного розвитку число первинних статевих клітин перевищує 25 000.

Про функціональний подібність ЕСК і первинних статевих клітин свідчить повна інтеграція останніх в бластоцисту з заміщенням внутрішньої клітинної маси і наступним повноцінним розвитком зародка, тканини якого складаються тільки з нащадків первинних статевих клітин. За іншими властивостями мишачі первинні статеві клітини також виявилися ідентичними ЕСК, проявляючи здатність диференціюватися в самих різних напрямках, формувати in vitro ембріоідние бичка, a in vivo утворювати тератоми при підшкірному введенні імунодефіцитних мишам, що нагадують спонтанні тератоми насінники у мишей лінії 129 / ter.

Встановлено, що при додаванні в середу LIF, мембранозв і розчинної SIF ізольовані первинні статеві клітини 8-денних мишачих зародків виживають і розмножуються в культурі протягом 4 днів, однак потім гинуть. Причому термін, коли в культурі спостерігається загибель первинних статевих клітин, збігається з тією стадією розвитку мишачих зародків (12,5-13,5 дня), коли в початках гонад жіночі первинні статеві клітини вступають в мейоз, а в чоловічих первинних статевих клітинах блокуються митотические ділення. Однак, якщо додати до середовища не тільки ростові фактори LIF і SIF, але і FGF2, то первинні статеві клітини продовжують проліферіроват', а в субкультурах утворюються колонії клітин, здатних розмножуватися навіть після видалення із середовища ростових факторів (SIF і FGF). Такі клітини можна довго культивувати на підкладці ембріональних фібробластів без додавання розчинної ростового фактора LIF. Саме ці стабільні клітинні лінії, отримані з первинних статевих клітин, і було запропоновано називати ембріональними статевими клітинами. Даний термін ніяк не можна вважати вдалим, оскільки при культивуванні EG-клітин неможливо отримати ембріональні статеві клітини, здатні здійснювати наступні етапи оогенезу або сперматогенезу. Це пов'язано з тим, що EG-клітинні лінії, хоча і відбуваються з первинних статевих клітин, але, купуючи в культурі властивості ембріональних плюрипотентних стовбурових клітин, втрачають здатність коммитирование в герменатівние лінії. Іншими словами, первинні статеві клітини при культивуванні втрачають властивості попередників гамет і трансформуються в ЕСК-подібні плюрипотентні клітини.

Помічено, що при введенні імунодефіцитних мишам EG-клітин тератоми не виникають. Допускається, що втрата здатності EG-клітин людини давати початок тератома обумовлена тим, що ці лінії були створені безпосередньо з культивованих первинних статевих клітин, а отримані з клітин, виділених з ембріоідних тілець. Тому не виключено, що вони є нащадками хоча і плюрипотентних, але вже коммітірованних клітин.

Слід зазначити, що між EG-клітинами і первинними статевими клітинами існують принципові відмінності. Останні не дають можливості отримати химерні зародки миші, що свідчить про відсутність здатності первинних статевих клітин інтегруватися до складу внутрішньої клітинної маси або трофектодерми. Характеристики популяції первинних статевих клітин швидше схожі з коммітірованних лініями соматичних клітин більш пізніх ембріонів, введення яких в бластоцисту також не призводить до утворення химерних зародків.

Модифікація техніки культивування ембріоідних тілець, отриманих при агрегації EG-клітин, дозволила за допомогою відбору на селективних середовищах отримати ще одну популяцію плюрипотентних клітин, названих "клітинами, отриманими з ембріоідних тілець (embryoid body derived cells - EBD-клітини). Здатність EBD-клітин тривалий час розмножуватися в культурі дозволила створити стабільні клітинні лінії коммітірованних клітин. Були отримані клони клітин, які експресують широкий спектр мРНК і білків-маркерів спеціалізованих клітин. Цей підхід в результаті довів, що первинні статеві клітини людини плюрипотентні й диференціюються in vitro в різні типи клітин: в нейрони, нейроглії, ендотелій судин, гемопоетичні клітини, м'язові і ентодермальні клітини.

Альтернативні джерела ембріональних стовбурових клітин

Альтернативним джерелом ліній ЕСК людини можуть бути гібридні клітини. Імплантація в матку псевдобеременностью корів гетерогеномной конструкції, отриманої при злитті з допомогою електропорації соматичних клітин фетусов людини з яйцеклітиною корови, з якої попередньо видаляється пронуклеус, дає можливість отримати внутрішню клітинну масу зі штучного зародка доімплантаційних стадій розвитку. Для цього на першому етапі отримують бластоцисту з яйцеклітини корови з пересадженим ядром клітини людини.

На другому етапі з бластоцисти виділяють ембріобласт, а з нього - ЕСК за методом Томсона. Примітно, що найкращі результати по виділенню ліній ЕСК за допомогою даного методу були отримані при використанні ядер фолікулярних клітин або первинних статевих клітин, що зберігаються в організмі людини в стані глибокого сну. Це пов'язано з тим, що пересідаємо в яйцеклітину корови ядра клітин людини повинні мати неукороченние теломери і високу активність теломеази, що дозволяє уникнути передчасного старіння клонів ЕСК, одержуваних з гібридної яйцеклітини (Рєпін, 2001). Відомо, що найбільш важливими внутрішньоклітинними маркерними білками ЕСК є Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, які належать до так званим білків-сайленсери хроматину. Сайленсери забезпечують особливо компактну упаковку гетерохроматину, що перешкоджає утворенню петель еухроматину. Опосередкована цими білками упаковка хроматину корелює з тотипотентностью генома ЕСК. На сьогоднішній день встановлено, що зрілі яйцеклітини великої рогатої худоби і людини є єдиним видом спеціалізованих клітин, що містять високі концентрації білків-сайленсери в цитоплазмі. На цій підставі і був розроблений метод отримання гібридних ЕСК шляхом перенесення ядер соматичних клітин в без'ядерні яйцеклітини корів. Попередні дослідження in vitro показали, що цитоплазма яйцеклітин корів відновлює тотипотентність генома ядер соматичних клітин людини через 12-24 години культивування.

Певний інтерес представляють дані про особливості доімплантаційна розвитку зародків людини, що свідчать про більш пізньому, ніж у мишей, заміщення тотипотентних клітин популяцією плюрипотентних клітин. Дослідження клітинних перетворень показало, що з клітин внутрішньої клітинної маси бластоцист людини, крім ЕСК, виникають і клітини трофобласта, що вказує на їх тотальну потентность.

Відомо, що на стадії бластоцисти виникають дві по-різному коммітірованние популяції клітин. Одна з них складає зовнішній шар бластоцисти - трофектодерму, похідними якої є клітини трофобласта і інші зародкові компоненти плаценти. Друга популяція клітин згрупована в щільну масу, що контактує з внутрішньою поверхнею трофектодерми. Похідними популяції клітин внутрішньої клітинної маси виступають всі тканини і зачатки органів зародка. На стадії пізньої бластоцисти з внутрішньої клітинної маси формується Позазародкова ентодерми і утворюється епібласт (первинна ектодерма). При цьому клітини епібласта зберігають плюріпотентность, тоді як здатності до диференціювання клітин внезародишевой ентодерми обмежуються.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Отримання ембріональних стовбурових клітин людини

До недавнього часу вважалося, що отримати з трофобласта ЕСК неможливо. Однак лінія диплоїдних стовбурових клітин трофектодерми, виділена з бластоцисти, в середовищі, де замість LIF міститься FGF2 і гепарин, проліферує і трансформується в стовбурові клітини. Якщо видалити з середовища FGF2, то клітини трофектодерми припиняють розмноження, в них починається ендоредуплікація хромосом, і трофектодермальние клітинні елементи поступово перетворюються в гігантські клітини трофобласта. Ймовірно, LIF не стимулює проліферацію клітин трофектодерми внаслідок того, що FGF2 запускає інший механізм транссігналізаціі, оскільки FGF2, зв'язуючись з плазматичним рецептором (FGFR2), активує в цитоплазмі МАР-кінази - ERK1 і ERK2. Отже, при включенні в клітинах бластоцисти одного сигнального шляху (LIF - gpl30 - JAK-кінази - STAT3) клітини внутрішньої клітинної маси трансформуються в плюрипотентні ЕСК, а при активації другого механізму трансмембранної передачі сигналу (FGF2 - FGFR2 - МАР-кінази ERK1 / ERK2) в бластоцисти утворюються стовбурові клітини трофектодерми. Вибір сигнального шляху, в свою чергу, залежить від активності гена oct4. Цей ген, що належить домену POU, розташований в локусі t аутосоми 17 і експресується в процесі оогенезу, в період дроблення, а також в клітинах внутрішньої клітинної маси бластоцисти і в первинних статевих клітинах. Функціональна роль гена oct4 полягає в кодуванні транскрипційного фактора, необхідного для виникнення плюрипотентних клітин, їх диференціювання і дедиференціації.

Експресія гена oct4 в ЕСК змінюється в залежності від взаємодії цього транскрипційного фактора з кофакторами. Спрямована регуляція експресії oct4 в бластоцисти показала, що при зниженні його активності половина клітин утворює трофектодерму, тоді як при підвищенні індукованої експресії oct4 виникають переважно ЕСК.

В експерименті ЕСК не вдається перевести в лінію при культивуванні тотипотентних бластомерів на стадії дроблення, а також на стадії гаструляції і більш пізніх стадіях ембріонального розвитку. Мишачі ЕСК зазвичай виділяють на 3,5-4,5-й день вагітності, що відповідає шостій (одношарова бластоциста) і сьомий стадіях (двошаровий бластоциста - ранній яйцевої циліндр) нормального ембріогенезу. Очевидно, що тільки в доімплантаційна періоді зародки мишей містять клітинні популяції, здатні трансформуватися в ЕСК. Отже, виділення ліній ЕСК можливо лише на певних стадіях ембріогенезу. Поліпотентними, з точки зору можливості розвитку життєздатного ембріона з зародковими оболонками і плацентою, є зигота і виникають в ході дроблення бластомери. Втрата тотальної потенції зародкових клітин починається на стадії пізньої морули, коли подальше коммитирование бластомеров залежить від їх розташування. Бластомери ранньої морули зберігають тотипотентність, оскільки експериментальні маніпуляції зі зміною їх локалізації, наприклад інверсія їх розташування, не перешкоджає розвитку повноцінний зародок.

Встановлено, що на ефективність виділення ЕСК в лінію впливає стан бластоцист в момент їх експлантаціі. Використання бластоцист після моделювання семиденної діапаузи в статевому тракті мишей, оваріоектомірованних на 3,5-й день вагітності і отримували прогестерон, сприяє більш успішному виділенню ліній стовбурових ембріональних клітин. Передбачається, що в таких умовах збільшується число бластомерів, що утворюють внутрішню клітинну масу. Не виключено також, що відбувається подовження клітинного циклу і більшість бластомеров переходить в фазу G0.

Крім того, створення стабільних плюрипотентних ліній ЕСК залежить від генотипу зародків: досить легко ЕСК виділяються з бластоцист мишачої лінії 129, значно важче їх отримати при використанні мишей CS7BL / 6 і практично неможливо виділити лінію ЕСК з бластоцист мишей СВА / Са. Очевидно, ранні зародки володіють якимись генетичними особливостями, що впливають на розвиток лінії плюрипотентних ЕСК. Проте, при культивуванні ізольованого епібласта, а також за допомогою селективного відбору диференціюються клітин лінії ЕСК з ранніх зародків мишей СВА / Са все ж були виділені.

Відпрацьована стандартна техніка отримання ліній ЕСК з бластоцист приведена в лабораторних посібниках з техніки експерименту з ранніми зародками. Експериментальні лінії ЕСК можна отримати і при культивуванні ізольованого епібласта (первинної ектодерми) 4,5-денних мишачих зародків за допомогою досить складної мікрохірургічної техніки та модифікованих умов культивування. Трудомісткість цієї процедури виправдана, оскільки частота утворення ліній ЕСК при цьому виявилася значно вище, ніж в роботах з внутрішньої клітинної масою бластоцисти.

Для виділення ліній ЕСК кожен клон переносять в мікро-лунку, вирощують агрегат з 40-60 клітин, знову його диспергируют. Багаторазове повторення такої процедури дозволяє отримати імморталізованних лінію ЕСК з максимальною швидкістю проліферації нормокаріотіпних клітин, прикріплених до пластику, які через 50-100 пасажів зберігають тотипотентність і високу активність теломерази. В процесі підтримки ліній ЕСК найбільшу небезпеку становить забруднення середовища або сироватки бактеріальними ендотоксинами - навіть слідові концентрації ендотоксину в середовищі культивування викликають масову загибель незрілих зародкових клітин. При ретельному контролі за лінійним ростом і своєчасному диспергування ЕСК в культурі здатні до симетричного поділу, при якому обидві дочірні клітини залишаються плюрипотентними і здатними здійснювати необмежену кількість клітинних циклів, зберігаючи диплоїдний каріотип і тотальну потентность.

Селекцію чистої популяції ЕСК людини можна проводити після трансфекції в їх геном рекомбінантних молекул ДНК, що містять ген, який кодує синтез зеленого флуоресцентного білка (GFP). Експресія GFP збільшується при вирощуванні ЕСК в умовах, що підтримують їх проліферацію, тоді як з початком диференціювання рівень експресії цього гена знижується, що дозволяє відбирати на селективної середовищі чисті стабільні плюрипотентні клітинні лінії. При культивуванні виділених за допомогою GFP-селекції ЕСК частота утворення колоній у багато разів зростає, оскільки в умовах селекційних культур усувається потужний антипроліферативний ефект диференційованих клітин.

Переклад ембріональних стовбурових клітин людини в лінію здійснюється за допомогою методу їх виділення з доімплантаційних зародків (на стадії 80-120 клітин), які залишаються після процедури запліднення in vitro. Для цього штучно отримані "надлишкові" зародки механічно диспергують в середовищі Дельбекко-Голка. Після маркування клітин селективними моноклональними антитілами з флюоресцентной міткою ізолюються клітини ембріобласта. Ембріобласт диспергується на окремі клітини за допомогою суміші діспази-колагенази. Диссоційовані клітини вирощуються в спеціальному середовищі (80% середовища Дельбекко + 20% фетальної телячої сироватки в присутності 500 мкг / мл IL-6, LIF і SCF) над фідерним монослоем ембріональних фібробластів перших 3 пасажів. При цьому виживаність і проліферація стовбурових і прогеніторних клітин підтримується за рахунок впливу на них IL-6, LIF і SCF. В такому середовищі ЕСК ростуть суспензійними клонами ненатягнутих ошаренних клітин, які необхідно диссоциировать м'яким багаторазовим піпетуванням. Нові клони виникають в суспендованих культурі на 5-7-е добу. Максимальна швидкість росту ЕСК досягається повторним діссоціірованіем клонів на стадії 10-15 клітин. Потім кожен клон переносять в мікроячейку і вирощують до агрегату з 40-50 клітин. Процедуру повторюють багаторазово в пасажах, збільшуючи обсяг культури до щільності 5-10 млн клітин на 6-сантиметрову чашку. За допомогою такого пассірованія Томсоном було ізольовано 10 безсмертних клонів ЕСК людини, які через 100 пасажів зберігали високу активність теломерази, здатність до інтенсивної проліферації, мінімальні фенотипічні характеристики і тотальну потентность з можливістю диференціювання в будь-яку з 350 спеціалізованих клітинних ліній, які є похідними екто-, мезо - і ентодерми. Диференціація ЕСК людини починалася (при зміні середовища, додаванні сироватки і елімінації LIF) з прикріплення клітин до підкладки, що свідчить про розвиток цитоскелета і експресії рецепторів адгезії. Важливо, що при необмеженій проліферації ЕСК людини зберігали нормальний каріотип.

Другий метод виділення ліній ЕСК людини заснований на використанні первинних статевих клітин. Експериментальні дослідження показали, що лінії Їй-клітин можна отримати з статевих валиків 12,5-денних ембріонів мишей. Однак в цих випадках частота утворення прогеніторних клітинних ліній була значно нижче, ніж в дослідах з більш ранніми зародками. При цьому первинні статеві клітини з гонад мишачих зародків 13,5-денного гестаційного віку взагалі не здатні трансформуватися в лінії.

Перші стабільні лінії плюрипотентних ЕG-клітин людини були отримані з первинних гоноцитів, виділених із статевих зачатків 5-9-тижневих ембріонів. Ізольовані клітини культивували на підкладці інактивованих ембріональних фібробластів миші в середовищі DМЕМ з фетальної сироваткою, до якої додавали меркаптоетанол, форсколин, а також рекомбінантні ростові фактори людини (FGF і LIF). Через 7-12 днів в культурі з'явилися багатоклітинні колонії, за морфологічними ознаками і молекулярним маркерами відповідні ЕG-клітинам людини. Після агрегації ці клітини формували ембріоідние бичка, при подальшому розвитку яких з'являлися спеціалізовані клітини, характерні для похідних всіх трьох зародкових листків. Протягом 10-20 пасажів EG-клітинні лінії зберігали нормальний каріотип і не втрачали плюріпотентності.

Показано також, що поєднане дію LIF, мембранно-зв'язаного і розчинної факторів Steel, а також TGF-b змінює програму розвитку первинних статевих клітин. Замість того щоб припинити митотические ділення і почати диференціюватися в напрямку оогенезу або сперматогенезу, первинні статеві клітини продовжують пролиферировать. Після здійснення кількох додаткових митотических циклів вони стають схожими з клітинами епібласта і, втрачаючи властивості попередників статевих клітин, перетворюються в плюрипотентні ембріональні стовбурові EG-клітини.

Таким чином, в 1998 році з статевого зачатка фетальної аутопсійної тканини людини вперше були виділені імморталізованних лінії первинних статевих клітин. В ембріогенезі людини первинні статеві клітини з'являються в желточном мішку на 3-му тижні розвитку, а на 4-5-му тижнях ці клітини мігрують в зону статевого горбка, де утворюють дормантние популяції первинних гоноцитів. У неактивному стані первинні статеві клітини зберігаються в зародку аж до народження. Лінії первинних статевих клітин виділяються з фетального статевого горбка 5-9-тижневих ембріонів, витягнуту тканину якого ex tempore обробляють сумішшю коллагеназ IV-V типів, гіалуронідази і ДНКази для підвищення кількісно-якісного виходу клітин. Первинні статеві клітини в тканини фетального статевого горбка оточені Стромальні (мезенхімальних) клітинами Сертолі. Функціональне призначення клітин Сертолі полягає в продукції антиапоптозних факторів (Fas-ліганд), митогенов, а також імуносупресорів, що захищають статеві стовбурові клітини від імунної атаки з боку організму. Крім того, стромальних мікрооточення статевого горбка грає важливу роль в дозріванні гамет. Виділені первинні статеві клітини висаджують в культуру над фідерним стромальних шаром, що складається з фетальних фібробластів перших трьох пасажів. Найбільш ефективною комбінацією митогенов визнаний комплекс, що складається з LIF, FGF і форсколина (стимулятор утворення цАМФ). Проліферація первинних статевих клітин in vitro вимагає додавання фетальної сироватки, в присутності якої розмноження первинних гоноцитів в культурі супроводжується утворенням клонів кулястих, ненатягнутих до підкладки клітин.

У Національному інституті здоров'я США на підставі узагальнення існуючих відомостей про методи виділення ліній ЕСК людини з бластоцисти було зроблено попередній висновок про те, що успішне виділення ЕСК найбільш ймовірно при культивуванні бластоцист з добре сформованою внутрішньої клітинної масою (Stem cells: scientific progress and future research directions . Nat. Inst, of Health USA). З цієї точки зору, оптимальним джерелом ЕСК для створення ліній є бластоцисти людини 5-го дня розвитку, з яких при виділенні внутрішньої клітинної маси слід ретельно видаляти трофектодерму. Ізольовану внутрішню клітинну масу, що складається на цій стадії з 30-35 клітин, необхідно культивувати на підкладці ембріональних мишачих фібробластів, що є вирішальною умовою для утворення в культурі колоній ЕСК.

Fналіз фенотипических особливостей ембріональних стовбурових клітин

Певний інтерес представляє міжвидової порівняльний аналіз фенотипічних особливостей ЕСК. Встановлено, що колонії ЕСК людини - це щільні скупчення сплощених, епітеліоподобних клітин, тоді як ембріоідние тільця мишей складаються з пухкого конгломерату округлих клітин. У ЕСК людини індекс ядерно-плазматичного співвідношення нижче, ніж в мишачих ЕСК. Ембріональні стовбурові клітини мавп формують більш плоскі колонії клітин з нерівними краями. У ранніх клонах ЕСК приматів легко проглядаються окремі клітини. Проліферуючі ЕСК всіх вивчених видів тваринах не експресують молекули МНС I і II класів. У той же час ЕСК людини дають позитивну реакцію на антитіла TERA 1-60 і GCTM-2, що свідчить про наявність на їх поверхні кератин / хондроітінсульфатних протеогліканів, характерних для ембріо- (тератому) -карціномних стовбурових клітин. Експресія в ЕСК всіх видів тварин гена oct4 дозволяє припустити, що, незважаючи на фенотипічні відмінності, в ЕСК людини і миші, мабуть, активується один і той же набір генів, який відповідає за збереження плюріпотентності (Peru, 2001). Крім того, лінії ЕСК, виділені з ембріонів щурів, свиней, кролів, приматів і великої рогатої худоби, мають подібні морфологічні характеристики, схожий набір молекулярних ідентифікаційних маркерів і майже ідентичний молекулярний механізм для реалізації програм ембріогенезу, що дозволяє по-новому поглянути на проблему ксенотрансплантації .

На відміну від нормального ембріогенезу in vivo, проліферація ЕСК in vitro не супроводжується утворенням зародкових листків і протікає на тлі блокування гомеозісних Нохгенов, тобто, без органогенезу. Оскільки гени сегментації не функціонують, в культурі ЕСК неможливо відтворити такі періоди ембріогенезу, як закладка сомітов, сегментація зародка, формування жовткового мішка, алантоїса і інших провізорних органів і тканин. Культуральні ЕСК як би застигли на початку процесу утворення 350 рестрикційних ліній спеціалізованих клітин. Таким чином, клон дочірніх прогеніторних клітин і центрально локалізована ЕСК є лише модель ембріона, в процесі розвитку якого в різних тканинних регіонах одномоментно формуються різні лінії спеціалізованих клітин, що відбуваються, проте, із загальних попередників. Незважаючи на мінімальний рівень рецепторів на поверхні ЕСК, вони зберігають здатність здійснювати примітивні формообразовательние процеси, імітуючи об'ємні структури раннього зародка: суспензія ЕСК в культурі агрегує і утворює структури, що нагадують бластоцисти або навіть більш пізні зародки (яйцеві циліндри). Такі суспензійні агрегати відповідно отримали назву простих і складних ембріоідних тілець.

При змішаній диференціювання в різних клітинах одного ембріоідних тільця одночасно експресуються ранні гени ектодерми (oct3, fgf-5, nodal), ентодерми (gata-4), мезодерми (brachyury), кардіогенний мезодерми (ПКХ-2,5), нейтральні трубки (msx3 ) і кровотворення (elkf). За допомогою різних комбінацій ростових факторів і цитокінів для спрямованого впливу на формування клітин зародкових листків in vitro в ряді випадків вдалося отримати ембріоідние тільця, в яких переважно були експресувати гени ектодерми або мезодерми, що відкриває шлях до моделювання гаструляції і початкових фаз органогенезу.

Клональний зростання ЕСК є свідченням асиметричного розподілу клітин, при якому лише одна з ЕСК в центрі клону зберігає необмежений потенціал розмноження, в той час як друга дочірня клітина породжує покоління прогеніторних клітин, вже виходять в диференціювання. Тому швидкість розмноження клону на периферії ембріоідних тільця вище, ніж в центрі. Крайові клітки зростаючого клону зазнають спонтанної невпорядкованою диференціювання, мігрують або гинуть за механізмами апоптозу. Ці події визначають долю клону: якщо швидкість проліферації перевищує швидкість міграції та апоптотической загибелі клітин, розміри клону продовжують збільшуватися, стабілізація настає при рівності швидкості апоптозу і швидкості утворення нових клітин, регрес - при зворотному співвідношенні цих процесів. Прогеніторні клітини діляться симетрично, тобто, обидві дочірні клітини в подальшому диференціюються в зрілі спеціалізовані клітинні лінії. Співвідношення ЕСК / прогеніторні клітини варіює, проте завжди кількість ЕСК становить лише частки відсотка від популяції прогеніторних клітин. Тому тільки ретельне піпетування і своєчасна дезагрегації клонів здатні збільшити число ЕСК в культурі. Для отримання максимального виходу ЕСК найбільш ефективною виявилася дезагрегації клонів на стадії 10-12 клітин. Напрямок та ступінь диференціювання клітин в ембріоідних тільце залежать від їх розташування. Зовнішні клітини ембріоідних Тельці не експресують ген oct4 і піддаються диференціації в клітини первинної ентодерми, з яких в подальшому утворюються епітеліоподобние клітини парієтальної і вісцеральної внезародишевой ентодерми. Внутрішні клітини ембріоідних тільця експресують ген oct4 і зберігають плюріпотентность протягом 48 годин культивування. Однак потім відбувається морфологічна перебудова культури в епітеліальний моношар і починається експресія генів, що контролюють розвиток первинної ектодерми. Далі починається процес тотальної невпорядкованою цітодіфференціровкі з появою різних клітинних типів, які є похідними всіх трьох зародкових листків. В процесі спонтанної диференціювання клітин ембріоідних тільця першими виникають агрегати з маркерами ентодерми у вигляді фрагментів (цист) жовткового мішка. Далі в цих структурах з'являються ангіобласти і клітини ендотелію зростаючих капілярів. На завершальних етапах спонтанної диференціювання з внутрішніх клітин ембріоідних тільця розвиваються різноманітні термінально диференційовані клітини, включаючи нейрони, гліальні елементи, кардіоміоцити, макрофаги і еритроцити. У певному наближенні (з огляду на просторову інверсію формування листків зародкової тканини), за допомогою ембріоідних тілець можна in vitro досліджувати морфогенетические процеси і аналізувати молекулярні механізми початкових періодів ембріональної цітодіфференціровкі, а також встановити роль конкретних генів в реалізації цих процесів.

Таким чином, в межах клону знаходяться клітини, в яких відкриті різні генетичні програми розвитку - ЕСК, ранні прогенітори і диференціюються прогеніторні популяції. Культивування ЕСК методами висячої краплі або масової культури без фидерного шару і без додавання в середу LIF неминуче призводить до формування ембріоідних тілець. Морфологія клітин зовнішнього і внутрішнього шарів ембріоідних тілець відрізняється. Зовнішній шар складається з великих, отростчатих клітин. Їх поверхня, звернена до навколишнього середовища, покрита численними микроворсинками. Зовнішній шар клітин відділений від внутрішнього базальноїмембраною, що нагадує мембрану Рейхерт, тоді як клітини внутрішнього шару ембріоідних тілець є циліндричний епітелій. Морфологічно внутрішній шар, хоча і містить багато клітин, які діляться, більше нагадує недиференційовані колонії ЕСК.

Особливості ембріональних стовбурових клітин людини

Відсутність паренхиматозно-мезенхімальних сигнальних взаємодій на тлі блокування генів гомеозіса призводить до неупорядкованого зростання ЕСК в культурі, так як при цьому порушується закладка і формування інфраструктури провізорних органів. Неорганізований зростання і безладна спонтанна диференціювання ЕСК в культурі обумовлені відсутністю мезенхимальной розмітки стромального каркасу майбутніх органів: in vitro цілком можливе формування мільйонів гепатоцитів, але не можна отримати жодної часточки печінки, що включає такі структурно-функціональні елементи, як синуси, простору Діссе і клітини Купфера.

Вважається, що плюріпотентность ЕСК реалізується виключно в ембріогенез з утворенням тканин і органів зародка, тоді як плацента і пуповина є похідними трофобласта. Ув'язнені в трофектодермальную оболонку ЕСК послідовно генерують клони провізорних клітин, що реалізують програму розвитку за допомогою комбінаторики мРНК по об'ємної топографічної матриці Нохтеяов, які зумовлюють просторове розташування, форму і розміри, число клітин провізорних і дефінітивних органів, а також збірку паренхіми в структурно-функціональні одиниці. При цьому ЕСК залишаються єдиним типом клітин, в яких молекулярний механізм реалізації їх потенцій абсолютно роз'єднані з генетичною програмою розвитку, а самі ЕСК позбавлені можливості взаємодії з іншими клітинами через блокування як рецепторних сприйняття, так і систем транссігналізаціі. Однак адекватна активація ЕСК призводить до поетапного розгортання програми ембріогенезу, що закінчується народженням повністю сформованого і готового до позаутробного життя організму, що складається з мільярдів клітин. На цьому короткому в часі, але неймовірно боргом в клітинному просторі шляху неминуче виникнення помилок як в молекулярних механізмах, що забезпечують життєдіяльність клітин, так і в програмах, які контролюють їх проліферацію, диференціювання та спеціалізацію. Тому в сучасній фармакогеноміка окремо розглядаються хвороби молекулярного пристрою і хвороби програмування клітин. Причому дія більшості нових лікарських засобів направлено на корекцію саме програм диференціювання, проліферації і органогенезу, а також регенерації органів і тканин. У дорослому організмі за допомогою ЕСК стає можливим керувати поведінкою стовбурових / прогеніторних клітин, трансплантуються в мозок, печінку, селезінку, кістковий мозок та інші органи людини для відновлення пошкодженої паренхіми органів реципієнта за рахунок диференціювання і спеціалізації донорських клітин на збереглася мезенхимальной матриці. По суті, програма тотіпотентності починає реалізацію ще на рівні геномів ооцита, зиготи і бластомер, однак ці клітини поки не вдається клонувати і пасерувати в кількостях, необхідних для потреб експериментальної та практичної медицини. Тому ЕСК залишається унікальним джерелом генетичної інформації, що містить коди тривимірної карти зародка і коди лінійної рестрикції спеціалізованих клітинних ліній в період гаструляції.

Практично безмежні регенеративні можливості ЕСК обумовлені тим, що їх геном, на відміну від генетичного апарату диференційованих соматичних клітин, зберігає плюріпотентность. Одним з проявів дормантного стану закладеної в ЕСК генетичної інформації є так званий мінімальний фенотип - на поверхні ЕСК експресувати обмежене число рецепторів, і, відповідно, розгорнуто вкрай мало програм транссігналізаціі для взаємодії ядерного апарату клітини з її мікрооточенням. На тлі глибокого сну генів, відповідальних за рестрикцию спеціалізованих клітинних ліній і диференціювання клітин, активовано всього близько 30 з 500 генів, продукти яких забезпечують зв'язок клітини з навколишнім микросредой. За допомогою методу серійного аналізу генної експресії показано, що при спільності роботи основних функціональних боксів генома, що регулюють енергетику і метаболізм в соматичних клітинах і ЕСК, в останніх визначається досить низький рівень мРНК рецепторів, G-білків, вторинних месенджерів, транскриптаз, кофакторов експресії і репресії , тобто, всієї системи трансмембранної передачі регуляторного сигналу в клітину. Це пов'язано з відсутністю або дуже низькою експресією генів транссігналізаціі. У період індукованої диференціювання в геномі ЕСК синхронно припиняють роботу 18 функціонуючих генів на тлі активації 61 гена транссігналізаціі, контролюючих синтез рецепторів клітинної адгезії, компонентів екстрацелюлярного матриксу, рестрикційних транскриптаз і мессенджерних елементів системи передачі сигналу на ядерний апарат з рецепторів плазматичної мембрани клітин. Одночасно блокується експресія генів, відповідальних за синтез білків-сайленсери, а також коінгібіторов генної експресії, які забезпечують тотипотентність генома ЕСК.

Для клітин всіх трьох зародкових листків знайдені генні маркери. Ідентифікація ектодермального шару клітин проводиться по експресії генів nodal, oct3 і fgf-5, клітин мезодерми - генів brachyury, zeta-globin, ентодерми - по експресії гена gata-4. У нормальному ембріогенезі в період гаструляції спостерігається активна міграція незрілих популяцій стовбурових і прогеніторних клітин, локально що позначають зони розвитку кісток лицьової частини черепа, деяких відділів головного мозку, периферичної нервової системи, провідної системи серця і тимуса, тканини яких формуються з клонів клітин-переселенців. Маркування клітин по раннім генам зародкових листків полегшує завдання топографічного аналізу процесів міграції клітин-попередників в розвиненому ембріоні. Встановлено, зокрема, що в агрегатах клітин ембріокарціноми Р19 експресія першого гена мезодерми brachyury починається в період зниження експресії генів тканинного активатора плазміногену, а-фетопротеїну, кератину 8 і кератину 19, які є маркерами перших мігруючих популяцій мезодерми. Отже, формування тканин мезодермального походження починається тільки після завершення процесу точкового міграції і розселення мезодермальних клітин-попередників.

При вкрай обмежених фенотипических ознаках і відсутності більшості блоків транссігналізаціі ЕСК все ж експресують деякі рецепторні молекули, які можна використовувати для їх ідентифікації. Примітно, що антигени-маркери ЕСК у людини і приматів виявилися загальними. Найчастіше для маркування ЕСК використовують мічені антитіла до мембранозв антигенів SSEA-3, SSEA-4 (унікальні ліпідні антигени, що представляють комплекс гліколіпіду GL7 з сиаловой кислотою), а також високополімерні глікопротеїди TRA-1-81, TRA-1-60. Крім того, ЕСК експресують специфічний ембріональний антиген SSEA-1 і ендогенну лужну фосфатазу, а також специфічний транскрипційні фактор Oct4. Останній необхідний для підтримки механізмів проліферації ЕСК - специфічний транскрипційні фактор Oct4 активує експресію гена фактора росту фібробластів 4 і стабілізує експресію боксу генів, відповідальних за нелімітовані редуплікацію ДНК в незрілих клітинах. Найбільш важливими внутрішньоклітинними маркерними білками є Oct3, Oct4, Tcf і Groucho, що відносяться до білків-сайленсери хроматину.

Практично відразу після того як багаторічні спроби культивувати ЕСК поза організмом увінчалися успіхом і були отримані перші культури стовбурових клітин, виділених з бластоцист миші, а також культури первинних статевих клітин, почався етап досліджень плюрипотентні потенціалу ЕСК при їх введенні в ембріони на ранніх стадіях розвитку. Було показано, що на стадії морули і бластоцисти ЕСК здатні формувати химерні зародки, в яких нащадки донорських ЕСК виявляються у всіх соматичних тканинах і навіть в гаметах. Таким чином, в біології розвитку за допомогою ЕСК був встановлений "міст" між експериментальними дослідженнями in vivo і in vitro, що значно розширило можливості вивчення процесів закладки первинних тканин і органів, їх диференціювання і ембріонального органогенезу.

Чітко встановлено, що in vivo в процесі ембріогенезу ЕСК інтегруються в клітинну масу раннього зародка, а їх похідні виявляються у всіх органах і тканинах. ЕСК колонізують в химерному зародку лінію статевих клітин, нащадки яких утворюють повноцінні яйцеклітини і спермії. Ембріональні стовбурові клітини клоногенних - одинична ЕСК здатна створити генетично ідентичну колонію клітин з молекулярними маркерами, до яких відноситься експресія гена oct4 і лужної фосфатази, висока активність теломерази, а також експресія певних ембріональних антигенів.

Для вивчення механізмів ембріогенезу за допомогою ЕСК розроблена методика хімерізаціі морули шляхом створення біологічної конструкції, зовні якої розташовується шар тетраплоідних бластомеров реципієнта, а всередину вводяться донорські ЕСК. Таким чином, трофобласт формується з нащадків тетраплоідних бластомеров реципієнта, що забезпечує імплантацію і плацентацію, а донорські ЕСК виступають в ролі внутрішньої клітинної маси, з якої утворюється тіло життєздатного зародка і лінія первинних прогеніторних статевих клітин. Дослідницька цінність ЕСК полягає не тільки в тому, що при маніпуляціях in vitro з їх геномом зберігається плюріпотентность, але і в тому, що при цьому зберігається здатність ЕСК брати участь в утворенні первинних статевих клітин химерного зародка. Показано, що нащадки всього однієї генетично модифікованої ЕСК заселяють всі первинні зачатки і формуються тканини химерного ембріона, отриманого за допомогою агрегації або кокультівірованія цієї клітини з 8-клітинним зародком. При трансплантації в Морула мишей ЕСК, трансфекованих геном зеленого флуоресцентного протеїну, флуоресцентні нащадки цієї клітини були виявлені у всіх досліджуваних тканинах ембріона (Shimada, 1999). Трансплантація ЕСК в Морула дозволяє створювати життєздатних мишей, організм яких складається тільки з нащадків донорської ЕСК, що відкриває перспективи для різних варіантів терапевтичного клонування. Зараз такий методичний підхід успішно застосовується для вивчення проблем біології розвитку, зокрема, з його допомогою проводять аналіз механізмів генетичної інактивації Х-хромосоми або епігенетичної нестабільності ЕСК. Трансплантація ЕСК в ранній зародок використовується і в біотехнологіях сільського господарства, а також в експериментах по генотерапіі.

Пересадки генетично модифікованих ЕСК застосовуються для тестування клітин-мішеней мутантних генів. Культивовані in vitro ЕСК використовуються в біотехнологіях по створенню нокаутних мишей. Для цього за допомогою гомологичной рекомбінації з ЕСК видаляють підлягає дослідженню ген (нокаут) і на селективних середовищах виділяють клітини, позбавлені цього гена. Потім нокаутні ЕСК вводять в бластоцисту або проводять їх агрегацію з бластомерами морули. Отримані таким чином химерні ранні зародки трансплантують самкам-реципієнтам, і серед новонароджених мишей відбирають особин з гаметамі, нуллізіготнимі з даного гену. За цією технологією створено безліч ліній нокаутних мишей, які широко використовуються в експериментальній біології та експериментальної медицини. На таких біологічних моделях вивчається значення тих чи інших генів в ембріональному розвитку, а також їх роль у механізмах захворювань і патологічних станів людини. Крім того, лінії нокаутних тварин застосовуються при проведенні етапу доклінічних випробувань нових способів генотерапіі. Наприклад, за допомогою трансфекції в геном ЕСК нормального алеля мутантного гена вдається ефективно коригувати мутацію, що вражає систему кровотворення. Введення в ЕСК чужорідних генів дозволяє прискореними темпами створювати лінії гомозиготних трансгенних лабораторних тварин. Однак слід зауважити, що техніка спрямованої рекомбинационной делеции генів надійно відпрацьована поки ще тільки щодо ЕСК мишей. За допомогою мишачих ЕСК з подвійним нокаутом встановлена функціональна роль області скупчення генів на 7-й хромосомі (копія геномного ділянки на 19-й хромосомі людини), а також проксимального ділянки 11-ї хромосоми (копія 5д-хромосоми людини) - делеція даних генів в ЕСК мишей дозволила оцінити функцію їх аналогів у людини.

Розширилися можливості дослідження функції генів ембріогенезу людини, трансфекція яких в геном ЕСК лабораторних тварин дозволила, зокрема, уточнити роль гена crypto в закладці і формуванні кардіогенний мезодерми, гена рах-6 - в ембріогенезі очі. Складаються перші карти експресії генів в незрілих проліферуючих ЕСК тератокарціноми і бластоцисти мишей, підтверджена переважна репресія в ЕСК генів транссігналізаціі. Комбінація з 60-80 мутантних ЕСК і 20-30 клітин нормальних доімплантаційних мишачих зародків призводить до розвитку химерних ембріонів, у яких закладки органів складаються з донорських та реципієнтних клітин, що дозволяє з'ясувати роль невідомих генів в гаструляції і органогенезу. Функціональну карту генів, що розвиваються зародків миші поповнили відомості про роль гена sf-1 в закладці надниркової залози і статевих зачатків, гена wt-1 - в закладці нирки, генів сімейства myoD - в закладці скелетного м'яза, генів сімейства gata-1-4 - в рестрикційний дозріванні зачатків еритро- і лімфопоезу.

Направлене вимикання материнського і батьківського алелей генів в ЕСК за допомогою векторних рекомбіназа дозволило уточнити функції різних генів в ранньому періоді ембріогенезу, а технологія спрямованого перенесення невідомих генів людини в ЕСК миші сприяє відкриттю нових мутантних генів, відповідальних за розвиток важкої спадкової патології. З використанням нокаут-методу визначено облигатное значення деяких генів для закладки ембріональних тканин: gata-4 - для міокарда, gata-1 - для еритроїдного паростка кровотворної тканини, myoD - для скелетних м'язів, brachyury - для мезодерми, рестрикційних транскриптаз hnf3 і hnf4 - для стовбурових клітин печінки, rag-2 - для закладки клонів Т- і В-лімфоцитів (Рєпін, 2001). Подвійна делеция генів в ЕСК відкрила доступ до вивчення функціональної ролі генів зародкових листків, сегментації і гомеозіса, а трансплантація ЕСК дала можливість отримання життєздатних міжвидових зародків-гібридів. За допомогою вдосконаленої методики трансплантації єдиною донорської ЕСК в 8-клітинний зародок доведений факт хімерізаціі на клітинному рівні багатьох органів ембріона-реципієнта. Зауважимо, що клітинні паростки тканини людини виявлені в органах мишей-реципієнтів і після введення гемопоетичних стовбурових клітин людини в бластоцисту. Встановлено, що у мишачих зародків в період формування органів в крові циркулюють плюрипотентні ЕСК. Не виключено, що їх біологічна функція полягає в ембріональної організації майбутньої імунної системи. За допомогою ЕСК в лабораторних умовах відтворені адекватні моделі генетичної патології людини: подвійний нокаут гена дистрофина моделює у мишей м'язову дистрофію Дюшенна, вимикання гена atm (контроль синтезу сигнальної кінази хроматину) - атаксія-телеангектазію. При цьому фатальному спадковому захворюванні у дітей через дефекти репарації ДНК розвивається дегенерація клітин Пуркіньє в мозочку, що супроводжується інволюцією тимуса внаслідок загибелі проліферуючих клітин. Клініка, патофізіологія і патоморфологія атаксії-телеангек- тазіі, відтвореної за допомогою привнесення в ЕСК патологічної генетичної інформації, у мишей-химер відповідають таким у людини. Крім атаксії-телеангектазіі з використанням ЕСК і нокаутних мишей розроблені експериментальні моделі деяких спадкових гомозиготних захворювань людини, пов'язаних з патологією вуглеводного і ліпідного обміну, катаболізму амінокислот, виведення міді і білірубіну, що значно розширило можливості експериментальної медицини на етапі доклінічних випробувань нових способів лікування відповідних хвороб людини.

[12], [13], [14], [15]

Використання цітогібрідов стовбурових клітин

Гібридні клітини, отримані шляхом злиття ЕСК з соматичними клітинами, є адекватну і перспективну модель для вивчення плюріпотентності стовбурових клітин і репрограммірованія хромосом диференційованих клітин. Цітогібріди, отримані методом злиття ЕСК з диференційованими клітинами дорослої тварини, дають можливість вивчати взаємини геномів різного "віку": складається унікальна ситуація, коли гомологічні хромосоми, що походять з клітин різних стадій диференціювання і різного ступеня зрілості, знаходяться в одному ядрі, де вони можуть легко обмінюватися трансдействующімі регуляторними сигналами. Важко передбачити, як будуть реагувати цісрегуляторние епігенетичні системи гомологічниххромосом, що склалися в ході ін індивідуальної розвитку, у відповідь на вплив трансдействующіх сигналів, що виходять від ембріональних родинних геномів. Крім того, в гібридних клітинах відбувається сегрегація батьківських хромосом, що дозволяє вивчати взаємодію геномів на рівні окремих хромосом, тобто, потенційно ідентифікувати участь конкретних хромосом в підтримці плюріпотентності або, навпаки, виходу в диференціювання.

У якості першої експериментальної моделі для вивчення взаємодії геномів з різною "історією розвитку" використовувалися цітогібріди, отримані при злитті плюрипотентних тератокарціномних і диференційованих соматичних клітин. У деяких випадках такі гібридні клітини зберігали плюрипотентні властивості на досить високому рівні. Зокрема, in vivo тератокарціномно-соматичні гібридні клітини индуцировали розвиток справжніх тератом, що містять деривати всіх трьох зародкових листків, a in vitro в суспензійних культурах формували ембріоідние тільця. Навіть у міжвидових цітогібрідов такого типу зазначалося наявність ембріональних антигенів в тих випадках, коли соматичними партнерами в злитті з клітинами тератокарціноми були лімфоцити або тімоціти. Примітно, що цітогібріди, створені при злитті тератокарціномних клітин з фібробластами, за фенотипом відповідали фібробластам.

Найбільш важливим встановленим фактом є те, що в тератокарціномно-соматичних гібридних клітинах з'являлися ознаки репрограммирования геному диференційованих клітин, що характеризувалося реактивацией або окремих генів, або неактивній Х-хромосоми соматичного партнера. Таким чином, результати досліджень на цітогібрідах типу тератокарціномно-соматичних клітин свідчать про те, що в гібридних клітинах нерідко зберігається плюріпотентность і є ознаки репрограммирования геному соматичного партнера.

В експериментах з отримання внутрішньовидових ембріональних гібридних клітин шляхом злиття ЕСК миші з спленоцитах дорослої тварини вивчена характеристика таких цітогібрідов, проведено аналіз сегрегації батьківських хромосом і дана оцінка плюріпотентності гібридного геному. Для внутрішньовидових гібридних клітин, отриманих від злиття клітин тератокарціноми з соматичними клітинами, зазвичай характерний низький рівень сегрегації хромосом з тетраплоидной або околотетраплоідним кариотипом. Подібний хромосомний склад спостерігався в цітогібрідах при злитті первинних статевих клітин з лімфоцитами. У той же час у міжвидових гібридних клітин, отриманих в результаті злиття мишачих тератокарціномних клітин з лімфоцитами норки, відзначалася інтенсивна сегрегація хромосом соматичного партнера.

Якісно новий етап дослідження сегрегації батьківських хромосом у внутрішньовидових гібридів настав після розробки методу аналізу мікросателітів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, завдяки якому на кожну хромосому миші знайдено кілька сотень маркерів, що дозволяють надійно дискримінувати будь-яку пару гомологічних хромосом в гібридних клітинах.

Шляхом злиття ЕСК (використовувалися клітини НМ-1, дефіцитні за активністю гіпоксантінфосфорібозілтрансферази, 2п = 40, XY, виділені з бластоцист мишей лінії 129 / 01а) зі спленоцитах мишей конгенной лінії DD / c вдалося отримати набір гібридних клонів, морфологічно мали схожість з ЕСК. Всі клони були виділені на селективної середовищі, в якій можливе зростання тільки клітин з активною гіпоксантінфосфорібозілтрансферазой. Електрофоретичний аналіз показав наявність у всіх клонів аллельного варіанти гіпоксантінфосфорібозілтрансферази, характерного для мишей DD / c. За допомогою цитогенетичного аналізу було встановлено, що з чотирьох гібридних клонів три мали околодіплоідний набір хромосом. Один околотетраплоідний клон містив дві популяції гібридних клітин, одна з яких була тетраплоидной, а друга, менша - диплоидной.

Аналіз мікросателітів, що дозволяє дискримінувати будь-яку пару гомологічних хромосом мишей 129 / 01а та DD / c, в гібридних клонах з околодіплоідним набором показав, що в двох клонах відбулася чітка переважна елімінація аутосом соматичного партнера. Більшість аутосом в клонах HESS2 і HESS3 мали маркери лінії 129 / 01а, тобто, плюрипотентні партнера. Виняток склали хромосоми 1 і І: в клонах HESS2 і HESS3, поряд з маркерами НМ-1 клітин, в невеликій кількості присутні маркери соматичного партнера. Такі результати можуть відображати неповноту сегрегації хромосом 1 і І соматичного партнера і узгоджуються з цитогенетическими даними про те, що трисомія за цими хромосомами спостерігається в 30-40% клітин клонів HESS2 і HESS3. Клон HESS4 істотно відрізнявся по хромосомному складу: багато аутосоми в цьому клоні походили з генома ЕСК (хромосоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 і 17), однак хромосоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 і 19 були представлені гомологами обох батьків. Кількісне співвідношення мікросателітів, маркованих ці гомологічні хромосоми, приблизно відповідало 1: 1. Це дозволило авторам припустити, що один гомолог має походження з генома ЕСК, а інший - з диференційованих клітин. У деяких субклонов клону HESS4 спостерігалося присутність тільки маркерів хромосом 18 і 19 соматичного партнера. Отримані результати свідчать, що в клітинах клону HESS4, крім сегрегації хромосом соматичного партнера, відбулася елімінація одного або обох гомологів перерахованих вище хромосом плюрипотентні генома, тобто, мала місце двостороння сегрегація хромосом обох батьків - явище вельми незвичайне, оскільки для цітогібрідов характерна сегрегація хромосом тільки одного з батьків.

Крім того, після 20-го пасажу все клони гібридних клітин містили виключно маркери Х-хромосоми соматичного партнера, тобто, в клонах відбулася заміна Х-хромосоми ЕСК на Х-хромосому соматичного партнера. Підтверджують цей найважливіший факт дані in situ гібридизації з використанням ФИТЦ-міченого зонда, специфічного для Х-хромосоми миші: позитивний сигнал виявлявся лише на одній хромосомі. Слід зазначити, що на більш ранніх термінах культивування (до 15-го пасажу), згідно цитогенетичним даними, у багатьох клітинах присутні дві Х-хромосоми. Отже, використання селективних середовищ дозволяє маніпулювати хромосомним складом гібридних клітин і направлено відбирати клони, що несуть одиничні хромосоми соматичного партнера на тлі генома ЕСК.

Оскільки унікальною особливістю генома цітогібрідов є локалізація батьківських геномів в одному ядрі, природно, виникає питання про збереження плюрипотентних властивостей ембріонального генома в ЕСК-соматичних клітинних гібридах в умовах його тісного контакту з геномом диференційованої клітини. Морфологічно цітогібріди ЕСК і соматичних клітин мали схожість з батьківської лінією ЕСК. Оцінка плюріпотентності показала, що всі клони з околодіплоідним набором хромосом були здатні утворювати в суспензійних культурах ембріоідние тільця, в яких були присутні похідні трьох зародкових листків.

Більшість гібридних клітин містило антиген ЕСМА-7 - маркер, характерний для ранніх ембріонів миші, а також мало високою активністю лужної фосфатази. Найбільш переконливі дані про високі плюрипотентних властивості гібридних клітин були отримані в експериментах з отримання серії ін'єкційних химер за участю гібридних клітин клону HESS2. Аналіз біохімічних маркерів показав, що нащадки донорських гібридних клітин перебували в більшості тканин химер. Отже, гібридні клітини, отримані шляхом злиття ЕСК і соматичних диференційованих клітин, зберігають плюріпотентность на високому рівні, включаючи здатність формувати химери при введенні в порожнину бластоцисти.

Клони HESS2 і HESS4 суттєво різнилися за складом батьківських хромосом, однак мали подібні плюрипотентні властивості. Можна було б вважати, що плюріпотентноств 'в гібридному геномі проявляє себе як ознака домінантний, проте не виключено, що не всі хромосоми ембріонального генома залучені в процес підтримки плюріпотентності. Якщо таке припущення справедливо, то можна очікувати, що елімінація деяких хромосом плюрипотентні партнера з генома гібридних клітин не супроводжуватиметься зміною їх плюрипотентні статусу. У цьому випадку аналіз сегрегації батьківських хромосом в ембріональних гібридних клітинах дозволив би впритул наблизитися до ідентифікації хромосом, відповідальних за контроль плюріпотентності ембріональних клітин.

О. Сєров і співавтори (2001) не виявлено серед 50 нащадків, отриманих при схрещуванні химер з нормальними мишами, таких, які мали б генотип мишей 129 / 01а та несли Х-хромосому мишей DD. Автори бачать причину цього в зниженні плюріпотентності в гібридних клітинах під впливом соматичного генома. Альтернативним поясненням може бути негативний вплив трисомії за деякими аутосомам і незбалансованість за статевими хромосомами (XXY спостерігалися в клітинах до 15-го пасажу) в гібридних клітинах при проходженні ними мейозу. Відомо, що клітини XXY не в змозі пройти мейоз і утворювати гамети. Трисомія здатна також викликати зниження проліферативної активності гібридних клітин, в результаті чого виборче право в розвитку химер може належати клітинам реципієнтного ембріона. З цього випливає, що для адекватної оцінки плюрипотентні потенціалу гібридних клітин необхідно отримати гібридні клони з нормальним диплоїдним набором хромосом.

В експериментах О. Сєрова та співавторів (2001) була вперше показана можливість репрограммірованія Х-хромосоми соматичної клітини в геномі гібридних клітин. Такий висновок авторів випливає з аналізу експресії у химер гена hprt (маркер Х-хромосоми): присутність аллельного варіанти hprt мишей DD / c було виявлено у всіх аналізованих химерних тканинах. Доречно підкреслити, що після введення гібридних клітин в порожнину бластоцисти цітогібріди потрапляють в неселективні умови і збереження Х-хромосоми в геномі гібридних клітин означає, що вона стала його облігатним компонентом і геном НЕ дискримінує її від У-хромосоми плюрипотентні партнера.

Підсумовуючи результати аналізу взаємодії соматичного і плюрипотентні геномів в гібридних ембріональних клітинах, автори роблять висновок, що в деяких цітогібрідах плюріпотентность проявляється як домінантна ознака. Гібридний геном здатний перепрограмувати індивідуальні хромосоми диференційованих клітин, що, однак, не виключає можливості зворотного впливу соматичного генома на плюріпотентность ембріонального генома. При культивуванні гібридних клітин індукція диференціювання відбувається значно частіше, ніж у вихідній батьківській лінії ЕСК НМ-1. Подібний ефект спостерігається і при формуванні первинних колоній: багато первинні колонії ембріональних гібридних клітин диференціюються на ранніх стадіях утворення з великими втратами клонів в ході їх селекції та розмноження.

Таким чином, цітогібріди, створені при злитті ЕСК з соматичними клітинами, незважаючи на тісний контакт з геномом диференційованих клітин, зберігають плюріпотентность як унікальну властивість ембріонального генома. Більш того, в таких гібридних клітинах можливо репрограммирование індивідуальних хромосом, що походять з діффренцірованних клітин. Залишається неясним, наскільки повно зберігаються плю- ріпотентние властивості ембріонального генома в гібридних клітинах, зокрема, їх здатність брати участь у формуванні зародкового шляху у химер. Для цього необхідно отримання ембріональних гібридних клітин з нормальним каріотипом. У будь-якому випадку плюрипотентні ембріональні гібридні клітини можуть стати реальною генетичної моделлю для ідентифікації хромосом, залучених в підтримку плюріпотентності або контролюючих, оскільки двостороння сегрегація батьківських хромосом потенційно надає таку можливість.

Не менш привабливим є аналіз феномена, який О. Сєров і співавтори (2001) визначають як "хромосомну пам'ять". У гібридному геномі гомологічні хромосоми знаходяться в двох альтернативних конфігураціях: гомологи соматичного партнера одного разу зазнали диференціювання, тоді як у гомологів плюрипотентні партнера цей процес тільки починається. Отже, збереження високих плюрипотентних властивостей гібридними клітинами свідчить про те, що "плюрипотентні" конфігурація гомологів ЕСК досить стійка в гібридному геномі, незважаючи на вплив трансдействующіх факторів, що виходять від соматичного партнера. Описані вище ознаки репрограммірованія гомологічниххромосом диференційованого генома при розвитку химер не виключають того, що на перших етапах утворення і культивування цітогібрідов in vitro вони зберігають свій статус, набутий в ході диференціювання in vivo. Згідно з нещодавно отриманими даними, при перенесенні ембріональних гібридних клітин в неселективний середу в них спостерігається інтенсивна елімінація хромосом тільки соматичного партнера, тобто, геном гібридних клітин легко дискримінує гомологи після культивування in vitro протягом 10-15 пасажів. Таким чином, ембріональні гібридні клітини представляють перспективну експериментальну модель для вивчення не тільки такого фундаментального властивості ембріонального генома, як плюріпотентность, але і її альтернативи - ембріональної диференціювання.

Терапевтична ефективність трансплантації ембріональних стовбурових клітин

Перед аналізом терапевтичної ефективності трансплантації ЕСК і їх похідних резюмуємо наведений вище матеріал. Можливості ЕСК в плані повної реалізації ембріогенезу in vitro недостатні, оскільки дефекти розвитку в цьому випадку обумовлені відсутністю мезенхімальних стовбурових клітин, які в організмі виникають автономно і незалежно від ЕСК. Генетичні потенції ЕСК менше генетичного потенціалу зиготи, тому безпосередньо для клонування ембріонів ЕСК не використовуються. Унікальний біологічний потенціал ЕСК як єдиних клітин, в яких програми розвитку розгорнуті в повному обсязі послідовної реалізації, знаходить застосування в дослідженнях з вивчення функції генів. За допомогою ЕСК проводиться розшифровка перших комбінацій сигналів, що активують експресію ранніх і пізніх генів, що кодують розвиток трьох зародкових листків. Збереження плюріпотентності генома ЕСК in vitro робить їх унікальним інструментом для репаративної регенерації, здатним в автоматичному режимі заповнювати клітинні втрати при пошкодженні органів і тканин. В ідеальному гіпотетичному варіанті можна допустити, що "... При трансплантації донорських ЕСК в організм реципієнта переносяться компактно упаковані програми, які при сприятливих умовах реалізуються в будівництво нової ткані'7, здатної" ... Ефективно інтегруватися в організм реципієнта як на морфологічному, так і функціональному рівні ".

Природно, що слідом за розробкою прийомів монодіфференціровкі ЕСК почалося вивчення in vivo функціональної активності клітин, отриманих in vitro з одного спеціалізованого клону. Проліферуючий клон ЕСК генерує популяції мігруючих прогеніторних клітин, дійсно здатних активно вбудовуватися в зони пошкодження тканин реципієнта, що і використовується в регенеративно-пластичної медицині. Встановлено, що трансплантація ДОФА-нейронів в substantia nigra зменшує клінічні прояви при експериментальному гемипаркинсонизма. Регіональні пересадки донорських нейтральні стовбурових клітин знижують ступінь рухових порушень, викликаних травмою або контузією спинного і головного мозку. Отримано і перші позитивні результати трансплантації стовбурових клітин при демієлінізуючих захворюваннях. Здавалося б, що регенеративно-пластичні потенції ЕСК відкривають необмежені можливості для використання клітинної трансплантації в практичній медицині. Однак при пересадці в ектопічні зони ЕСК неминуче трансформуються в пухлини. При підшкірному введенні ЕСК у імунодефіцитних мишей утворюються тератоми. При пересадці суспензії ЕСК під капсулу насінники у сінгенних мишей також відбувається формування тератом, що складаються з різних тканин, клітини яких є похідними всіх трьох зародкових листків. У таких тератомах вкрай рідко здійснюються процеси скороченої органогенезу.

В цілому ряді робіт наводяться відомості про позитивні результати пересадки ранніх дериватів ЕСК тваринам з екс-періментальной патологією. Клітинна Нейротрансплантація з використанням похідних ЕСК отримує подальший розвиток в експерименті і перших клінічних випробуваннях по корекції функціональних порушень при мозкової і спінальної травми, лікування сирингомиелии і розсіяного склерозу (Рєпін, 2001). З появою техніки нейроногенеза з ЕСК in vitro замість використання тканини ембріонального мозку розробляються методи трансплантації похідних нейросфер, отриманих з культур ембріональної нервової тканини. Такі Трансплантаційні суспензії значно більш гомогенні і містять коммітірованние попередники нейронів і нейроглії.

При регулярному додаванні до культурального середовища ретиноєвої кислоти в дозі 10 мкг / мл протягом 6 тижнів в лінії ембріо- (тератому) -карціноми людини NTERA-2 утворюється більше 80% постмітотіческіх нейронів. Повна гомогенність нейрональної популяції досягається за допомогою проточної сортування мічених імунофенотипових маркерами зрілих нейронів, що дозволяє позбутися від залишків тератокарціномних і незрілих клітин. Після трансплантації в різні регіони мозку експериментальних тварин такі нейрони не тільки виживають, але і вбудовуються в регіонарні нейронні мережі. У тварин з експериментальними моделями локальних дефектів ЦНС Нейротрансплантація зменшує клінічні прояви такої патології людини, як наслідки черепно-мозкової травми, інсульту, демієлінізуючих захворювань, спадкових дефектів розвитку мозочка, хвороб відкладення ліпідів і полісахаридів.

Для оптимізації процесів регенерації при дегенеративних захворюваннях ЦНС розробляються технології одержання з ЕСК міелінпродуцірующіх олигодендроцитов. Перший етап традиційно включає проліферацію ЕСК з розмноженням необхідного для трансплантації кількості клітин. На другому етапі здійснюється спрямована диференціювання клітин в популяцію міелінпродуцірующіх попередників олигодендроцитов, що контролюється селективними маркерними антигенами.

Певні перспективи відкриваються для використання похідних ЕСК з метою розробки методів корекції імунодефіцитів, викликаних генетичними дефектами дозрівання тимуса. У дослідженнях на нокаутних (rag 1) мишах з індукованим генним дефектом - порушенням механізму рекомбінації V (D) J локусів TCR генів, що призводить до втрати функції Т-лімфоцитів, трансплантація ранніх похідних ЕСК в тимус тварин відновлює дозрівання нормальних популяцій імунних клонів, відповідальних за клітинний імунітет. Проводяться клінічні випробування трансплантації преформованих in vitro ЕСК для лікування фатальних спадкових анемій у дітей.

Заперечення проти швидкого впровадження трансплантації стовбурових клітин в клініку обгрунтовуються обмеженим числом стабільних ліній ембріональних стовбурових клітин людини і необхідністю їх стандартизації. Для підвищення чистоти стандартизованих ліній ЕСК, а також стовбурових клітин дорослої людини пропонується використовувати метод відбору ліній на підставі молекулярно-генетичного аналізу коротких тандемних повторів ДНК. Необхідною є також і перевірка ліній ЕСК на наявність дрібних хромосомних перебудов і генетичних мутацій, потенційна можливість виникнення яких в умовах культивування клітин досить велика. Було висунуто тезу про обов'язкове тестування властивостей всіх типів ЕСК і регіонарних поліпотентних стовбурових клітин, так як їх розмноження in vitro може привести до виникнення нових характеристик, що не властивих стовбуровим клітинам ембріона або дефінітивних тканин. Зокрема, допускається, що тривале культивування в середовищах з цитокінами наближає лінії ЕСК до пухлинних клітин, оскільки в них відбуваються схожі зміни шляхів регуляції клітинних циклів з придбанням здатності до здійснення необмеженого числа клітинних поділів. Деякі автори на підставі потенційної можливості розвитку пухлин вважають трансплантацію людині ранніх похідних стовбурових ембріональних клітин безглуздям. На їхню думку, набагато безпечніше використовувати коммітірованних нащадків ЕСК, тобто, лінії родоначальників диференційованих клітин. Однак в даний час ще не розроблена надійна техніка отримання стабільних ліній клітин людини, що диференціюються в потрібному напрямку.

Таким чином, в літературі з'являється все більше даних про позитивний терапевтичному ефекті трансплантації похідних ембріональних стовбурових клітин людини. Однак багато хто з таких робіт піддаються перегляду і критики. Деякі дослідники вважають, що результати ранніх клінічних випробувань мають характер попередніх і свідчать лише про те, що стовбурові клітини здатні надавати сприятливий вплив на клінічний перебіг того чи іншого захворювання. Тому необхідно отримати дані про віддалені результати клітинної трансплантації. Як аргумент наводяться етапи розвитку клінічної нейротрансплантологіі. Дійсно, в літературі спочатку переважали публікації про високу ефективність пересадки фрагментів мозку ембріонів при хворобі Паркінсона, але потім почали з'являтися повідомлення, що заперечують лікувальну ефективність ембріональної або фетальної нервової тканини, пересадженою в мозок хворих.

Проведено перші клінічні випробування з оцінкою безпеки трансплантації нейробластов - похідних ЕСК тератокарціноми NTERA-2, незрілі клітини якої піддавалися проліферації в культурі до накопичення 100-мільйонної клітинної маси. Частина отриманих таким чином клітин використовувалася для характеристики фенотипу і визначення клітинних домішок, а також для тестування можливої контамінації вірусами і бактеріями. З культуральної середовища видаляли LIF і фідерний шар стромальних фетальних клітин і створювали умови для спрямованої диференціювання ЕСК в нейробласти за допомогою комбінації цитокінів і факторів росту. Потім нейробласти очищали від незрілих клітин тератокарціноми на проточному клітинному сортер. Після вторинного очищення і характеристики фенотипу трансплантуються клітин суспензію нейробластов (10-12 млн) за допомогою спеціальної мікроканюлі і шприца під контролем стереотаксіса і комп'ютерної томографії вводили в базальное ядро мозку пацієнтів (на сьомий місяць після геморагічного інсульту). Посттрансплантаційного одногодовой скринінг наслідків трансплантації нейронів в зону інсульту не виявив побічних і небажаних ефектів. У половини пацієнтів відбувалося поліпшення рухової функції в період від 6 до 12 місяців після пересадки. Позитивні клінічні зрушення супроводжувалися підвищенням кровопостачання зони інсульту після трансплантації клітин: середній приріст поглинання флуоресцентно-міченої 2-дезоксиглюкозу, за даними позитронної емісійної томографії, досягав 18%, а в окремих пацієнтів - 35%.

Однак Національний інститут здоров'я США провів незалежне дослідження клінічної ефективності нейротрансплантації у хворих паркінсонізмом. Пацієнтам першої групи пересаджували ділянки ембріональної нервової тканини, що виробляють дофамін, тоді як другий групі хворих робили неправдиву операцію. Результати свідчать про нульову клінічної ефективності такої нейротрансплантації, незважаючи на те що дофамінпродуцірующіе ембріональні нейрони виживали в мозку реципієнтів. Більш того, через 2 роки після пересадки ембріональної нервової тканини у 15% пацієнтів розвинулася персистентная дискінезія, відсутня у хворих групи плацебо (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Спостереження за подальшим розвитком захворювання у цих пацієнтів тривають.

Деякі автори пов'язують суперечливість літературних даних по оцінці клінічної ефективності нейротрансплантації з різним підходом до підбору груп хворих, неадекватним вибором методів об'єктивної оцінки їх стану, а, головне, різними термінами розвитку ембріональної нервової тканини і різними ділянками мозку, з яких цю тканину отримували, різними розмірами трансплантата і методичними особливостями операційного втручання.

Треба зауважити, що спроби безпосередній трансплантації плюрипотентних стовбурових ембріональних клітин в область смугастого тіла мозку щурів з експериментальним гемипаркинсонизма супроводжувалися пролиферацией ЕСК і їх диференціюванням в дофамінергічних нейрони. Слід гадати, що новостворені нейрони ефективно убудовувалися в нейрональні мережі, оскільки після трансплантації ЕСК спостерігалася корекція аномалій поведінки і рухової асиметрії в апоморфіновом тесті. У той же час частина тварин загинула внаслідок трансформації пересаджених ЕСК в пухлини головного мозку.

Експерти Національної та Медичної академій США, фахівці Національного інституту здоров'я США вважають, що клінічний потенціал ЕСК заслуговує самої серйозної уваги, однак наполягають на необхідності детального вивчення їх властивостей, ймовірності ускладнень і віддалених наслідків в дослідах на адекватних біологічних моделях захворювань людини (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press .; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

З цієї точки зору важливо, що порівняльний гістологічний аналіз експериментальних тератом, отриманих при трансплантації в семенник суспензії ЕСК, з тератомами, сформованими внаслідок пересадки раннього зародка, в складі якого також присутні ЕСК, показав, що ЕСК незалежно від джерела їх походження або взаємодії з тими чи іншими оточуючими клітинами однаковим чином реалізують свої туморогенну потенції. Доведено, що такі тератоми мають клональное походження, так як з однієї ЕСК можуть виникати пухлини, що складаються з похідних всіх трьох зародкових листків (.Рега, 2001). Примітно, що при трансплантації імунодефіцитних мишам клонованих ЕСК з нормальним каріотипом також формувалися тератоми, що складаються з різних типів диференційованих соматичних клітин. Ці експериментальні дані - бездоганне доказ клонального походження тератом. З точки зору біології розвитку, вони свідчать про те, що ні множинні коммітірованние клітини-попередники, а одинична плюрипотентні стовбурова клітина виступає джерелом диференційованих похідних всіх трьох зародкових листків, що становлять тератому. Однак на шляху практичної клітинної трансплантації результати цих досліджень є якщо не забороняє, то який попереджає знаком потенційну небезпеку, оскільки інокуляція ЕСК або первинних статевих клітин в різні тканини дорослих імунодефіцитних мишей неминуче викликає розвиток пухлин з пересаджених стовбурових клітин. Неопластичне переродження ектопічні пересаджених ЕСК супроводжується виникненням сателітних популяцій диференційованих клітин - за рахунок часткової дифферен- цировки ЕСК і прогеніторних клонів в спеціалізовані лінії. Цікаво, що при пересадці ЕСК в скелетні м'язи поруч з тератокарціномнимі клітинами найчастіше утворюються нейрони. Однак введення ЕСК в дробящихся яйцеклітину або бластоцисту супроводжується повною інтеграцією клітин в зародок без формування неопластических елементів. При цьому ЕСК вбудовуються практично в усі органи і тканини ембріона, включаючи статевий зачаток. Такі аллофенние тварини вперше були отримані при введенні клітин тератокарціноми 129 в ранні зародки на стадіях 8-100 клітин. У аллофенних мишей популяції гетерогеномних клітин-похідних ЕСК донора впроваджуються в тканини кісткового мозку, кишечника, шкіри, печінки і статевих органів, що дозволяє створювати в експерименті навіть міжвидові клітинні химери. Чим менше терміни розвитку раннього зародка, тим вище відсоток клітинної хімерізаціі, причому найвища ступінь хімерізаціі спостерігається в кровотворної системи, шкірі, нервовій системі, печінки і тонкій кишці аллофенного зародка. У дорослому організмі хімерізаціі піддаються тканини, захищені від впливу імунної системи реципієнта гистогематическими бар'єрами: пересадка первинних статевих клітин в паренхіму яєчка супроводжується встраиванием донорських стовбурових клітин в герменатівний шар тканини реципієнта. Проте, при трансплантації ЕСК в бластоцисту утворення химерних зачатків статевих органів з генерацією донорських первинних статевих клітин не відбувається. Плюріпотентность ЕСК при створенні спеціальних умов може бути використана і для клонування: трансплантація ЕСК мишей в 8-16-клітинний мишачий зародок, клітинні мітози в якому блоковані цітокалазіном, сприяє реалізації нормального ембріогенезу з розвитком зародка з донорських ЕСК.

Отже, альтернативою трансплантації алогенних ЕСК є терапевтичне клонування, засноване на пересадці ядер соматичних клітин в енуклеірованную яйцеклітину для створення бластоцисти, з внутрішньої клітинної маси якої потім виділяються лінії генетично ідентичних донору соматичного ядра ЕСК. Технічно ця ідея цілком здійсненна, оскільки можливість створення ліній ЕСК з бластоцист, отриманих після трансплантації соматичних ядер венуклеірованние яйцеклітини, неодноразово доведена в експериментах на лабораторних тваринах (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Зокрема у мишей, гомозиготних по мутації гена rag2, фібробласти, отримані при культивуванні клітин субепідермальной тканини, використовувалися в якості донорів ядер, які трансплантували венуклеірованние ооцити. Після активації ооцитів "зиготу" культивували до утворення бластоцисти, з внутрішньої клітинної маси якої ізолювали ЕСК і переводили їх в лінію нуллізіготних по мутантного гену клітин (rag2 ~ / ~). Методом гомологичной рекомбінації в таких ЕСК коригували мутацію одного аллельного гена. У першій серії експериментів з ЕСК з рекомбінантним відновленим геном отримували ембріоідние бичка, трансфіковані їх клітини рекомбінантним ретровирусом (HoxB4i / GFP) і після розмноження вводили в вену мишей rag2 ~ / ~. У другій серії тетраплоїдні бластомери агрегованих з генетично модифікованими ЕСК і трансплантували їх самкам-реципієнтам. Народились імунокомпетентні миші служили донорами кісткового мозку для трансплантації мутантом мишам rag2 ~ / ~. В обох серіях результат був позитивним: через 3-4 тижні у всіх мишей були виявлені зрілі нормальні мієлоїдний і лімфоїдні клітини, здатні продукувати імуноглобуліни. Таким чином, пересадку в ооцит ядер соматичних клітин можна використовувати не тільки для отримання ліній ЕСК, а й для цітогенотерапіі - корекції спадкових аномалій, застосовуючи ЕСК в якості вектора для транспорту корригирующей генетичної інформації. Але і в цьому напрямку клітинної трансплантації, крім біоетичних проблем, є свої обмеження. Не ясно, наскільки безпечною виявиться трансплантація терапевтично клонованих клітин з генотипом, ідентичним генотипу конкретного хворого, оскільки такі клітини можуть привносити мутації, що створюють схильність до інших захворювань. Нормальні яйцеклітини людини залишаються важкодоступним об'єктом, тоді як навіть при пересадці соматичних ядер венуклеірованние яйцеклітини тварин тільки 15-25% сконструйованих "зигот" розвивається до стадії бластоцисти. При цьому не визначено, яку кількість бластоцист потрібно для отримання однієї лінії плюрипотентних клонованих ЕСК. Слід зазначити і високий рівень фінансових витрат, пов'язаних зі складністю методології терапевтичного клонування.

На закінчення відзначимо, що в ЕСК плюріпотентность генома з гіпометілірованной ДНК поєднується з високою активністю теломерази і короткою З ^ фазою клітинного циклу, що забезпечує їх інтенсивне і потенційно нескінченне розмноження, в процесі якого ЕСК зберігають диплоїдний набір хромосом і "ювенільний" набір фенотипічних характеристик. Клональний зростання ЕСК в культурі не перешкоджає їх диференціювання в будь-яку спеціалізовану клітинну лінію організму при зупинці проліферації і додаванні відповідних регуляторних сигналів. Рестрикционная диференціювання ЕСК в лінії соматичних клітин in vitro реалізується без участі мезенхіми, в обхід Нохтеяов, поза органогенезу і без формування зародка. Ектопічної введення ЕСК in vivo неминуче призводить до утворення тератокарціном. Трансплантація ЕСК в бластоцисту або ранній зародок супроводжується їх інтеграцією з тканинами ембріона і стабільної хімерізаціей його органів.

Регенеративно-пластичні технології, засновані на клітинної трансплантації, є точкою перетину інтересів представників клітинної біології, біології розвитку, експериментальної генетики, імунології, неврології, кардіології, гематології та багатьох інших галузей експериментальної та практичної медицини. Найбільш важливі результати експериментальних досліджень, що доводять можливість перепрограмування стовбурових клітин з спрямованою зміною їх властивостей, що відкриває перспективи для управління процесами цітодіфференціровкі за допомогою факторів росту - для регенерації міокарда, відновлення поразок ЦНС і нормалізації функції острівковогоапарату підшлункової залози. Однак для широкого впровадження трансплантації похідних ЕСК в практичну медицину необхідно більш детально дослідити властивості стовбурових клітин людини і продовжити досліди з ЕСК на експериментальних моделях захворювань.

Біоетичні питання і проблему відторгнення алогенного клітинного трансплантата могла б вирішити виявлена пластичність генома регіонарних стовбурових клітин дорослого організму. Однак початкові відомості про те, що при пересадці в печінку ізольованих і ретельно охарактеризованих гемопоетичних аутогенних клітин, з яких відбуваються нові гепатоцити, що вбудовуються в печінкові часточки, зараз піддаються перегляду і критики. Проте, опубліковані дані про те, що трансплантація нейтральні стовбурових клітин в тимус викликає утворення нових донорських паростків Т- і В-лімфоцитів, а пересадка стовбурових нервових клітин головного мозку в кістковий мозок призводить до формування гемопоетичних паростків з тривалим донорським миело- і еритропоезу . Отже, в органах дорослого організму можуть зберігатися плюрипотентні стовбурові клітини, здатні до перепрограмування геному до потенціалу ЕСК.

Джерелом отримання ЕСК для застосування в медичних цілях залишається ембріон людини, що зумовлює неминучість нового перетину моральних, етичних, моральних, юридичних і релігійних проблем в точці зародження людського життя. Відкриття ЕСК дало потужний поштовх до відновлення жорстких дискусій про те, де проходить грань між живими клітинами і речовиною, істотою і особистістю. У той же час універсальних норм, правил і законів щодо застосування ЕСК в медицині, незважаючи на неодноразові спроби їх створення і прийняття, не існує. Кожна держава в рамках свого законодавства вирішує цю проблему самостійно. Зі свого боку, медики усього світу продовжують спроби вивести регенеративно-пластичну медицину за рамки таких дискусій, перш за все за рахунок застосування не ембріональних стовбурових клітин, а стовбурових клітинних резервів дорослого організму.

Трохи з історії виділення ембріональних стовбурових клітин

Терато- (ембріо) -карціномние клітини виділялися з спонтанних тестікулярних тератом мишей лінії 129 / ter-Sv, спонтанних оваріальних тератом мишей ліній Lt / Sv, а також з тератом, джерелом яких були ектопічно трансплантовані клітини або тканини ембріонів. Серед отриманих таким чином стабільних мишачих ліній терато- (ембріо) -карціномних клітин деякі були плюрипотентними, інші піддавалися диференціювання тільки в клітини одного певного типу, а деякі взагалі були нездатні до цітодіфференціровке.

Свого часу в центрі уваги перебували дослідження, результати яких свідчили про можливість повернення терато- (ембріо) -карціномних клітин до нормального фенотипу після їх введення в тканини ембріона, а також роботи зі створення in vitro генетично модифікованих терато- (ембріо) -карціномних клітин, за допомогою яких отримували мишей-мутантів для біологічного моделювання спадкової патології людини.

Для виділення ліній терато- (ембріо) -карціномних клітин використовувалося кондиціоноване суспензійне культивування. У культурі терато- (ембріо) -карціномние клітини, як і ЕСК, ростуть з утворенням ембріоідних тілець і вимагають для перекладу в лінію обов'язкової дисоціації, зберігаючи плюріпотентность на фидерном шарі з ембріональних фібробластів або при суспензійному культивуванні в кондиционированной середовищі. Клітини плюрипотентних терато- (ембріо) - карціномних ліній великі, кулясті, характеризуються високою активністю лужної фосфатази, формують агрегати і здатні до різноспрямованою диференціювання. При введенні в бластоцисту вони агрегує з морулой, що призводить до утворення химерних зародків, в складі різних органів і тканин яких виявляються похідні терато- (ембріо) -карціномних клітин. Однак переважна частина таких химерних зародків гине внутрішньоутробно, а в органах вижили новонароджених химер чужорідні клітини виявляються рідко і з невисокою щільністю. У той же час частота виникнення пухлин (фібросаркома, рабдоміосаркома, інші види злоякісних опухли і аденома підшлункової залози) різко зростає, причому пухлинне переродження часто відбувається ще в період внутрішньоутробного розвитку химерних зародків.

Велика частина терато- (ембріо) -карціномних клітин в мікро-оточенні нормальних ембріональних клітин майже закономірно набуває злоякісні неопластические характеристики. Вважається, що необоротна малигнизация обумовлена активацією протоонкогенов в процесі структурних перебудов. Одним із винятків є клітини ембріокарціномной лінії SST3, отриманої з тератом мишачих сім'яників (лінія 129 / Sv-ter), які проявляють високу здатність інтегруватися в тканини і органи зародка без подальшого утворення пухлин у химерних мишей. Похідні терато- (ембріо) -карціномних клітинних ліній у мишей-химер практично не беруть участі в утворенні первинних гоноцитів. Очевидно, це пов'язано з високою частотою хромосомних аберацій, характерних для більшості терато- (ембріо) -карціномних ліній, в клітинах яких спостерігається як анеуплоідія, так і хромосомні аномалії.

У лабораторних умовах було отримано кілька стабільних ліній терато- (ембріо) -карціномних клітин людини, що характеризуються плюрипотентні, високою проліферативною активністю і здатністю до диференціювання при зростанні в культурах. Зокрема, лінія терато- (ембріо) -карці- автономних клітин людини NTERA-2 використовувалася для вивчення механізмів нейральной цітодіфференціровкі. Після трансплантації клітин даної лінії в субвентрікулярной область переднього мозку новонароджених щурів спостерігалася їх міграція і нейроногенез. Робилися навіть спроби пересадки нейронів, отриманих при культивуванні клітин терато- (ембріо) -карціномной лінії NTERA-2, хворим з інсультами, що, на думку авторів, призводило до покращення клінічного перебігу захворювання. При цьому випадків малігнізації трансплантованих клітин терато- (ембріо) -карціномной лінії NTERA-2 у пацієнтів з інсультом не відзначалося.

Перші лінії недиференційованих плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин мишей на початку 80-х років минулого століття отримали Еванс і Мартін, виділивши їх з внутрішньої клітинної маси бластоцисти - ембріобласта. Виділені ЕСК протягом тривалого часу зберігали плюріпотентность і здатність диференціюватися в різні типи клітин під впливом факторів спеціальної середовища культивування.

Сам термін "ембріональна плюрипотентні стовбурова клітина" належить Лерою Стивенсу, який при дослідженні впливу тютюнової смоли на частоту розвитку пухлин звернув увагу на спонтанне виникнення тестикулярной тератокарціноми у лінійних (129 / v) мишей контрольної групи. Клітини тератокарціном сім'яників відрізнялися високою швидкістю проліферації, а в присутності рідини з черевної порожнини виходили в спонтанну диференціювання з формуванням нейронів, кератиноцитів, хондроцитов, кардіоміоцитів, а також волосся і фрагментів кісткової тканини, але без будь-яких ознак впорядкованої цитоархітектоніки відповідної тканини. Під час висадки в культуру клітини тератокарціном росли неприкріпленою до підкладки плюрипотентними клонами і формували ембріоідние бичка, після чого припиняли ділення і піддавалися спонтанної безладної диференціювання в нейрони, глію, м'язові клітини і кардіоміоцити. Стівенс встановив, що тератокарциномах мишей 129 / v містить менше 1% клітин, здатних диференціюватися в різноманітні спеціалізовані соматичні лінії, а сама диференціація залежить від чинників, які на них впливають (склад рідини черевної порожнини, продукти доданих в культуру зрілих клітин або тканин). Припущення Лероя Стівенсона про наявність серед клітин тератокарціноми ембріональних прогеніторних клітин статевого зачатка підтвердилося: суспензія клітин ембріобласта доімплантаційних зародків в тканинах дорослих мишей формувала тератокарціноми, а виділені з них чисті клітинні лінії після інтраперітонеального введення тваринам-реципієнтам диференціювалися в нейрони, кардіоміоцити і інші соматичні клітини похідні всіх трьох зародкових листків. В експериментах in vivo трансплантація ЕСК (отриманих з ембріобласта, але не трофобласта) в зародки миші іншої лінії на стадіях 8-32 бластомер закінчувалася народженням химерних тварин (без виникнення пухлин), в органах яких виявлялися паростки донорської тканини. Хімерізм спостерігався навіть в лінії статевих клітин.

Первинні прогеніторні статеві клітини, виділені з статевого зачатка мишачого ембріона, по морфології, імунологічному фенотипу і функціональних характеристик відповідали ЕСК, отриманим Стивенсоном з тератокарціноми і ембріобласта. У химер, народжених після введення ЕСК в бластоцисту, аллофенний морфогенез органів характеризувався мозаїчним чергуванням донорських та реципієнтних структурно-функціональних одиниць печінки, легенів і нирок. У ряді випадків спостерігалося утворення крипт кишечника або часточки печінки, що складаються одночасно з клітин реципієнта і донора. Однак завжди реалізація морфогенезу відбувалася по генетичній програмі виду, до якого належав реципієнт, а хімерізм обмежувався виключно клітинним рівнем.

Потім було встановлено, що проліферація ЕСК без цітодіфференціровкі на фидерном шарі клітин-похідних мезенхіми (фетальні фібробласти) відбувається при обов'язковій присутності LIF в селективних поживних середовищах, які вибірково забезпечують виживання тільки стовбурових і прогеніторних клітин, тоді як переважна більшість спеціалізованих клітинних елементів гине. За допомогою таких методик в 1998 році Джеймсом Томсоном були виділені п'ять імморталізованних ліній ембріональних стовбурових клітин з внутрішньої клітинної маси бластоцисти людини. У тому ж році Джон Герхарт розробив метод виділення безсмертних ліній ЕСК з статевого горбка чотирьох-п'ятитижневих ембріонів людини. Завдяки своїм унікальним властивостям, всього через два роки ембріональні стовбурові клітини і стовбурові клітини дефінітивних тканин вже почали використовуватися в практиці регенеративної медицини та генної терапії.