Мезенхімальні стовбурові клітини

Серед регіонарних стовбурових клітин особливе місце займають мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), похідні яких складають стромальних матрицю всіх органів і тканин організму людини. Пріоритет в дослідженнях МСК належить представникам російської біологічної науки.

В середині минулого століття в лабораторії А. Фріденштейн вперше була виділена однорідна культура мультіпотентних стромальних стовбурових клітин кісткового мозку. Мезенхімальні стовбурові клітини, прикріплені до підкладки, тривалий час зберігали високу інтенсивність проліферації, а в культурах при низькій щільності посіву після фіксації на підкладці утворювали клони фібробластоподібних клітин, що не володіють фагоцитарної Активністю. Зупинка проліферації МСК завершувалася їх спонтанної дифференцировкой in vitro в клітини кісткової, жирової, хрящової, м'язової або сполучної тканини. Подальші дослідження дозволили встановити остеогенних потенціал фібробластоподібних клітин строми кісткового мозку різних видів ссавців, а також їх колонієутворюючих активність. В експериментах in vivo було показано, що як гетеро-, так і ортотопіческая трансплантація колонієутворюючих фібробластоподібних клітин завершується формуванням кісткової, хрящової, фіброзної і жирової тканини. Оскільки стромальні стовбурові клітини кісткового мозку відрізняються високою здатністю до самовідновлення і багатоплановістю диференціювання в межах однієї клітинної лінії, вони отримали назву мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників.

Треба зауважити, що за 45 років фундаментальних досліджень мезенхімальних стовбурових клітин створені реальні умови для застосування їх похідних в клінічній практиці.

Сьогодні вже немає ніяких сумнівів, що всі тканини організму людини утворюються зі стовбурових клітин різних клітинних ліній в результаті процесів проліферації, міграції, диференціювання і дозрівання. Однак ще зовсім недавно вважалося, що стовбурові клітини у дорослому організмі тканеспеціфічни, тобто, здатні виробляти лінії спеціалізованих клітин тільки тих тканин, в яких вони знаходяться. Це концептуальне положення було спростовано фактами трансформації гемопоетичних стовбурових клітин не тільки в клітинні елементи периферичної крові, але і в овальні клітини печінки. Крім того, і нейтральні стовбурові клітини виявилися здатними давати початок як нейронам і гліальні елементів, так і раннім коммітірованних лініях клітин-попередників гемопоезу. У свою чергу, мезенхімальні стовбурові клітини, зазвичай продукують клітинні елементи кісткової, хрящової і жирової тканини, здатні трансформуватися в нейтральні стовбурові клітини. Передбачається, що в процесі росту, фізіологічної та репаративної регенерації тканин некоммітірованние клітини-попередники генеруються з тканенеспеціфічних стовбурових резервів. Наприклад, репарація м'язової тканини може реалізовуватися за рахунок мезенхімальних стовбурових клітин, що мігрують з кісткового мозку в кісткову мускулатуру.

Хоча таку перехресну взаємозамінність стовбурових клітин визнають далеко не всі дослідники, можливість клінічного використання мезенхімальних стовбурових клітин в якості джерела для клітинної трансплантації і клітинного вектора генетичної інформації вже ніким не заперечується, як і мультіпотентность стромальних стовбурових клітин кісткового мозку, які можна відносно легко ізолювати і розмножити в культурі in vitro. У той же час в науковій літературі продовжують з'являтися повідомлення про потенційну плюріпотентності стовбурових клітин строми кісткового мозку. Як доказ наводяться протоколи досліджень, в яких під впливом специфічних індукторів трансдіфференціровка МСК перетворюються в нервові клітини, кардіоміоцити і гепатоцити. Однак у деяких вчених можливість повторної активації та експресії генів періоду раннього ембріогенезу викликає великі сумніви. При цьому всі розуміють, що якщо будуть знайдені умови для розширення мультипотентні мезенхімальних стовбурових клітин до плюріпотентності ЕСК, в регенеративно-пластичної медицині автоматично вирішуються багато проблем етичного, морального, релігійного та юридичного характеру. Крім того, оскільки в цьому випадку джерелом регенеративного стволового потенціалу стають аутологічні стромальні клітини хворого, вирішується і проблема імунного відторгнення клітинного трансплантата. Наскільки реальні ці перспективи, покаже найближче майбутнє.

[1], [2]

Використання мезенхімальних стовбурових клітин в медицині

У клініці використання похідних мезенхімальних стовбурових клітин пов'язано, перш за все, з відновленням тканинних дефектів, що виникають при великих і глибоких термічних ураженнях шкіри. На доклінічному етапі була проведена експериментальна оцінка доцільності застосування алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин для лікування глибоких опіків. Показано, що фібробластоподібних мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку утворюють в культурі моношар, що дає можливість трансплантувати їх з метою оптимізації процесів регенерації глибоких опікових ран. Автори відзначають, що подібним властивістю володіють ембріональні фібробласти, проте клінічне застосування останніх обмежена існуючими етичними і юридичними проблемами. Глибокий термічний опік з пошкод-дження всіх шарів шкіри моделювали на щурах лінії Вістар. Площа опіку становила 18-20% від загальної поверхні шкіри. В першу експериментальну групу увійшли щури з глибоким термічним опіком і трансплантацією алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин. Другу групу склали тварини з глибоким термічним опіком і транс-плантацією алогенних ембріональних фібробластів. Третя група була представлена контрольними щурами з глибоким термічним опіком, яким клітинну терапію не проводили. Суспензію фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин і ембріональних фібробластів наносили на поверхню опікової рани за допомогою піпетки в кількості 2 х 10 ⁴ клітин на 2-у добу після моделювання опіку і висічення утворився некротичного струпа. Після трансплантації клітин опікову поверхню покривали марлевою серветкою, змоченою фізіологічним розчином натрію хлориду з гентаміцином. Забір клітин кісткового мозку для отримання МСК з подальшою їх індукцією в лінію фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин виробляли у дорослих щурів лінії Вістар з стегнових кісток. Ембріональні фібробласти отримували з легких 14-17-денних ембріонів. Ембріональні фібробласти і клітини кісткового мозку для отримання МСК попередньо культивували в чашках Петрі при температурі 37 ° С в 02-іікубаторе, в атмосфері з 5% СО2 при 95% вологості. Ембріональні фібробласти культивували протягом 4-6 діб, тоді як для утворення монослоя МСК потрібно від 14 до 17 діб. Надалі МСК зберігали методом кріоконсервації як вихідний матеріал для фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин, які отримували шляхом розморожування і культивування МСК протягом 4 діб. Кількість які виникають фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин більш ніж в 3 рази перевищувало кількість ембріональних фібробластів, що виникають протягом того ж періоду культивування. Для ідентифікації трансцлантірованних клітин в опікових ранах на етапі культивування їх геном мітили, використовуючи вірусний шатл-вектор на основі рекомбінантного аденовірусу V типу, що несе ген 1ас-2, який кодує ß-галактозидазу E. Coli. Живі клітини в різні терміни після трансплантації виявляли імуногістохімічно в кріосрезах з додаванням субстрату X-Gal, що дає характерне синьо-зелене забарвлення. В результаті динамічної візуальної, планіметричний і гістологічної оцінки стану опікової рани було встановлено, що вже на 3-ю добу після трансплантації клітин в виділених групах з'являються суттєві відмінності в перебігу раневого процесу. Особливо виразною ця різниця ставала на 7-у добу після трансплантації клітин. У тварин першої групи, яким були трансплантовані фібробластоподібних мезенхімальні стовбурові клітини, рана набувала рівномірно рожеву інтенсивне забарвлення, грануляційна тканина розросталася по всій її площі до рівня епідермісу, а опікова поверхня значно скорочувалася в розмірах. Кілька стоншується утворилася на поверхні рани коллагеновая плівка, але вона продовжувала покривати всю опікову площа. У тварин другої групи, яким були трансплантовані ембріональні фібробласти, грануляційна тканина піднімала до рівня епідермісу країв рани, але лише місцями, в той же час плазморея з рани була більш інтенсивною, ніж в 1-й групі, а спочатку утворилася коллагеновая плівка практично зникала. У тварин, що не отримували клітинної терапії, на 7-му добу опікова рана була бліду, пориту, некротизовану тканину, покриту фібрином. Плазморея відзначалася по всій опікової поверхні. Гістологічно у тварин 1-ї та 2-ї груп відзначалося зниження клітинної інфільтрації і розвиток судинної мережі, причому ці ознаки початку регенераторного процесу були більш виражені у щурів 1-ї групи. У контрольній групі спостерігалися ознаки клітинної інфільтрації рани, гістологічний малюнок новоутворених судин був відсутній. На 15-30-у добу спостереження у тварин 1-ї групи площа опікової поверхні була значно менше, ніж у щурів інших груп, а гранулююча поверхня була більш розвиненою. У тварин 2-ї групи площа опікової поверхні також скорочувалася в порівнянні з розміром опікових ран у щурів контрольної групи, що відбувалося за рахунок крайової епітелізації. У контрольній групі опікова поверхня місцями залишалася блідою з рідкісними грануляціями, на ній з'являлися судинні зірочки, були острівці фібринозного нальоту, тривала помірна плазморея по всій опікової поверхні, подекуди зберігався важко відокремлюваний струп. В цілому у тварин 3-ї групи також зменшувалися розміри рани, але краї рани залишалися подритимі.

Таким чином, під час порівняльного дослідження швидкості загоєння ран при використанні фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин і ембріональних фібробластів, а також без застосування клітинної терапії відзначено прискорення темпу загоєння опікової поверхні в результаті трансплантації фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин і ембріональних фібробластів. Однак в разі використання алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин швидкість загоєння ран була вище, ніж при трансплантації ембріональних фібробластів. Це виражалося в прискоренні зміни фаз регенераторного процесу - скорочувалися терміни клітинної інфільтрації, підвищувався темп розростання судинної мережі, а також утворення грануляційної тканини.

Результати динамічної планіметрії свідчать про те, що швидкість спонтанного загоєння опікової рани (без застосування клітинної терапії) була найнижчою. На 15-е і 30-е добу після трансплантації алогенних фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин темп загоєння ран був вище, ніж при трансплантації ембріональних фібробластів. Гістохімічний метод виявлення бета-галактозидази показав, що після трансплантації фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин і ембріональних фібробластів протягом усього терміну спостереження на поверхні і в глибині регенерують ран трансплантовані клітини залишаються життєздатними. Автори вважають, що більш висока швидкість регенерації опікових ран при використанні фібробластоподібних мезенхімальних стовбурових клітин обумовлена виділенням цими клітинами в процесі дозрівання біологічно активних ростостімуліруюшіх факторів.

Трансплантація ауто- або алогенних кератиноцитів і алогенних фібробластів з метою лікування опікових ран застосовувалася і в клініці. Треба зауважити, що хірургічне лікування дітей з великими глибокими опіками є складним завданням внаслідок високої травматичності і многократности оперативних втручань, значної крововтрати, різних реакцій на використовувані інфузійні середовища. Основні труднощі у виконанні шкірно-пластичних операцій при великих глибоких опіках, по площі перевищують 40% поверхні тіла, обумовлені тяжкістю стану постраждалих і відсутністю донорських ресурсів шкіри. Застосування сітчастих трансплантатів з великим коефіцієнтом перфорації не вирішує проблеми, оскільки утворюються після перфорації осередку епітелізіруются дуже повільно, а самі шкірні клапті нерідко лизируются або висихають. Такі покриття опікових ран, як ксеношкіри, трупні алотрансплантату, синтетичні плівкові покриття не завжди достатньо ефективні, тому розробляються нові методи закриття опікових поверхонь пластами культивованих кератиноцитів і фібробластів. Зокрема, запропонований метод закриття опікових поверхонь за допомогою культивованих аллофібробластов, надають при пересадці виражений стимулюючий вплив на проліферацію епідермоцітов, що збереглися в рані при прикордонних опіках, а також кератиноцитів в перемичках сітчастих трансплантатів. У роботі Л. Будкевич і співавторів (2000) наведені результати застосування цього методу для лікування опіків у дітей. Під наглядом перебував 31 дитина з термічною травмою у віці від 1 року до 14 років. У трьох дітей загальна площа опікових ран IIIА-В - IV ступеня склала 40%, у 25 - 50-70%, ще у трьох - 71-85% поверхні тіла. Ранню хірургічну некректомія поєднували з трансплантацією культивованих аллофібробластов і аутодермопластікой. На першому етапі лікування проводилося висічення некротичних тканин, на другому - трансплантація культивованих аллофібробластов на плівках-носіях, на третьому (через 48 годин після трансплантації культивованих аллофібробластов) - видалення матриксу та аутодермопластика шкірними клаптями з коефіцієнтом перфорації 1: 4. Трьом пацієнтам, котрі вступили в клініку з важкої опікової хворобою, культивовані аллофібробласти були пересаджені на гранулюючих рани. Трансплантацію культивованих аллофібробластов здійснювали одноразово у 18 дітей, двічі - у 11, тричі - у двох пацієнтів. Площа поверхні рани, що закривається клітинною культурою, склала від 30 до 3500 см2. Ефективність застосування культивованих аллофібробластов оцінювали за загальним відсотком приживлення шкірних клаптів, термінів загоєння опіків і числу смертей тяжкої термічної травми. Приживлення трансплантатів було повним у 86% хворих. Часткове непріжівленіе шкірних клаптів відзначено в 14% випадків. Незважаючи на проведене лікування, шестеро (19,3%) дітей померли. Загальна площа ураження шкіри у них склала від 40 до 70% поверхні тіла. Трансплантація культивованих аллофібробластов не мала відношення до летального результату опікової травми у жодного хворого.

Аналізуючи результати лікування, автори відзначають, що раніше до опіків, несумісних з життям, відносили глибоке термічне ураження шкіри площею 35-40% поверхні тіла (для дітей молодшого віку - до 3 років - критичними є глибокі опіки з площею 30%, для дітей старшого віку - понад 40% поверхні тіла). При виконанні хірургічної некректомії з трансплантацією культивованих аллофібробластов і подальшої аутодермопластікой шкірними клаптями з великим коефіцієнтом перфорації опіки IIIB - IV ступеня залишаються критичними, але в даний час з'являються перспективи в багатьох випадках зберегти життя навіть таким постраждалим. Хірургічна некректомія в поєднанні з трансплантацією культивованих аллофібробластов і аутодермопластікой у дітей з глибокими опіками виявилася особливо ефективною у пацієнтів з поширеними ураженнями шкірного покриву при дефіциті донорських ділянок. Активна хірургічна тактика і пересадка культивованих аллофібробластов сприяють швидкій стабілізації загального стану таких пацієнтів, зменшення числа інфекційних ускладнень опікової хвороби, створення сприятливих умов для приживлення трансплантатів, скорочення термінів відновлення втраченого шкірного покриву і тривалості стаціонарного лікування, зниження частоти летальних випадків у постраждалих з великими опіками. Таким чином, трансплантація культивованих аллофібробластов з подальшою аутодермопластікой шкірними клаптями дозволяє домогтися одужання у дітей з важкими опіками, які раніше вважалися приреченими.

Загальновизнано, що першочерговим завданням лікування опікової хвороби є максимально повне і швидке відновлення пошкодженого шкірного покриву для попередження виникаючих при цьому токсичних впливів, інфекційних ускладнень і зневоднення організму. Результати застосування культивованих клітин в значній мірі залежать від підготовленості до трансплантації самої опікової рани. У випадках трансплантації культивованих кератиноцитів на поверхню рани після хірургічної некректомії приживляється в середньому 55% (за площею) пересаджених клітин, тоді як при гранулюючих ранах частота приживлення знижується до 15%. Тому успішне лікування великих глибоких опіків шкіри вимагає, в першу чергу, активної хірургічної тактики. При наявності опікових ран IIIB-IV ступеня опікову поверхню негайно звільняють від некротизованих тканин з метою зменшення явищ інтоксикації і зниження кількості ускладнень опікової хвороби. Застосування такої тактики є запорукою скорочення часу з моменту отримання опіку до закриття ран і термінів перебування хворих з великими опіками в стаціонарі, а також істотно зменшує кількість летальних випадків.

Перші повідомлення про успішне використання культивованих кератиноцитів з метою покриття опікової поверхні з'явилися на початку вісімдесятих років минулого століття. В подальшому цю маніпуляцію здійснювали за допомогою пластів культивованих кератиноцитів, отриманих найчастіше з аутоклеток, значно рідше - з аллокератіноцітов. Однак технологія аутокератіноцітопластікі не дозволяє створити банк клітин, в той час як терміни, необхідні для виготовлення достатнього за площею трансплантата з кератиноцитів, великі і становлять 3-4 тижні. За цей період різко зростає ризик розвитку інфекційних та інших ускладнень опікової хвороби, що значно подовжує загальний час перебування пацієнтів у стаціонарі. Крім того, аутокератіноціти практично не приживляються при трансплантації на гранулирующие опікові рани, а висока вартість спеціальних ростових середовищ і біологічно активних стимуляторів росту кератиноцитів значно обмежує їх клінічне застосування. Інші біотехнологічні методи, такі як коллагенопластіка, трансплантація кріоконсервованої ксеношкіри, а також використання різних біополімерних покриттів підвищують ефективність лікування великих поверхневих, але не глибоких опіків. Метод покриття поверхні рани за допомогою культивованих фібробластів принципово відрізняється тим, що в якості основного компонента культивованих пласта клітин використовуються не кератиноцити, а фібробласти.

Передумовою для розробки методу послужили дані про те, що перицитам, навколишні дрібні судини, є про- геніторнимі мезенхімальними клітинами, здатними трансформуватися в фібробласти, які продукують багато чинників зростання і забезпечують загоєння рани за рахунок сильного стимулюючого впливу на проліферацію і адгезію кератиноцитів. Використання культивованих фібробластів для закриття ранових поверхонь відразу ж виявило ряд істотних переваг цього методу в порівнянні з застосуванням культивованих кератиноцитів. Зокрема, отримання фібробластів в культурі не вимагає використання спеціальних поживних середовищ і стимуляторів росту, що знижує вартість трансплантата більш ніж в 10 разів відносно вартості отримання кератиноцитів. Фібробласти легко піддаються пасирування, в процесі якого вони частково втрачають поверхневі антигени гістосумісності, що, в свою чергу, відкриває можливість використання для виготовлення трансплантатів алогенних клітин і створення їх банків. Скорочуються терміни отримання трансплантатів, готових до застосування в клініці, з 3 тижнів (для кератиноцитів) до 1-2 днів (для фібробластів). Первинну культуру фібробластів можна отримати методом культивування з клітин фрагментів шкіри, взятих при аутодермопластики, а щільність посіву клітин при отриманні субкультур фібробластів людини становить всього 20 x 10 ³ на 1 см ².

З метою вивчення впливу фібробластів і їх регуляторних білків на проліферацію і диференціювання кератиноцитів проведено порівняльний аналіз особливостей морфології і проліферації кератиноцитів на субстратах з колагену I і III типів, а також фібронектину у спільній культурі з фібробластами людини. Кератиноцити людини виділяли з фрагментів шкіри хворих з опіками, взятої під час операції аутодермопластики. Щільність посіву кератиноцитів становила 50 х 103 клітин на 1 см2. Клінічна ефективність трансплантації культивованих фібробластів оцінювалася у 517 хворих. Всі пацієнти були розділені на дві групи: 1-я - дорослі постраждалі з опіками IIA, В - IV ступеня; 2-я - діти з глибокими опіками IIIB - IV ступеня. Оцінка динаміки структурно-функціональної організації фібробластів монослойной культури з урахуванням ролі в процесах регенерації гликозаминогликанов, фібронектину і колагену дозволила авторам визначити 3-ю добу як найбільш сприятливий термін використання культур фібробластів для виготовлення трансплантатів. Дослідження впливу фібробластів на проліферацію і диференціювання кератиноцитів показало, що в умовах in vitro фібробласти надають виражену стимулюючу дію, в першу чергу, на процеси адгезії кератиноцитів, збільшуючи число прикріпилися клітин і швидкість їх фіксації більш ніж в 2 рази. Стимуляція процесів адгезії супроводжується підвищенням інтенсивності синтезу ДНК і рівня проліферації кератиноцитів. Крім того, виявилося, що присутність фібробластів і сформованого ними екстрацелюлярного матриксу є необхідною умовою для формування тонофібріллярного апарату кератиноцитів, міжклітинних зв'язків і, в кінцевому рахунку, для диференціювання кератиноцитів і утворення базальної мембрани. При лікуванні дітей з глибокими опіками встановлена висока клінічна ефективність трансплантації культури аллофібробластов, особливо в групі пацієнтів з великими ураженнями шкірного покриву в умовах дефіциту донорських ділянок. Комплексне морфофункциональное дослідження показало, що фібробласти трансплантата характеризуються активним синтезом ДНК, а також колагену, фібронектину і глікозаміногліканів, які входять до складу формованого клітинами екстрацелюлярного матриксу. Автори вказують на високий відсоток приживлення трансплантованих фібробластів (до 96%), різке скорочення термінів їх отримання (протягом 24-48 годин замість 2-3 тижнів у випадку використання кератиноцитів), істотне прискорення епітелізації опікової поверхні, а також значне здешевлення (в 10 раз) технології вирощування трансплантата з фібробластів в порівнянні з трансплантацією кератиноцитів. Застосування трансплантації культивованих аллофібробластов дає можливість рятувати життя дітей з критичними опіками - термічним ураженням більше 50% поверхні тіла, що раніше вважалося несумісним з життям. Треба відзначити, що при трансплантації алогенних ембріональних фібробластів також переконливо доведені не тільки більш швидка регенерація рани і реконвалесценция хворих з різним ступенем і площею опіку, а й суттєве зниження їх смертності.

Аутологічні фібробласти застосовують і в такий складній області пластичної хірургії, як відновлювальна корекція пошкоджень голосових зв'язок. Зазвичай з цією метою використовується бичачий колаген, тривалість дії якого обмежена його імуногенність. Будучи чужорідним білком, бичачий колаген чутливий до Коллагеназа реципієнта і може викликати імунні реакції, для зниження ризику яких були розроблені технології отримання препаратів колагену, перехресно зв'язаного з глутаральдегідом. Їх перевага полягає в більшій стабільності і меншою імуногенності, що знайшло практичне застосування в усуненні дефектів і атрофії голосових зв'язок. Ін'єкції аутологичного колагену вперше були використані в 1995 році. Методика забезпечувала збереження первинної структури волокон аутологичного колагену, включаючи внутрішньо-молекулярні ензиматичні каталізувати перехресні зв'язку. Справа в тому, що натуральні колагенові волокна більш стійкі до руйнування протеазами, ніж реконстітуірованний колаген, в якому телопептіди розрізані. Цілісність телопептиду важлива для четвертинного будови колагенових волокон і утворення перехресних зв'язків між суміжними молекулами колагену. На відміну від препаратів бичачого колагену, АУТОЛОГІЧНОЇ колаген не викликає у реципієнта імунних реакцій, однак він недостатньо ефективний як восполняющего агента. Стійка корекція може бути досягнута за рахунок локальної продукції колагену шляхом трансплантації аутологічних фібробластів. Однак при дослідженні ефективності пересадки аутологічних фібробластів в клініці було виявлено певні труднощі. У ранньому періоді після трансплантації фібробластів клінічний ефект виявився слабшим порівняно з таким після введення бичачого колагену. При культивуванні аутологічних фібробластів не виключена можливість трансформації нормальних фібробластів в патологічні, так звані міофібробласти, відповідальні за розвиток фіброзу і утворення рубців, про що свідчить скорочення генового гелю, обумовлене специфічною взаємодією фібробластів і колагенових фібрил. Крім того, після серійного пассірованія in vitro фібробласти втрачають здатність синтезувати білки позаклітинного матриксу.

Тим не менш, у даний час експериментально відпрацьована методика культивування аутологічних фібробластів людини, усуває зазначені вище недоліки і не призводить до онкогенної трансформації нормальних фібробластів. Отримані за такою методикою аутологічні фібробласти використовуються для заповнення дефектів м'яких тканин обличчя. У дослідженні Г. Келлер і співавторів (2000) лікування отримували 20 пацієнтів у віці від 37 років до 61 року зі зморшками і атрофічними рубцями. Біоптати шкіри (4 мм) завушній області транспортували в лабораторію в стерильних пробірках, що містять 10 мл культурального середовища (середа Голка з антибіотиком, мікосептіком, пируватом і ембріональної телячої сироваткою). Матеріал поміщали всередину 3-5 культуральних чашок діаметром 60 мм і інкубували в термостаті з атмосферою, що містить 5% С02. Через 1 тиждень клітини знімали з чашок шляхом тріпсінізаціі і поміщали у флакони площею 25 см2. Клітини вводили пацієнтам в кількості 4 х 107. Значний і стійкий клінічний ефект спостерігався у пацієнтів при корекції носо-губних складок, а також у пацієнтів з рубцями через 7 і 12 місяців після третьої трансплантації аутологічних фібробластів. За даними проточної цитометрії, культивовані фібробласти продукували велику кількість колагену I типу. У дослідженнях in vitro показана нормальна скорочувальна здатність ін'еціруемих фібробластів. Через 2 місяці після підшкірного введення культивованих фібробластів в дозі 4 х 107 клітин у мишей nude пухлин виявлено не було. Ін'еціруемих фібробласти не викликали у пацієнтів утворення рубців і дифузного фіброзу. На думку автора, приживлення аутологічних фібробласти здатні постійно продукувати колаген, що дасть косметичний ефект омолодження. При цьому, оскільки тривалість життя диференційованих клітин обмежені, фібробласти, взяті у молодого пацієнта, більш ефективні, ніж отримані у літніх людей. У перспективі передбачається можливість кріоконсервації культури фібробластів, взятих у молодого донора, щоб пізніше трансплантувати літньому пацієнтові його власні молоді клітини. На закінчення слід не цілком коректний висновок про те, що аутологічні фібробласти за умови їх функціональної схоронності є ідеальним засобом корекції дефектів м'яких тканин обличчя. При цьому сам же автор зазначає, що в процесі дослідження виникли і деякі проблемні ситуації, пов'язані із застосуванням аутологічної фібробласт-коллагеновой системи. Клінічний ефект часто опинявся слабкіше, ніж при використанні бичачого колагену, що викликало розчарування пацієнтів.

В цілому, літературні дані про перспективи клінічного застосування мезенхімальних стовбурових клітин виглядають досить оптимістично. Робляться спроби використання аутологічних кістковомозкових мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників для лікування дегенеративних уражень суглобів. Проводяться перші клінічні випробування застосування культивованих мезенхімальних прогеніторних клітин в терапії складних переломів кістки. Ауто і алогенних мезенхімальні клітини строми кісткового мозку використовуються для створення хрящової тканини з метою трансплантації при корекції дефектів суглобового хряща внаслідок травми або аутоімунних поразок. Відпрацьовуються методики клінічного застосування мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників для усунення кісткових дефектів у дітей з важкою формою незавершеного остеогенезу, викликаної мутаціями гена колагену I типу. Після міелоабеляціі дітям-реципієнтам трансплантують кістковий мозок від НLА-сумісних здорових донорів, оскільки нефракціонований кістковий мозок може містити достатню кількість мезенхімальних стовбурових клітин для заповнення важкого кісткового дефекту. Після трансплантації алогенного кісткового мозку таким дітям відзначені позитивні гістологічні зміни в трабекулярних кістках, збільшення швидкості росту і зниження частоти кісткових переломів. В окремих випадках позитивний клінічний результат досягається при пересадці близькоспорідненого аллогенного кісткового мозку і остеобластів. Для лікування вродженої крихкості кісток, зумовленої дисбалансом остеобластів і остеокластів в кістковій тканині, використовується і трансплантація МСК. Відновлення костеобразования в цьому випадку досягається за рахунок хімерізаціі пулу стовбурових і прогеніторних стромальних клітин в кістковій тканині пацієнтів.

Триває вдосконалення методик генетичної модифікації донорських мезенхімальних стовбурових клітин з метою корекції генетичних дефектів стромальних тканин. Передбачається, що вже найближчим часом мезенхімальні клітини-попередники будуть використовуватися в неврології для спрямованої хімерізаціі клітин мозку і створення здорового пулу клітин, здатного генерувати дефіцитний фермент або фактор, відповідальний за клінічні прояви захворювання. Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин може використовуватися для відновлення строми кісткового мозку у онкологічних хворих після радіо-та хіміотерапії, а в поєднанні з кістково клітинами - для відновлення гемопоезу. Розвитку замісної терапії, спрямованої на усунення дефектів опорно-рухового апарату за допомогою МСК, сприяють інженерні розробки в області конструювання матричних біоматеріалів або біомі- метиків, які формують каркаси, заселяють потомством мезенхімальних стовбурових клітин.

Джерела мезенхімальних стовбурових клітин

Основним джерелом мезенхімальних стовбурових клітин є кістковий мозок, гемопоетичні стовбурові клітини якого в організмі ссавців постійно диференціюються в клітини крові та імунної системи, тоді як мезенхімальні стовбурові клітини представлені нечисленної популяцією фібробластоподібних клітин строми кісткового мозку і сприяють збереженню недиференційованого стану кровотворних стовбурних клітин. У певних умовах мезенхімальні стовбурові клітини диференціюються в клітини хрящової і кісткової тканини. При посіві на культуральне середовище в умовах низької щільності посадки мононуклеарние стромальні клітини кісткового мозку формують колонії адгезивних клітин, які, власне, і є фібробластоподібних мультипотентними мезенхімальними клітинами-попередниками. Деякі автори вважають, що в кістковому мозку депонуються некоммітірованние мезенхімальні стовбурові клітини, які, завдяки здатності до самооновлення і високому дифференцировочного потенціалу, забезпечують всі тканини організму мезенхімальними попередниками стромальних елементів протягом усього життя організму ссавців.

В кістковому мозку стромальні клітинні елементи формують мережу, що заповнює простір між синусоїда і кістковою тканиною. Зміст дормантних МСК в кістковому мозку дорослої людини можна порівняти з кількістю гемопоетичних стовбурових клітин і не перевищує 0,01-0,001%. Мезенхімальні стовбурові клітини, виділені з кісткового мозку і не піддавалися культивування, позбавлені адгезивних молекул. Такі МСК НЕ експресують CD34, ICAM, VCAM, колаген I і III типів, CD44 і CD29. Отже, in vitro на підкладці культури фіксує не мезенхімальні стовбурові клітини, а більш просунуті прогеніторні похідні мезенхімальних стовбурових клітин, вже сформували компоненти цитоскелету і рецепторного апарату молекул клітинної адгезії. Стромальні клітини з фенотипом CD34 виявлені навіть в периферичної крові, хоча в кістковому мозку їх значно менше, ніж СD34-позитивних мононуклеаров. Виділені з крові та переведені у культуру СD34-клітини прикріплюються до підкладки і утворюють колонії фібробластоподібних клітин.

Відомо, що в ембріональному періоді стромальна основа всіх органів і тканин ссавців і людини виникає із загального пулу мезенхімальних стовбурових клітин до початку і на стадії органогенезу. Тому вважається, що в зрілому організмі велика частина мезенхімальних стовбурових клітин повинна знаходитися в сполучної і кісткової тканини. Встановлено, що основна частина клітинних елементів строми пухкоїсполучної і кісткової тканини представлена коммітірованних прогеніторних клітинами, які, проте, зберігають здатність до проліферації і формуванню клонів in vitro. При введенні таких клітин в загальний кровотік більше 20% мезенхімальних прогеніторних клітин імплантуються серед стромальних елементів кровотворної тканини і паренхіматозних органів.

Потенційним джерелом мезенхімальних стовбурових клітин є жирова тканина, серед стовбурових клітин якої виявлено коммітірованние в різному ступені попередники адипоцитів. Найменш зрілі прогеніторні елементи жирової тканини - стромально-судинні клітини, які так само, як і мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники кісткового мозку, здатні диференціюватися в адипоцити під впливом глюкокортикоїдів, інсуліноподібний фактор росту і інсуліну. У культурі стромально-судинні клітини диференціюються в адипоцити і хондроцити, а в жировій тканині кістковомозкового походження є клітини, що утворюють адипоцити і остеобласти.

У м'язах також виявлені стромальні стовбурові джерела. У первинній культурі клітин, виділених з скелетної мускулатури людини, виявляються клітини зірчастої форми і багатоядерні міотрубочкі. У присутності кінської сироватки зірчасті клітини проліферують in vitro без ознак цітодіфференціровкі, а після додавання в живильне середовище дексаметазону їх диференціювання характеризується появою клітинних елементів з фенотипом клітин скелетних і гладких м'язів, кісткової, хрящової і жирової тканини. Отже, в м'язовій тканині людини представлені як коммітірованние, так і некоммітірованние мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники. При цьому показано, що популяція клітин-попередників, представлених в скелетних м'язах, походить від некоммітірованних мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку і відрізняється від міогенних сателітних клітин.

У міокарді новонароджених щурів також виявлені адгезивні зірчасті клітини, що відповідають за дифференцировочного потенціалу мультипотентні мезенхімальних прогеніторні клітини, оскільки під впливом дексаметазону вони диференціюються в адипоцити, остеобласти, хондроцити, клітини гладеньких м'язів, міотрубочкі скелетних м'язів і міокарда. Показано, що судинні клітини гладких м'язів (перицитам) є похідними недиференційованих периваскулярних мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників. У культурі периваскулярні мезенхімальні стовбурові клітини експресують а-актину гладких м'язів і рецептор тромбоцитарного фактора росту і здатні диференціюватися по крайней мере в клітини гладеньких м'язів.

Особливе місце, з точки зору стовбурових резервів, займає хрящова тканина, вкрай низький репаративний потенціал якої, як вважають, обумовлений дефіцитом мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників або дифференцировочного і ростових факторів. Допускається, що прекоммітірованние до хондро- і остеогенезу мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники надходять в хрящову тканину з інших тканинних джерел.

Тканинне походження і умови коммитирование мезенхімальних клітин-попередників в сухожиллях також не встановлені. Експерментальние спостереження свідчать, що в ранньому післяпологовому періоді клітини ахіллового сухожилля кроликів в первинних культурах і при першому пасажі зберігають експресію колагену I типу та декоріна, однак при подальшому культивуванні вони втрачають диференціювальні маркери теноцітов.

Треба зауважити, що відповідь на питання, чи дійсно локалізовані в різних тканинах мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники постійно присутні в їх стромі, або ж тканинної пул мезенхімальних стовбурових клітин заповнюється за рахунок міграції стромальних стовбурових клітин кісткового мозку, все ще не отримано.

Крім кісткового мозку та інших мезенхімальних тканинних зон дорослого організму ще одним джерелом МСК може бути кордова кров. Показано, що кров пуповинної вени містить клітини, які мають схожі морфологічні і антигенні характеристики з мультипотентними мезенхімальними клітинами-попередниками, здатні до адгезії і не поступаються мультипотентні мезенхімальних клітин-попередників кістковомозкового походження по дифференцировочного потенціалу. У культурах мезенхімальних стовбурових клітин пуповинної крові виявлено від 5 до 10% некоммітірованних мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників. Виявилося, що їх кількість в кордової крові обернено пропорційно терміну гестації, що побічно свідчить про міграцію мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників в різні тканини в процесі розвитку плоду. З'явилися перші відомості про клінічні дослідження із застосуванням мезенхімальних стовбурових клітин, виділених з пуповинної крові, а також отриманих з ембріонального біоматеріалу, що засноване на відомій здатності фетальних стовбурових клітин інтегруватися, приживлятися і функціонувати в органах і тканинних системах дорослих реципієнтів.

Пошуки нових джерел мезенхімальних стовбурових клітин

Застосування мезенхімальних стовбурових клітин ембріонального походження, як і інших фетальних клітин, створює цілий ряд етичних, правових, юридичних і законодавчих проблем. Тому пошук внеембріонального клітинного донорського матеріалу триває. Невдалою виявилася спроба клінічного застосування фібробластів шкіри людини, що було зумовлене не тільки високою фінансовою ємністю технології, але і швидкої дифференцировкой фібробластів в фіброціти, що мають значно менший потенціал проліферації і продукують обмежена кількість факторів росту. Подальший прогрес в галузі вивчення біології МСК і мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників кісткового мозку дозволив розробити стратегію клінічного використання аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин. Технологія їх виділення, культивування, розмноження ex vivo і спрямованої диференціювання вимагала, перш за все, вивчення спектру молекулярних маркерів МСК. Їх аналіз показав, що в первинних культурах кісткової тканини людини є кілька типів мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників. Фенотип проостеобластов виявлений у клітин, що експресують маркер стромальних клітин-попередників STRO-1, але не мають маркер остеобластів - лужну фосфатазу. Такі клітини характеризуються низькою здатністю до утворення мінералізованою кісткового матриксу, а також відсутністю експресії остеопонтіна і рецептора ПТГ. Похідні STRO-1-позитивних клітин, що не експресують лужну фосфатазу, представлені проміжно і повністю диференційованими остеобластами. Встановлено, що клітинні елементи клонованих ліній STRO-1-позитивних клітин трабекулярних кісток людини здатні диференціюватися в зрілі остеоцитів і адипоцити. Напрямок диференціювання цих клітин залежить від впливу поліненасичених жирних кислот, прозапальних цитокінів - IL-1b і фактора некрозу пухлини а (TNF-а), а також протизапальний і імуносупресивної TGF-b.

Надалі виявилося, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники позбавлені специфічного, тільки їм властивого фенотипу, але експресують комплекс маркерів, характерних для мезенхімальних, ендотеліальних, епітеліальних і м'язових клітин при відсутності експресії імунофенотипових антигенів гемопоетичних клітин - CD45, CD34 і CD14. Крім того, мезенхімальні стовбурові клітини конститутивно і індуцібельная продукують гемопоетичні і негемопоетіческіе ростові фактори, інтерлейкіни і хемокіни, а на мультіпотентних мезенхімальних клітинах-попередниках експресуються рецептори для деяких цитокінів та ростових факторів. Серед клітин стромальной основи організму людини виявлені дормантние, або покояться клітини з імунофенотипові, майже ідентичним антигенною профілем необроблених 5-фторурацилом мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників - і ті, і інші клітини експресують CD117, маркирующий "дорослі" стовбурні клітини.

Таким чином, клітинний маркер, унікальний для мезенхімальних стовбурових клітин, до сих пір не встановлено. Допускається, що покояться клітини представляють популяцію некоммітірованних мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників, оскільки вони не експресують маркери клітин, коммітірованних до остео (Cbfa-1) або адіпогенезу (PPAR-y-2). Тривала експозиція повільно проліферуючих лежать клітин з ембріональної телячої сироваткою призводить до утворення термінально дифференцирующихся коммітірованних попередників, що характеризуються швидким ростом. Клональний зростання таких стовбурових мезенхімальних клітин підтримується FGF2. Схоже, що геном стромальних стовбурових клітин досить щільно "закритий". Є повідомлення про відсутність спонтанної диференціювання у МСК - без спеціальних умов для коммитирование вони не перетворюються навіть в клітини мезенхімального ряду.

Для вивчення популяційної структури похідних мезенхімальних стовбурових клітин проводиться пошук маркерних дифференцировочного білків на стромальних клітинних лініях і в первинних культурах. При клональний аналізі колонієутворюючих клітин кісткового мозку in vitro встановлено, що при впливі на первинні культури EGF збільшує середній розмір колоній і зменшує клональную експресію лужноїфосфатази, тоді як додавання гідрокортизону активує експресію лужноїфосфатази, яка є маркером остеогенной спрямованості диференціювання МСК. Моноклональні антитіла до STRO-1 уможливили поділ і вивчення популяції STRO-1-позитивних адгезивних клітин в гетерогенній системі декстеровскіх культур. Визначено спектр цитокінів, що регулюють не тільки проліферацію і диференціювання кровотворних і лімфоїдних клітин, але і беруть участь у формуванні, утворенні та розробці скелетних тканин за допомогою пара-, ауто- і ендокринних механізмів. Опосередковане рецепторами вивільнення таких вторинних месенджерів, як цАМФ, диацилглицерол, інозітолтріфосфат і Са2 +, також використовується для маркерного аналізу різних категорій клітин стромальних тканин, що експресують відповідні рецептори. Застосування моноклональних антитіл в якості маркерів дозволило встановити приналежність ретикулярних клітин строми лімфоїдних органів до Т- і В-залежним зонам.

Якийсь час тривали наукові суперечки навколо питання про можливість походження МСК з гемопоетичних стовбурових клітин. Дійсно, при експлантаціі суспензії кістковомозкових клітин в моношарова культури в них виростають дискретні колонії фібробластів. Однак було показано, що наявність попередників фібробластний колоній і різних паростків диференціювання гемопоетичних тканини в складі кісткового мозку не є доказом їх спільного походження зі стовбурної кровотворної клітини. За допомогою дискримінантного аналізу кістковомозкових стовбурових клітин встановлено, що микроокружение при гетеротопних трансплантації кісткового мозку переносити не гемопоетичними клітинами, що доводить існування, в кістковому мозку гістогенетіческі незалежної від кровотворних клітин популяції МСК.

Крім того, метод виборчого клонування дозволив виявити в моношарових культурах кістковомозкових клітин нову категорію стромальних клітин-попередників, визначити їх чисельність, вивчити їх властивості, проліферативні та диференціювальні потенції. Виявилося, що стромальні фібробластоподібних клітини in vitro пролиферируют і утворюють диплоїдні колонії, які при зворотному трансплантації в організм забезпечують формування нових кровотворних органів. Результати дослідження окремих клонів свідчать про те, що серед стромальних клітин-попередників присутній популяція клітин, за своїм проліферативне і дифференцировочного потенціалу здатна претендувати на роль стовбурових клітин стромальной тканини, гістогенетіческі незалежною від стовбурових кровотворних клітин. Клітини цієї популяції характеризуються самопідтримуваним зростанням і диференціюються в прогеніторні клітинні елементи кісткової, хрящової і ретикулярної тканини кісткового мозку.

Великий інтерес представляють результати досліджень Р. Чайлахян і співавторів (1997-2001), які культивували кістковомозкові стромальні клітини-попередники кроликів, морських свинок та мишей на живильному середовищі а-МЕМ з додаванням ембріональної телячої сироватки. Експлантацію автори проводили з вихідною щільністю 2-4 х 103 клітин кісткового мозку на 1 см2. Як фідера використовували гомологічні або гетерологічние інактивовані опроміненням клітини кісткового мозку в дозі, що зберігає фідерне дію, але повністю блокує їх проліферацію. Двотижневі первинні дискретні колонії фібробластів трипсінізірована для отримання моноклональних штамів. Докази клонального походження колоній були отримані за допомогою хромосомного маркера в змішаних культурах кісткового мозку самця і самок морських свинок, зйомки з часовим інтервалом живих культур, а також в змішаних культурах сінгенного кісткового мозку мишей СВА і СВАТ6Т6. Трансплантація суспензії свежевиделенних клітин кісткового мозку або вирощених in vitro стромальних фібробластів під капсулу нирки проводилася в івалонових або желатинових пористих каркасах, а також в інактивована кролячому губчатому кістковому матриксі. Для трансплантації клонів в кістковому чохлі стегнові кістки морської свинки очищали від м'яких тканин і окістя, обрізали епіфізи і ретельно вимивали кістковий мозок. Кость нарізали на фрагменти (3-5 мм), висушували і піддавали опроміненню в дозі 60 Гр. У кісткові чохли поміщали індивідуальні колонії фібробластів і імплантували внутрішньом'язово. Для внутрішньочеревно трансплантації стромальних фібробластів, вирощених in vitro, використовувалися дифузійні камери типів А (V = 0,015 см3, h = 0, l мм) і О (V = 0,15 см3, h = 2 мм).

При вивченні динаміки зростання клональних штамів Р. Чайлахян і співавтори (2001) встановили, що окремі клітини, що утворюють колонії фібробластів, а також їх нащадки мають величезний проліферативним потенціалом. До 10-му пасажу чисельність фібробластів в деяких штамах становила 1,2-7,2 х 10 ⁹ клітин. У процесі свого розвитку вони здійснювали до 31-34 клітинних подвоєнь. При цьому гетеротопних трансплантація штамів кістковомозкового походження, сформованих Стромальні попередниками декількох десятків клонів, приводила до переносу кістковомозкового мікрооточення і утворення в зоні трансплантації нового кровотворного органа. Автори поставили питання про те, чи здатні окремі клони переносити костномозговое микроокружение стромальних клітин або для цього потрібно кооперація декількох різних клоногенних стромальних попередників? І якщо окремі клони виявляться здатними до перенесення мікрооточення, чи буде воно повноцінним для всіх трьох паростків кровотворення, або різні клони забезпечують формування мікрооточення для різних кровотворних паростків? Для вирішення цих питань була розроблена технологія культивування стромальних клітин-попередників на коллагеновом гелі, що дозволяє знімати з поверхні вирощені колонії фібробластів для подальшої гетеротопних трансплантації. Окремі клони стромальних фібробластів, вирощені з кістковомозкових клітин мишей СВА і морських свинок, вирізалися разом з фрагментом гелевого покриття і трансплантувати гетеротопних - під капсулу нирок сінгенних мишей або в м'яз живота аутологічних морських свинок. При трансплантації в м'яз колонії на гелі поміщали в кісткові чохли.

Автори встановили, що через 50-90 днів після трансплантації колоній кістковомозкових фібробластів в 20% випадків в зоні пересадки спостерігався розвиток кісткової або кісткової і кровотворної тканини. У 5% тварин-реципієнтів утворилися вогнища кісткової тканини містили порожнину, заповнену кістковим мозком. Усередині кісткових циліндрів такі осередки мали округлу форму і капсулу, побудовану з кісткової тканини з остеоцитами і добре розвиненим остеобластичні шаром. Кістковомозкова порожнину містила ретикулярную тканину з мієлоїднимі і еритроїдних клітинами, пропорційне співвідношення яких не відрізнялося від такого в звичайному кістковому мозку. У нирці трансплантат був типовий кістковомозковою орган, що утворюється при пересадці нативного кісткового мозку, причому кісткова капсула покривала костномозговую порожнину тільки з боку ниркової капсули. Кровотворна тканина включала мієлоїдний, еритроїдні і мегакаріоцитарниє елементи. Строма кістковомозковою порожнини мала добре розвинену систему синусів і містила типові жирові клітини. У той же час в зоні трансплантації деяких колоній під капсулою нирки була виявлена кісткова тканина без ознак кровотворення. Вивчення проліферативних і дифференцировочного потенцій індивідуальних клонів було продовжено на моноклональних кістковомозкових штамах кроликів, клітини яких ресуспензіровалі в живильному середовищі і в окремій івалоновой губці з масою 1-2 мг підсаджували під ниркову капсулу кролика-донора кісткового мозку. Такий аутотрансплантации були піддані клітини 21 моноклонального штаму. Результати враховували через 2-3 місяці. Автори встановили, що в 14% випадків пересаджені моноклональні штами утворювали кістковомозковою орган, що складається з кісткової тканини і костномозговой порожнини, заповненої кровотворними клітинами. У 33% спостережень трансплантовані штами формували компактну кістку різної величини з замурованими в порожнинах остёоцітамі і розвиненим остеобластичні шаром. У деяких випадках в губах з трансплантованими клонами розвивалася ретикулярна тканина без кісткових або кровотворних елементів. Іноді відбувалося формування ретикулярної строми з добре розвиненою мережею синусоидов, але не заселеної кровотворними клітинами. Таким чином, отримані результати виявилися схожими з даними, отриманими при трансплантації клонів на коллагеновом гелі. Однак, якщо трансплантація клонів, вирощених на підкладці, приводила до утворення кістково-мозкової тканини в 5% випадків, кісткової - в 15% і ретикулярної тканини - в 80% випадків, то при трансплантації моноклональних штамів формування кістковомозкових елементів спостерігалося в 14% випадків, кісткових - в 53% і ретикулярних - в 53% випадків. На думку авторів, це свідчить про те, що умови для реалізації проліферативних і дифференцировочного потенцій стромальних фібробластів при трансплантації на пористих каркасах виявилися оптимальніше, ніж при їх пересадці в кісткових чохлах і на коллагеновой підкладці. Не виключено, що використання більш досконалих методів культивування і зворотного трансплантації клонів може поліпшити умови для реалізації клонами своїх дифференцировочного потенцій і змінити ці співвідношення. Так чи інакше, але основне значення проведених досліджень полягає в тому, що частина клонів стромальних клітин здатна формувати кісткову тканину і одночасно забезпечувати стромальних гемопоетичний микроокружение відразу для трьох паростків кістковомозкового кровотворення: еритроїдного, мієлоїдного і мегакариоцитарного, створюючи при цьому чималі плацдарми кровотворної тканини і деяку кісткову масу.

Далі автори вирішували питання про здатність до даних типів клітинної диференціювання окремих клоногенних стромальних клітин-попередників в умовах закритої системи дифузійних камер. Крім того, треба було з'ясувати, чи мають поліпотентні окремі клони, або ж для прояву дифференцировочного потенціалу необхідно кооперативне взаємодія кількох клонів із закріпленим ознакою цітодіфференціровкі, різне співвідношення яких визначає переважне формування кісткової, ретикулярною або хрящової тканини. Об'єднавши два методичних підходи - отримання моноклональних штамів кістковомозкових стромальних клітин-попередників і трансплантацію їх в дифузійні камери, Р. Чайлахян і співавтори (2001) отримали результати, які дозволили наблизитися до розуміння структурної організації кістковомозковою строми. Трансплантація моноклональних штамів стромальних клітин-попередників в камерах типу Про приводила до утворення як кісткової, так і хрящової тканини, що свідчить про здатність нащадків однієї стромальной колонієутворюючих клітини одночасно формувати кісткову і хрящову тканину. Припущення про те, що кісткова і хрящова тканина походить від загальної стромальной клітини-попередника, раніше висловлювалася неодноразово. Однак ця гіпотеза не мала коректного експериментального підтвердження. Утворення кістки і хряща в дифузійних камерах стало необхідним доказом існування серед стовбурових клітин строми кісткового мозку загальної клітини-попередника для цих двох типів тканини.

Потім 29 клональних штамів другого-третього пасажів, отриманих з первинних культур кісткового мозку кролика, містилися в дифузійні камери і імплантували внутрибрюшинно гомологічним тваринам. Проведені дослідження показали, що 45% кістковомозкових моноклональних штамів мають остеогенними потенціями. Виключно ретикулярную тканину містили 9 камер, але разом з кісткової і хрящової тканиною вона була присутня ще в 13 камерах, що становило 76% всіх штамів. У камерах типу О, де була можлива диференціювання як кісткової, так і хрящової тканини, досліджені 16 штамів. У чотирьох камерах (25%) формувалася як кісткова, так і хрящова тканина. Слід ще раз відзначити, що в дослідженнях Р. Чайлахян і співавторів (2001) окремі клітини-попередники зазнавали в складі клітинного штаму від 31 до 34 подвоєнь, а їх потомство склало 0,9-2,0 x 10 ⁹ клітин. Кількість мітозів, яким піддавалися клітини-попередники поліклональних штамів, практично не відрізнялося від такого у клітин моноклональних штамів. При цьому темп розвитку поліклональних штамів, особливо в першій фазі їх формування, в істотній мірі залежав від кількості колоній, які використовуються для ініціації штамів. Диплоїдні штами ембріональних фібробластів людини (WI-38) при реклонірованіі на 12-15-му рівнях подвоєння також формували колонії, що розрізняються по діаметру і змістом в них клітин. Великі колонії, що містять понад 103 клітин, становили всього 5-10%. Зі збільшенням кількості поділів відсоток великих колоній знижувався. Моно- і поліклональні штами стромальних кістковомозкових фібробластів зберігали диплоїдний набір хромосом після 20 і більше подвоєнь, а тенденція їх розвитку була порівнянна з динамікою розвитку диплоїдних штамів ембріональних фібробластів. Аналіз дифференцировочного потенціалу окремих кістковомозкових стромальних клітин-попередників, проведений шляхом трансплантації моноклональних штамів в дифузійні камери, показав, що половина з них остеогенні. Великі колонії склали 10% від їх загального числа. Отже, число остеогенних колонієутворюючих клітин відповідало приблизно 5% від їх загальної популяції. У загальній масі виявлених авторами остеогенних клітин-попередників були присутні клітини, здатні формувати одночасно кісткову і хрящову тканину. При цьому вперше встановлено, що для цих двох типів тканини в дорослому організмі є загальна клітина-попередник: 25% тестованих клонів були створені подібними клітинами, а їх чисельність серед загальної популяції клітин-попередників становила не менше 2,5%.

Таким чином, гетеротопних трансплантація окремих клонів кістковомозкових фібробластів відкрила нові аспекти структурної організації популяції мезенхімальних клітин-попередників. Виявлено стромальні клітини-попередники, здатні переносити специфічне мікрооточення відразу для всіх паростків кровотворення, чисельність яких серед досліджених великих клонів на різних моделях складає від 5 до 15% (0,5-1,5% від загального числа виявлених клітин-попередників). Поряд з клонами, що переносять повне костномозговое микроокружение, присутні клітини-попередники, детерміновані лише до остеогенезу, що утворюють при перенесенні у відкритій системі кісткову тканину, яка не підтримує розвиток гемопоезу. Їх чисельність від загального числа клітин-попередників становить 1,5-3%. Частина цих клітин здатна формувати кісткову тканину з обмеженим терміном самопідтримки. Отже, популяція стромальних клітин-попередників за своїм дифференцировочного потенціалу є гетерогенною. Серед них є категорія клітин, які претендують на роль стовбурових стромальних клітин, здатних диференціюватися в усіх трьох напрямках, властивих стромальной тканини кісткового мозку, утворюючи при цьому кісткову, хрящову і ретикулярну тканину. Наведені дані дозволяють сподіватися, що за допомогою різних клітинних маркерів вдасться визначити внесок кожного типу стромальних клітин в організацію специфічного мікрооточення і підтримку кровотворення в декстеровскіх культурах.

Особливості мезенхімальних стовбурових клітин

В останні роки встановлено, що в стаціонарних культурах кісткового мозку мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники представлені обмеженою популяцією дрібних агранулярного клітин (RS-1-клітини), що характеризуються низькою здатністю до колоніеобразованію і відсутністю експресії антигену Ki-67, специфічного для проліферуючих клітин. Антигенні параметри дормантних RS-1-клітин відрізняються від спектра антигенів швидко проліферуючих коммітірованних стромальних клітин-попередників. Встановлено, що висока швидкість проліферації коммітірованних клітин-попередників спостерігається тільки в присутності RS-1-клітин. У свою чергу, RS-1-клітини збільшують швидкість росту під впливом факторів, секретується найбільш зрілими похідними мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників. Створюється враження, що RS-1-клітини є підкласом некоммітірованних МСК, здатних до рециклінгу. In vitro резистентні до 5-фторурацилу стромальні клітини-попередники кісткового мозку характеризуються низьким вмістом РНК і високим рівнем експресії гена орнітиндекарбоксилази - маркера непроліферірующей клітин.

Інтенсивне розмноження стромальних клітин-попередників починається після їх фіксації на підкладці. При цьому експресується маркерний профіль слабо диференційованих клітин: SH2 (рецептор TGF- (3), SH3 (домен сигнального білка), колаген I і III типів, фібронектину, рецептори адгезії VCAM-1 (CD106) і ICAM (CD54), кадгерінов-11 , CD44, CD71 (рецептор трансферину), CD90, CD120a і CD124, але без експресії характерних маркерів гемопоетичних стовбурових клітин (CD34, CD14, CD45). Клональний зростання дає можливість багаторазово пасерувати мезенхімальні стовбурові клітини з утворенням в культурі численних генетично однорідних стромальних прогеніторних плюрипотентних клітин. Чере з 2-3 пасажу їх кількість досягає 50-300 млн. У культурі достатньої щільності після зупинки проліферації стромальні клітини-попередники, на відміну від фібробластів кровотворної тканини, диференціюються в адипоцити, міоцити, клітини хряща і кісткової тканини. Комбінація з трьох регуляторних дифференцировочного сигналів , що включає 1-метил-ізобутілксантін (індуктор внутрішньоклітинного утворення цАМФ), дексаметазон (інгібітор фосфолипаз А і С) і індометацин (інгібітор циклооксигенази, що знижує і активність тромбоксансінтази), перетворює в адипоцити до 95% прогеніторних мезенхімальних клітин. Утворення адипоцитів з незрілих стромальних елементів підтверджується експресією гена ліпопротеідліпази, гістохімічним виявленням аполипопротеинов і пероксісомальних рецепторів. Клітини того ж клону під впливом TGF-b в бессивороточной середовищі створюють однорідну популяцію хондроцитов. Багатошарова культура клітин цієї хрящової тканини характеризується розвиненим міжклітинних матриксом, що складається з протеогликана і колагену II типу. У живильному середовищі з 10% фетальної сироваткою вплив комплексу сигналів диференціювання, що складається з b-гліцерофосфату (донатор неорганічного фосфату), аскорбінової кислоти і дексаметазону, в тій же культурі стромальних прогеніторних клітин-попередників призводить до формування клітинних агрегатів. У таких клітинах спостерігається прогресуюче підвищення активності лужної фосфатази і рівня остеопонтіна, що свідчить про утворення кісткової тканини, мінералізація клітин якої підтверджується прогресивним підвищенням внутрішньоклітинного вмісту кальцію.

За деякими даними, здатність мезенхімальних стовбурових клітин до необмеженого поділу і відтворення різних типів клітин мезенхимальной лінії диференціювання поєднується з високим ступенем пластичності. При введенні в шлуночки або біла речовина мозку мезенхімальні стовбурові клітини мігрують в паренхіму нервової тканини і диференціюються в похідні глиальной або нейрональної лінії клітин. Крім того, є відомості про трансдіфференціровка МСК в стовбурові гемопоетичні клітини як in vitro, так і in vivo. При більш поглибленому аналізі в окремих роботах визначена виключно висока пластичність МСК, що проявляється в їх здатності диференціюватися в астроцити, олігодендроціти, нейрони, кардіоміоцити, клітини гладеньких м'язів і клітини скелетної мускулатури. В цілому ряді робіт з вивчення трансдіфференціровочного потенціалу МСК in vitro і in vivo встановлено, що мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники кістковомозкового походження термінально диференціюються в клітинні лінії, що формують кісткову, хрящову, м'язову, нервову і жирову тканину, а також сухожилля і строму, що підтримує гемопоез .

Однак в інших дослідженнях ніяких ознак рестрикції плюріпотентності генома мезенхімальних стовбурових клітин і прогеніторних популяцій стромальних клітин виявити не вдалося, хоча для перевірки можливої плюріпотентності стромальних клітин досліджувалося більше 200 клонів МСК, ізольованих з однієї первинної культури. Переважна більшість клонів in vitro зберігали здатність диференціюватися в Остеогенні, хондрогенном і адіпогенних напрямках. При виключення ймовірності міграції клітин реципієнта шляхом трансплантації мезенхімальних стовбурових клітин під капсулу нирки або в дифузійних камерах виявилося, що стромальні клітини-попередники in situ зберігають гетерогенний фенотип, що вказує або на відсутність в зоні пересадки рестрикційних факторів, або на відсутність плюріпотентності МСК як такої. У той же час допускається існування рідкісного типу соматичних плюрипотентних стовбурових клітин, які є загальними попередниками всіх стовбурових клітин дорослого організму.

Про мульти-, але не про плюріпотентності справжніх мезенхімальних стовбурових клітин, що складають дуже малу частку клітин кісткового мозку і здатних в певних умовах при культивуванні in vitro пролиферировать, не вступаючи в диференціювання, свідчить їх індуковане коммитирование в клітини кісткової, хрящової, жирової, м'язової тканини , а також в теноціти і елементи строми, що підтримують гемопоез. Як правило, тривала експозиція в культуральному середовищі з фетальної телячої сироваткою провокує вихід МСК в коммітірованние стромальні клітини-попередники, потомство яких зазнає спонтанну остаточну диференціювання. In vitro вдається досягти спрямованого формування остеобластів шляхом додавання в середовище кондиціонування дексаметазону, ß-гліцерофосфату і аскорбінової кислоти, тоді як поєднання дифференцировочного сигналів дексаметазону і інсуліну індукує утворення адипоцитів.

Встановлено, що перед виходом на етап термінальної диференціювання МСК кісткового мозку при створенні певних умов культивування спочатку диференціюються в фібробластоподібних мезенхімальні стовбурові клітини. Похідні цих клітин in vivo беруть участь у формуванні кісток, хряща, сухожиль, жирової і м'язової тканини, а також строми, що підтримує гемопоез. Багато авторів розуміють під поняттям "мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники" як власне МСК, так і коммітірованние стромальні клітини-попередники кісткового мозку і мезенхімальних тканин. Клональний аналіз мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників кістковомозкового походження показав, що трохи більше однієї третини всіх клонів диференціюється в остео, хондро- і адипоцити, тоді як клітини інших клонів володіють лише остеогенним потенціалом і формують тільки хондро- і остеоцитів. Такий клон мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників, як ВМС-9, у відповідних умовах микроокружения диференціюється в клітини з фенотипом і функціональними характеристиками не тільки остеобластів, хондроцитов і аді- поцітов, але і стромальних клітин, що підтримують гемопоез. Виділений з фетального кісткового мозку щура клон клітин RCJ3.1 диференціюється в мезенхімальні клітини різних фенотипів. При комплексній дії аскорбінової кислоти, b-гліцерофосфату і дексаметазону з клітинних елементів цього клону спочатку утворюються багатоядерні міоцити, а потім, послідовно, адипоцити, хондроцити і острівці мінералізованою кісткової тканини. Популяція гранулярних клітин з периоста плодів щура відповідає некоммітірованним мультипотентні мезенхімальних клітин-попередників, оскільки характеризується низькою швидкістю проліферації, що не експрессірует диференціювальні маркери, а в умовах культивування диференціюється з утворенням хондро-, остео і адипоцитів, а також гладких клітин.

Таким чином, слід визнати, що питання про плюрі- або мультипотентні генома мезенхімальних стовбурових клітин залишається відкритим, що, відповідно, впливає і на уявлення про дифференцировочного потенціал стромальних клітин-попередників, який також остаточно не встановлено.

Експериментально доведеною і важливою характеристикою мезенхімальних стовбурових клітин є їх здатність залишати тканинну нішу і циркулювати в загальному кровотоці. Для активації генетичної програми диференціювання такі циркулюючі стовбурові клітини повинні потрапити до відповідного микроокружение. Показано, що при систематичному введенні МСК в кровотік тваринам-реципієнтам незрілі клітини імплантуються в різні органи і тканини, диференціюючи потім в клітини крові, міоцити, адипоцити, хондроцити і фібробласти. Отже, в локальних тканинних зонах відбувається сигнально-регуляторний взаємодія між некоммітірованнимі і коммітірованних стромальних клітинами-попередниками, а також між ними і оточуючими зрілими клітинами. Передбачається, що індукція диференціювання здійснюється паракріннимі регуляторними факторами мезенхимального і немезенхімального походження (фактори росту, ейкозаноїди, молекули екстрацелюлярного матриксу), які забезпечують просторові і тимчасові зв'язку в мікрооточенні мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників. Тому локальні пошкодження мезенхімальних тканини повинні призводити до формування зон микроокружения мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників, якісно відрізняються від комплексу регуляторних сигналів інтактних тканин, в яких відбуваються процеси фізіологічної, а не репаративної регенерації. Ця різниця вкрай важливо в плані спеціалізації клітинного фенотипу в нормальному і индуцированном пошкодженням мікрооточенні.

За уявленнями, саме тут закладені механізми принципової різниці двох відомих процесів - фізіологічної регенерації і запальної проліферації. Перший з них завершується відновленням спеціалізованого клітинного складу тканини і її функції, тоді як підсумком реалізації процесу проліферації є утворення зрілих сполучнотканинних елементів і втрата функції пошкодженої тканинної зони. Таким чином, для розробки оптимальних програм застосування мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників в регенеративно-пластичної медицині необхідно ретельне дослідження особливостей впливу факторів мікрооточення на диференціювання МСК.

Залежність структури компартмента стовбурових клітин від клітинних пара- і аутокрінним регуляторів, експресія яких модулюється зовнішніми сигналами, вже ні в кого сумніву не викликає. Серед функцій регуляторних чинників найважливішими є контроль асиметричного розподілу МСК і експресія генів, що визначають стадії коммитирование і число клітинних поділів. Зовнішні сигнали, від яких залежить подальший розвиток МСК, забезпечуються їх мікрооточенням. У незрілому стані МСК досить довго пролиферируют, зберігаючи при цьому здатність до диференціювання в лінії адипоцитів, миофибробластов, строми гематогенной тканини, клітини хряща і кістки. Встановлено, що обмежена популяція циркулюючих в крові СБ34-негативних стромальних клітинних елементів із загального кровотоку повертається в строму кістково-мозкової тканини, де трансформується в лінії СD34-позитивних гемопоетичних стовбурових клітин. Ці спостереження дозволяють припустити, що рециркуляція прогеніторних мезенхімальних клітин в кровотоці забезпечує підтримку тканинного балансу стромальних стовбурових клітин в різних органах у вигляді мобілізації загального пулу незрілих стромальних елементів кісткового мозку. Диференціація МСК в клітини з множинними мезенхімальними фенотипами і їх участь в регенерації або репарації кісткової, хрящової, жирової тканини і сухожиль in vivo доведено за допомогою моделей адоптивного перенесення у експериментальних тварин. За даними інших авторів, дистантная міграція МСК по судинному руслу поєднується з короткодістантним або локальним переміщенням мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників в межах тканини при репарації хряща, регенерації м'язів і інших відновних процесах.

Локальні стовбурові резерви стромальной тканинної основи виконують роль джерела клітин в процесах фізіологічної регенерації тканини і поповнюються за рахунок дистантного транспорту МСК у міру витрачання стромально-тканинних стовбурових ресурсів. Однак в умовах необхідності екстреної мобілізації репаративного клітинного потенціалу, наприклад при політравмі, в процесах репаративної регенерації бере участь весь ешелон МСК, і на периферію через загальний кровотік рекрутуються мезенхімальні клітини-попередники кісткового мозку.

Пересадка мезенхімальних стовбурових клітин

Простежуються певні паралелі між процесами фізіологічної регенерації тканин і їх формуванням в період внутрішньоутробного розвитку. В ембріогенезі людини і ссавців утворення різноманітних типів спеціалізованих клітин відбувається з екто-, мезо- і ендодермального пулу зародкових листків, але за обов'язкової участі мезенхіми. Пухка клітинна мережу ембріональної мезенхімальних тканини виконує численні регуляторні, метаболічні, каркасні і морфогенетические функції. Закладка провізорних органів здійснюється тільки після конденсації мезенхіми за рахунок клоногенних зростання прогеніторних клітин, які генерують первинні морфогенетические сигнали органогенезу. Стромальні похідні ембріональної мезенхіми створюють клітинний каркас провізорних органів і формують основу майбутнього їх енергопластіческого забезпечення за рахунок зростання первинних кровоносних і лімфатичних судин. Іншими словами, стромальні елементи микроциркуляторной одиниці фетальних органів виникають раніше формування їх структурно-функціональних одиниць. Крім того, активна міграція мезенхімальних клітин в період органогенезу забезпечує просторову орієнтацію розвиваються органів за рахунок розмітки їх об'ємних кордонів за допомогою рестрикції гомеотіческіх Нох-тепов. На стромальном каркасі відбувається і збірка структурно-функціональних одиниць паренхіматозних органів, до складу яких нерідко входять морфогенетически і функціонально абсолютно різні клітини. Отже, в ембріогенезі функції мезенхіми первинні і реалізуються за допомогою генерації регуляторних сигналів, що активують регіональну проліферацію і диференціювання прогеніторних епітеліальних клітин. Клітини ембріональної мезенхіми виробляють такі чинники зростання, як НІГ, HGF-b, CSF, для яких на зміни паренхіми прогеніторних клітинах є відповідні рецептори. У диференційованої зрілої тканини дорослого організму стромальна мережу клітин також генерує сигнали для підтримки життєздатності і проліферації прогеніторних клітин немезенхімального походження. Однак спектр стромальних регуляторних сигналів в постнатальному онтогенезі інший (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF і ін.) і спрямований на забезпечення фізіологічної регенерації або репарації пошкоджених тканинних зон. Причому спектральні характеристики стромальних регуляторних факторів в кожному виді тканини і навіть в межах одного органу різні. Зокрема, кровотворення і лімфопоез з розмноженням і дифференцировкой гемопоетичних і імунокомпетентних клітин відбувається тільки в певних органах, в межах яких діє стромальних мікрооточення, що забезпечує умови для дозрівання кровотворних і лімфоїдних клітин. Саме від регуляторних факторів мікрооточення залежить здатність кровотворних і лімфоїдних клітин репопуліровать даний орган, пролиферировать і дозрівати в його мікроструктурних нішах.

Серед компонентів екстрацелюлярного матриксу, які продукують мультипотентні мезенхімальні клітини-попередники, слід зазначити фибронектин, ламінін, колаген і протеоглікани, а також CD44 (рецептор гіалуронана і остеопонтіна), які беруть основну участь в організації міжклітинної взаємодії та формуванні позаклітинного матриксу в кістковому мозку і кісткової тканини . Доведено, що кістковомозкові мультипотентні мезенхімальні клітини-редшественнікі створюють стромальних мікрооточення, що забезпечує індуктивними і регуляторними сигналами не тільки МСК, але і гемопоетичні попередники і інші немезенхімальние стовбурові клітини кісткового мозку. Відомо, що участь МСК у кровотворенні визначається їх здатністю диференціюватися в стромальні клітини, підтримують гемопоез, причому даний інструктивний сигнал МСК отримують безпосередньо від гемопоетичних стовбурових клітин. Саме тому в культурі мережу стромальних прогеніторних клітин служить фідерної основою для розвитку всіх клонів гемопоетичних клітин.

У зрілому організмі інтенсивність гемо- та лімфопоезу перебуває в стані динамічної рівноваги з "витрачанням" зрілих клітин крові і клітин імунної системи на периферії. Оскільки стромальні клітини кісткового мозку і лімфоїдних органів оновлюються вкрай рідко, значної перебудови стромальних структур в них не відбувається. Вивести систему з динамічної рівноваги можна за допомогою механічного пошкодження будь-якого з органів гемо- або лімфопоезу, що призводить до однотипних послідовних змін, які стосуються не тільки і не стільки кровотворних або лімфоїдних елементів, скільки стромальних структур пошкодженого органу. В процесі репаративної регенерації в першу чергу формується стромальна основа, яка потім репопуліруется кровотворними або імунокомпетентними клітинами. Цей давно відомий факт робить посттравматичних регенерацію зручною моделлю для вивчення стромального мікрооточення кровотворних органів. Зокрема, для дослідження репаративної регенерації кісткового мозку використовується механічне спустошення медуллярной порожнини трубчастих кісток - кюретаж, що дозволяє швидко і ефективно вивести кровотворну тканину зі стану динамічної рівноваги. При вивченні процесів репаративної регенерації кроветворного і стромального компонентів кісткового мозку після механічного спустошення медуллярной порожнини великогомілкової кістки морських свинок встановлено, що між показниками регенерації кровотворних і стромальних клітин (чисельність кровотворних клітин, концентрація і кількість стромальних клітин-попередників) немає прямої кореляції. Крім того, виявилося, що збільшення популяції стромальних клітин-попередників відбувається в більш ранні терміни після кюретажу, а самі стромальні фібробласти стають фосфатазоположітельнимі, що характерно для остеогенной тканини. Встановлено також, що кюретаж 3-5 трубчастих кісток призводить до зростання цієї популяції клітин в кістковому мозку неоперованих кісток і навіть в селезінці, яка у морських свинок є виключно лімфопоетіческім органом.

Морфологічна картина репаративних процесів в кістковому мозку кюретірованних великогомілкової кісток морських свинок в цілому відповідає описаним в літературі даними, отриманим в ході експериментів на тварин інших видів, причому динаміка змін, що відбуваються після видалення кровотворної тканини, однакова для всіх видів тварин і відмінність стосується лише тимчасових параметрів . Морфологічно фазовий порядок відновлення кровотворення в спустошеній медуллярной порожнини полягає в послідовних процесах організації кров'яного згустку, утворення грубоволокнистой кісткової тканини, її розробці, розвитку синусоидов і формування ретикулярної строми, яка в подальшому репопуліруется кровотворними елементами. При цьому кількість прогеніторних кровотворних клітин в процесі регенерації кістково-мозкової тканини збільшується паралельно підвищенню вмісту стовбурових гемопоетичних клітин.

Ю. Герасимов і співавтори (2001) порівняли зміни числа кровотворних клітин і кількості стромальних клітин-попередників в окремі фази регенераційної процесу. Виявилося, що кількісні зміни кістковомозкових клітин в кюретірованной кістки відповідає динаміці морфологічних характеристик регенерації. Зниження протягом перших трьох діб кліткового утримання в регенераті автори пов'язують із загибеллю кровотворних клітин внаслідок несприятливого впливу мікрооточення, яке створює розростається ретикулярна тканина в збереженому кістковому мозку в області епіфіза, а також з утворенням в останньому вогнищ остеоидной тканини і пошкодженням судин при кюретажі. На 7-12-е добу підвищення рівня ядеросодержащіх клітин збігається з появою окремих вогнищ миелоидного кровотворення в зонах проліферації стромальних елементів. На 20-ту добу виникають значні ділянки регенерувати кісткового мозку і добре розвинені синуси, що супроводжується значним збільшенням загального числа клітин. Однак кількість гемопоетичних елементів в цей період становить 68% від контрольного рівня. Це узгоджується з раніше опублікованими даними про те, що число кровотворних клітин після кюретажу досягає норми лише на 35-40-у добу після операції.

У ранньому посттравматичному періоді основним джерелом для відновлення гемопоезу служать локальні, що збереглися при кюретажі клітинні елементи. У більш пізні терміни основним джерелом регенерації кістково кровотворної тканини є стовбурові клітини, репопулірующіе вільні стромальні зони. Що стосується окремих категорій стромальних клітин (ендотеліальних, ретикулярних і остеогенних), то джерела, що забезпечують їх утворення при перебудові кістковомозковою порожнини, залишаються нез'ясованими. Результати дослідження Ю.В. Герасимова і співавторів (2001) свідчать про те, що в збереженому після кюретажу кістковому мозку концентрація клітин, що утворюють колонії фібробластів, істотно вище, ніж в нормальному кістковому мозку. Автори вважають, що при кюретажі відбувається більш інтенсивне селективне вимивання кровотворних клітин в порівнянні з колонієутворюючих стромальних клітинами, які беруть участь у формуванні строми і більш міцно пов'язані з її основною речовиною, ніж кровотворні клітини.

Динаміка зміни чисельності клітин, що утворюють колонії фібробластів, корелює з інтенсивністю процесів остеогенезу, подальшої резорбції кісткових трабекул і формування ретикулярної строми, яка заселяться кровотворними клітинами. Велика частина стромальних клітин-попередників в зазначені терміни регенерації утворює грубоволокнисту кісткову тканину і ретикулярну строму. При переломах стегнових кісток в умовах пролонгованої остеосинтезу на 5-ту добу в зоні регенерації збільшується концентрація і чисельність клітин, що утворюють колонії фібробластів, а в період інтенсивного костеобразования їх кількість підвищується в 6 разів. Відомо, що кістковомозкові клітини, що утворюють колонії фібробластів, мають остеогенними властивостями. Кількість стромальних клітин-попередників збільшується перед заселенням території кюретірованного кісткового мозку кровотворними клітинами. Це добре узгоджується з даними про те, що стромальні клітини забезпечують утворення гемопоетичного мікрооточення. Очевидно, створення кроветворного микроокружения відповідає певному рівню регенерації стромальной тканини, а чисельність кровотворних клітин зростає при розширенні стромального плацдарму, придатного для кровотворення.

Найбільший інтерес представляють дані авторів про те, що відразу після кюретажу збільшується кількість стромальних клітин-попередників у віддалених частинах скелета. Починаючи з шостої години і по двадцяті добу включно в контрлатеральной великогомілкової кістки спостерігається більш ніж дворазове підвищення як концентрації, так і чисельності клітин, що утворюють колонії фібробластів. Механізм цього явища пов'язаний, ймовірно, з тим, що масивна травма кісткового мозку призводить до утворення великої кількості кров'яних згустків з одночасним руйнуванням значної кількості тромбоцитів і вивільненням в кров тромбоцитарного фактора росту (РБСК), який, як відомо, викликає проліферацію клітин, що утворюють колонії фібробластів, що знаходяться в організмі поза проліферативного пулу. В експериментах на кроликах локальне введення МСК сприяє відновленню хрящової тканини хірургічно пошкодженого колінного суглоба, що можна пов'язати з утворенням хондроцитов, що походять з введених МСК. Однак репаративная регенерація кісткових дефектів у лабораторних щурів значно посилюється і при використанні мезенхімальних стовбурових клітин, укладених в керамічний каркас. Отже, можна припустити, що якщо не РБОК, то який-небудь інший фактор, що відбувається з пошкоджених стромальних клітин, надає дистантное стимулюючий вплив на проліферацію мезенхімальних клітин-попередників в інтактних зонах кісткового мозку і стимулює їх міграцію в область дефекту кістково-мозкової тканини. У свою чергу, цьому суперечать дані літератури минулих років, які вказують на те, що стромальні клітини, відповідальні за микроокружение, на відміну від кровотворних клітин, не здатні до міграції і відбуваються з локальних джерел.

Проте, результати дослідження Ю. Герасимова і співавторів (2001) свідчать про те, що нанесення механічної травми викликає не тільки різку перебудову стромальной тканини в кюретірованной кістки, а й суттєві зміни строми у віддалених інтактних кістках, тобто, має місце системний відповідь стромальной тканини на локальну травму. Причому при нанесенні політравми - множині кюретажі - ця реакція посилюється і спостерігається не тільки в оперованої кістки і віддалених частинах скелета, але і в лімфоїдних органах, зокрема в селезінці. Механізм такого системного відповіді стромальной тканини кісткового мозку і селезінки на локальну травму і політравму залишається невідомим. Допускається, що цей процес пов'язаний з дією гуморального фактора, що виділяється мезенхимальной стромой медуллярной порожнини кісткового мозку. Про можливість вироблення стромальних клітинами кісткового мозку і селезінки органонеспеціфіческого гуморального фактора, відповідального за проліферацію клітин, що утворюють колонії фібробластів, свідчать дані про їх колониестимулирующих активності в моношарових культурах кісткового мозку.

У зв'язку з цим варто зазначити, що при системному введенні мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників їх похідні репопуліруют не тільки кістковий мозок, а й інші тканини, що використовується, зокрема, для генотерапіі. Показано, що при внутрішньовенному введенні великих кількостей МСК з геномом дикого типу мишам з мутацією гена колагену I донорські клітини заміщають до 30% клітин в кістковій і хрящовій тканині реципієнтів, а трансфекованих мезенхімальні стовбурові клітини миші, секретуючі IL-3 людини, протягом 9 місяців ефективно підтримують гемопоез в разі їх одночасного введення з гемопоетичними стовбуровими клітинами людини імунодефіцитних мишам.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Генетична модифікація мезенхімальних стовбурових клітин

Серед успіхів експериментальної генетичної модифікації МСК слід зазначити трансфекцію гена фактора IX в МСК людини з подальшим перенесенням клітин-трансфектантов імунодефіцитних мишам, що призводить до появи в крові антигемофильного фактора В протягом 8 тижнів після трансплантації. В даному експерименті в трансфікованих клітинах здійснювалася Посттрансляційна модифікація фактора IX у-глутамілкарбоксілазой. Трансдукція МСК ретровірусних вектором, що кодує фактор IX людини, виявилася менш успішною - подальше введення цих клітин собаці з гемофілією В забезпечувало терапевтичний рівень фактора IX, що підтримує нормальну інтенсивність коагуляційного гемостазу, всього лише протягом 12 днів.

Пересадки мезенхімальних стовбурових клітин в паренхіму мозку тварин показали, що донорські незрілі клітини трансформуються як в популяції нейронів, так і глії. Приживлення нейрональних похідних здорової донорської мезенхімальних тканини теоретично уможливлює корекцію генетичних аномалій метаболізму мозку у пацієнтів з хворобою Гоше і іншими порушеннями обміну ліпідів, ганглиозидов або вуглеводів.

Триває експериментальний пошук умов трансдіфференціровка стовбурових клітин строми кісткового мозку в клітини-попередники нервової і печінкової тканини. Увага дослідників зосереджена на комбінаціях індукторів диференціювання і спеціальних кондиційних середовищах. Зокрема, для виділення первинної культури стромальних клітин відмиті і ресуспендувати в культуральному середовищі DMEM / F12 (1/1) з 10% фетальної телячої сироватки клітини кісткового мозку висіваються з щільністю 200 000 / см2. Через 24 години неадгезівності клітини видаляються, а прикріплені до пластику фібробластоподібних клітини культивуються протягом одного тижня. Для диференціювання клітин строми кісткового мозку в нейробласти використовується кондиційна среда, отримана шляхом трьохдобового культивування первинної культури ембріональних фібробластів миші, а також середовище DМЕМ / F12 (1/1) з 2% фетальної телячої сироватки і додаванням 20 нг / мл ир або 10-6м ретиноєвої кислоти (нейроіндуктори, які застосовуються для нейральной диференціювання ембріональних стовбурових клітин миші і людини). Диференціювання клітин строми кісткового мозку в клітини-попередники гепатоцитів індукують в кондиційної середовищі, створеної в результаті трьохдобового культивування первинної культури ембріональних клітин печінки миші в середовищі DМЕМ / F12 (1/1) з додаванням 10% фетальної телячої сироватки.

Тут слід ще раз зазначити, що колониеобразующие клітини строми кісткового мозку гетероморфними і можуть бути розділені на два типи. До першого типу відносяться фібробластоподібних, що утворюють філоподіі клітини з великими ядрами і одним-двома ядерця. Другий тип представлений дрібними клітинами веретеноподібної форми. При культивуванні клітин обох типів в кондиційної середовищі, отриманої на фидерном шарі первинних ембріональних фібробластів миші, на З-й-4-ту добу в культурі з'являються клітини, схожі на нейробласти. На цій стадії вони найчастіше мають веретеноподібну форму з одним або двома довгими відростками, що закінчуються філоподіямі. Рідше зустрічаються пірамідні або зірчасті клітини з короткими дендритами. Дендрити одних нейробластов мають характерні розширення (нирки зростання) і розгалуження в своїй дистальної частини, інших - виразні конуси росту з філоподіямі, за допомогою яких відбувається ріст дендритів. Аналогічні морфологічні ознаки (нирки і конуси росту з філоподіямі), властиві Нейробласти, дифференцирующимся в нейрони, докладно описані в роботах по нейрогенезу. На цій підставі деякі автори роблять висновок, що виявляються ними в культурі клітини є Нейробласти. Зокрема, Е. Щегел'ская і співавтори (2002) після культивування первинної культури стромальних клітин протягом двох тижнів в замінної на кожні З-й-4-ту добу кондиційної середовищі встановили, що частина клітин проліферують, зберігаючи недиференційований стан. Зовні такі клітини були схожі на фібробласти і виявлялися в культурі поряд з диференціюється Нейробласти. Більша ж частина клітин (близько 80%) перебувала на різних стадіях диференціювання в клітини нервової тканини, переважно в нейрони. Дендритні відростки цих клітин тісно контактували між собою, так що поступово клітини формували на субстраті ділянки нервової мережі у вигляді довгих багатоклітинних тяжів. Дендритні відростки нейробластов ставали значно довша, деякі з них в 8-10 разів перевищували довжину тіла самого нейрона. Поступово збільшувалася частка пірамідних і зірчастих клітин. Дендрити зірчастих клітин розгалужувалися. На думку авторів, пізніша диференціювання пірамідних і зірчастих клітин в порівнянні з веретеноподібними відповідає послідовності етапів нормального нейрогенезу у тварин. В результаті автори роблять висновок, що стовбурові клітини строми кісткового мозку піддаються индуцированному нейрогенезу, в процесі якого in vitro з нейробластов утворюються всі три основних типи нейронів. Попередники нервових клітин були виявлені і під час культивування клітин строми кісткового мозку протягом 3-4 діб в середовищі з 2% фетальної сироваткою і 20 нг / мл LIF. Але в цьому випадку стовбурові клітини ділилися дуже повільно, диференціювання нейробластов відбувалася тільки в 30% випадків і вони не утворювали нейрональні мережі. Використовуючи в якості одного з індукторів диференціювання нервових клітин ретиноевую кислоту, автори отримали в культурі до 25-30% нервових клітин з переважанням гліальних елементів - астроцитів і олигодендроцитов. Нейрони становили лише третю частину від всіх нервових клітин, хоча і були представлені всіма трьома типами: веретеноподібними, пірамідними і зірчастими клітинами. На 6-ту добу культивування клітин строми в середовищі з ретиноєвої кислотою нервові клітини ставали більш диференційованими, а у окремих пірамідних нейронів були виявлені аксони, які і в нормальному нейроонтогенезе з'являються пізніше утворення дендритних відростків. На думку авторів, не дивлячись на низький вихід нервових клітин, метод індукції ретиноєвої кислотою має свої переваги: олігодендроціти і астроцити виконують міелінізірующую і живить функції під час росту дендритів і аксонів і необхідні для нормального формування нервової тканини. Отже, для репарації її пошкоджених ділянок in vivo краще використовувати суспензію нейронів, збагачену клітинами глії.

У другій серії дослідів автори спробували індукувати диференціювання клітин строми кісткового мозку в клітини печінки. Після трьохдобового культивування кістковомозкових стромальних стовбурових клітин в кондиційної середовищі, отриманої при інкубації ембріональних гепатоцитів миші, були виявлені великі, кулястої форми клітини, часто двохядерні, з цитоплазматичними включеннями різного розміру. Ці клітини перебували на різних стадіях диференціювання і різнилися між собою за розміром, кількістю ядер і включень в цитоплазмі. У більшості таких клітин було виявлено глікоген, на підставі чого автори ідентифікували їх як клітини-попередники гепатоцитів. Оскільки в культурі не були виявлені клітини, схожі на нейробласти, пішов висновок, що в кондиційної середовищі, отриманої в результаті культивування ембріональних гепатоцитів, відсутні чинники диференціювання нервових клітин і, навпаки, присутні фактори, що індукують диференціювання клітин строми кісткового мозку в клітини-попередники гепатоцитів . На закінчення автори припускають наявність плюріпотентності у клітин строми кісткового мозку, оскільки вони диференціюються in vitro в клітини нервової або печінкової тканини в залежності від використовуваних специфічних кондиційних середовищ і індукторів.

У деяких роботах дійсно коректно показана диференціювання клітин строми кісткового мозку в кардіоміоцити, клітини хрящової, кісткової і нервової тканини. З'являються відомості про те, що серед клітин кісткового мозку є популяції стовбурових клітин, здатних диференціюватися в гепатоцити. У світлі цих даних результати представлених вище експериментів на мишах все ж можна вважати ще одним підтвердженням наявності в кістковому мозку плюрипотентних мезенхімальних стовбурових клітин, що володіють здатністю диференціюватися в клітини різних тканин дорослого організму.

Трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин

У клінічній трансплантології мезенхімальні стовбурові клітини людини можуть бути використані для забезпечення експансії гемопоетичних стовбурових клітин, а також їх ранніх прекоммітірованних нащадків. Зокрема, введення аутологічних гемопоетичних стовбурових клітин і МСК онкологічним хворим після проведення високодозової хіміотерапії прискорює відновлення кількості нейтрофілів і тромбоцитів у периферичній крові. Алло-і аутогенні пересадки мезенхімальних стовбурових клітин застосовуються для лікування множинної мієломи, апластичної анемії і спонтанної тромбоцитопенії - захворювань, пов'язаних з первинним дефектом строми кровотворної тканини. Ефективність клітинної терапії при онкогематологічної патології у багатьох випадках вище при одночасному введенні стромальних і гемопоетичних стовбурових клітин, що проявляється скороченням післяопераційного періоду відновлення кровотворення, зниженням числа летальних випадків внаслідок неселективного руйнування регіонарних і циркулюючих ракових клітин, при якому гинуть і власні прогеніторні кровотворні клітини хворого. Перспективність застосування МСК і інших мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників в клінічній практиці обумовлена відносною легкістю отримання їх з аспиратов кісткового мозку, експансії в культурі і трансфекції терапевтичних генів. При цьому для заповнення місцевих тканинних дефектів можна використовувати локальну імплантацію мультіпотентних мезенхімальних клітин-попередників, а при системних дисфункциях тканин мезенхімального походження не виключається їх введення в загальний кровотік.

Більш обережні в своїх міркуваннях автори робіт, в яких перспективи застосування МСК для локальної, системної трансплантації і генної терапії аналізуються з точки зору біології стромальних клітин. Постнатальний кістковий мозок традиційно розглядається як орган, що складається з двох основних систем чітко виражених клітинних ліній - власне гемопоетичних тканини і асоційованої з нею підтримуючої строми. Тому мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку спочатку розцінювали виключно як джерело стромальной основи для продукції регуляторних факторів гемопоетичних мікросередовища. Потім увагу дослідників переключилася на вивчення ролі МСК як стволового джерела скелетних тканин. Новітні дані вказують на несподіваний потенціал диференціації стромальних клітин кісткового мозку з утворенням нейральной або м'язової тканини. Іншими словами, мезенхімальні стовбурові клітини виявляють трансгермальную пластичність - здатність диференціюватися в клітинні типи, фенотипически не зв'язані з клітинами початкової тканини. При цьому деякі аспекти біології стромальних клітин кісткового мозку залишаються неясними і невирішеними як в біологічному плані, так і в окремих деталях, що включають ідентифікацію, природу, походження, розвиток і функцію in vivo стромальних клітин кісткового мозку, а також допустимий потенціал диференціації ex vivo і можливості терапевтичного застосування in vivo. Отримані дані про потенційні можливості МСК, як і результати досліджень регенераторного потенціалу інших стовбурових клітин, вступають в різке протиріччя з установленими в біології догмами.

При культивуванні в умовах низької щільності стовбурові стромальні клітини кісткового мозку утворюють чіткі колонії, кожна з яких є похідною однієї клітини-попередника. Відсоток стромальних клітин-попередників в ядерні клітини кісткового мозку, певний за здатністю утворювати колонії, в значній мірі залежить як від умов культивування, так і від видової приналежності МСК. Наприклад, у гризунів для отримання максимальної кількості стромальних клітин-попередників абсолютно необхідна наявність в культурі опромінених фідерних клітин кісткового мозку і сироватки, тоді як у людини колонієутворюючих ефективність мезенхімальних стовбурових клітин не залежить ні від фідера, ні від живильного середовища. Кількість відомих мітогенних чинників, стимулюючих проліферацію стромальних клітин-попередників, обмежена. До таких належать PDGF, EGF, FGF, TGF-b, а також IGF1. За оптимальних умов культивування поліклональні лінії МСК витримують in vitro більш 50 клітинних поділів, що дає можливість отримати мільярди стромальних клітин кісткового мозку з 1 мл його аспирата.

Однак популяція стромальних клітин кісткового мозку гетерогенна, що проявляється як варіабельністю розмірів колоній, різною швидкістю їх утворення, так і різноманітністю клітинної морфології, яка охоплює діапазон від фібробластоподібних веретеноподібних до великих плоских клітин. При розвитку таких культур через 20 діб відзначається і фенотипическая гетерогенність. Частина колоній відрізняється високою експресією лужноїфосфатази, інші взагалі її не експресують, а колонії третього типу є фосфатазопозітівнимі в центральному регіоні і фосфатазонегатівнимі на периферії. Окремі колонії формують вузлики кісткової тканини (початок матричної мінералізації маркується при фарбуванні алізариновим червоним або на кальцій по Ван-Косса). В інших колоніях відбувається акумуляція жиру, що ідентифікується по G-фарбування масляним червоним. Рідше колонії мезенхімальних стовбурових клітин утворюють хрящі, забарвлюються альціаном блакитним).

Після ектопічної трансплантації експериментальним тваринам поліклональні лінії MGK утворюють ектопічну кістка з сетчатообразной стромой, асоційованої з мієлопоез і адипоцитами, а також, але рідше, з хрящової тканиною. При трансплантації моноклональних ліній стромальних клітин кісткового мозку в деяких випадках спостерігається хімерізм, при якому утворилася de novo кістка складається з клітин кісткової тканини, містить строму і адипоцити донорського походження, тоді як клітини гемопоетичної лінії і система судин відбуваються від реципієнта.

Результати цих досліджень підтверджують стволовую природу стромальной клітини-попередника кісткового мозку, від якої була отримана клональная лінія. Вони ж одночасно свідчать про те, що не всі клоногенних в культурі клітини дійсно є мультипотентними стовбуровими клітинами. Деякі дослідники вважають, і ми поділяємо їхню думку, що найбільш достовірну інформацію про реальний потенціал диференціації індивідуальних клонів можна отримати тільки in vivo після трансплантації, а не шляхом визначення фенотипу їх похідних in vitro. Експресія в культурі фенотипических маркерів остео, хондро- або адіпогенеза (визначається за мРНК або за допомогою гистохимической техніки) і навіть виробництво мінералізованої матриці не відображає ступінь плюріпотентності окремого клону in vivo. Тому ідентифікація стовбурових клітин в групі стромальних клітин можлива тільки а posteriori, у відповідних умовах біологічної трансплантаційної проби. Зокрема, хондрогенез дуже рідко спостерігається у відкритих трансплантаційних системах, тоді як утворення хряща далеко не рідкість в системах закритих, таких як дифузійні камери або в мікромассних культурах стромальних клітин in vitro, де досягається локальне низька напруга кисню, що сприяє формуванню хрящової тканини. Отже, навіть техніка трансплантації, а також неспецифічні умови культивування in vitro суттєво впливають на діапазон диференціювання МСК.

Експериментальна трансплантація з дотриманням заданих умов експерименту - золотий стандарт визначення потенціалу диференціювання стромальних клітин кісткового мозку і ключовий елемент власне їх ідентифікації. Історично дослідження з пересадки стромальних клітин кісткового мозку пов'язані із загальною проблемою трансплантації кісткового мозку. При цьому встановлено, що гемопоетичний микроокружение створюється за допомогою трансплантації ліній стромальних клітин кісткового мозку і забезпечує ектопічне розвиток гемопоетичних тканини в зоні трансплантації. Походження мікросередовища від донора, а гемопоетичних тканини - від господаря дозволяє розглядати ектопічну кістка як справжню "інвертовану" трансплантацію кісткового мозку. Локальна трансплантація стромальних клітин кісткового мозку сприяє ефективній корекції кісткових дефектів, більш вираженою, ніж при спонтанної репаративної регенерації. У кількох доклінічних дослідженнях на експериментальних моделях переконливо доведена можливість застосування трансплантатів стромальних клітин кісткового мозку в ортопедії, хоча для оптимізації цих методик, навіть в найпростіших випадках, необхідна сама ретельна робота і аналіз. Зокрема, оптимальні умови експансії остеогенних стромальних клітин ex vivo ще не встановлені, чи не відпрацьованими залишаються структура і склад ідеального носія, а також кількість клітин, необхідних для об'ємної регенерації кістки.

Крім застосування розмножених ex vivo стромальних клітин кісткового мозку з метою регенерації тканин мезенхімального походження неортодоксальна пластичність МСК відкриває потенційні можливості їх використання для регенерації нейтральні клітин або доставки генних продуктів в ЦНС. В принципі, це спрощує клітинну терапію при ураженні нервової системи, оскільки відпадає необхідність отримання аутогенних нейтральні стовбурових клітин людини. Повідомляється про можливості використання клітин кісткового мозку для генерації кардіоміоцитів і міогенних клітин-попередників як істинно стромального, так внестромального походження.

Проводяться експерименти з системної трансплантації стромальних клітин кісткового мозку для лікування загальних захворювань скелета. Немає сумнівів, що стромальні клітини кісткового мозку є популяцію, що відповідає за генетичні порушення при захворюваннях скелета, що добре ілюструється векторних перенесенням за допомогою цих клітин генетичної інформації, яка призводить до утворення патологічної кісткової тканини у експериментальних тварин. Однак здатність стромальних клітин імплантуватися, приживлятися, розмножуватися і диференціюватися в кістках скелета після введення в загальний кровотік до сих пір не доведена.

Почасти це пов'язано з тим, що в стандартній процедурі пересадки кісткового мозку строма НЕ трансплантують разом з гемопоетичних тканиною, тому суворі критерії оцінки успішного приживлення системно вводяться стромальних клітин ще тільки належить розробити. При цьому слід пам'ятати, що наявність маркерних генів в тканинних екстрактах або виділення в культурі клітин донорського походження свідчить не про приживлення клітин, а лише про їх виживання. Навіть внутрішньоартеріальне введення стромальних клітин кісткового мозку в кінцівку миші може привести до фактично нульового результату приживлення, незважаючи на те що клітини донорського походження виявляються у великій кількості всередині мікросудинної мережі кісткового мозку. На жаль, такі клітини зазвичай описуються як "приживлення" всього лише на підставі результатів визначення маркерних донорських генів в умовах культури ex vivo. Крім того, необхідно надавати переконливі докази тривалої інтеграції в досліджуваних тканинах диференційованих і функціонально активних клітин донорського походження. У багатьох опублікованих роботах, де повідомляється про приживлення стромальних клітин кісткового мозку в скелеті, кидається в очі саме відсутність чітких даних такого роду. Проте, треба зазначити, що в деяких коректних експериментах на тваринах дійсно встановлено хоч і обмежене, але реальне приживлення стромальних клітин-попередників після їх системного введення.

Ці дані узгоджуються з результатами вивчення можливості доставки міогенних клітин-попередників кісткового мозку в м'язи через сосудргстую систему. Однак не слід забувати, що і скелетна, і м'язова тканина утворюється в ході розвитку і зростання на основі Екстраваскулярний переміщень клітин, які використовують міграційні процеси, які не передбачають циркуляцію в крові. Якщо і справді існує незалежний циркуляторний шлях для доставки клітин-предшествённршов в солідні фазові тканини, то чи можна допустити і існування фізіологічно циркулюючих мезенхімальних клітин-попередників? Яке походження цих клітин як у не зовсім розвиненому, так і в постнатальному організмі, і як вони проникають через судинну стінку? Вирішення цих питань вбачається абсолютно необхідним і вимагає самого ретельного доклінічного аналізу. Навіть після того як будуть знайдені відповіді на ці питання, невирішеними залишаться проблемні кінетичні аспекти, пов'язані зі структурним зростанням і ремоделированием сполучної тканини. У той же час лікування порушень остеогенезу за допомогою заміни всієї популяції мутованих скелетних клітин-попередників на здорові стромальні елементи представляється реальної клінічної перспективою. При цьому локальні зони перелому або деформації внаслідок патологічного остеогенезу, а також деструктивні зміни кісткової тканини можна буде коригувати за допомогою культивованих in vitro стромальних стовбурових клітин. Отже, напрямок майбутніх досліджень доцільно сфокусувати на проблемах перетворення або генетичної корекції аутологічних мутованих остеогенних клітин-попередників ex vivo.

Генна інженерія клітин, короткочасна або постійна, стала основою клітинної та молекулярної біології, джерелом багатьох наукових відкриттів, що стосуються ролі окремих білків в клітинному обміні речовин in vitro і in vivo. Застосування молекулярних технологій з метою корекції спадкової патології і захворювань людини дуже перспективно для практичної медицини, оскільки властивості стромальних стовбурових клітин кісткового мозку дають можливість розробки унікальних схем трансплантації для корекції генетичних захворювань скелета. При цьому мезенхімальні клітини попередники досить легко можна отримати від майбутнього реципієнта, вони піддаються генетичному маніпулюванню і здатні розмножуватися у великих кількостях за короткий період часу. Використання мезенхімальних стовбурових клітин дозволяє уникнути обмежень і ризику, пов'язаних з доставкою генетичного інформаційного матеріалу безпосередньо до пацієнта через вртрусние векторні конструкції. Подібна стратегія може бути застосована pi до ембріональних стовбурових клітин, однак аутогенні постнатальні стромальні клітини кісткового мозку - більш кращий матеріал, оскільки їх введення виключає можливі імунологічні посттрансплантаційного ускладнення. Для досягнення короткочасного ефекту, наприклад з метою прискорення регенерації кісток, найбільш оптимальним методом є генетична модифікація мезенхімальних стовбурових клітин за допомогою електропорацрш, хімічного злиття, ліпофекціі, плазмід і аденовірусних конструкцій. Зокрема, вірусна трансфекція в стромальні клітини кісткового мозку ВМР-2 виявилася ефективною в плані прискорення регенерації кісток при експериментальній політравмі. Створення аденовірусних векторних конструкцій краще через відсутність токсичності. Однак генетична модифікація стромальних клітин кісткового мозку в цьому випадку відрізняється вкрай низькою стабільністю. Крім того, нормальні трансформовані стромальні клітини кісткового мозку вимагають застосування векторних носіїв генетичної інформації в 10 разів більше инфективности, ніж інші клітинні типи, що значно збільшує відсоток загибелі трансфіціруемих клітин.

Для лікування рецесивних захворювань, обумовлених низькою або нульовою біологічною активністю певних генів, необхідна тривала або перманентна модифікація мезенхімальних стовбурових клітин, що вимагає використання адено- асоційованих вірусів, ретровірусів, лентивирусов або адено- ретровірусних химер. Транспортні ділянки цих вірусів здатні переносити великі трансфекти ДНК (до 8 кб). У науковій літературі вже з'явилися відомості про екзогенної біологічної активності стромальних клітин кісткового мозку, трансфікованих ретровірусними конструкціями, що кодують синтез регуляторних і маркерних молекул - IL-3, CD2, фактора VIII, а також ферментів, які беруть участь в синтезі L-DOPA. Але і в цих роботах автори вказують на ряд обмежень, які необхідно подолати до початку практичного застосування даної технології. Перша проблема полягає в оптимізації процесу модифікації MCK ex vivo. Відомо, що тривала (3-4 тижні) проліферація стромальних клітин кісткового мозку in vitro знижує їх трансфіціруемость. У той же час для досягнення високого рівня генетичної модифікації МСК необхідне проведення декількох циклів трансфіціровадія. Друга проблема пов'язана з тривалістю експресії терапевтичного гена, яка поки що не перевищує чотирьох місяців. Закономірне зниження ефективної генної експресії обумовлено інактивацією промоторів і загибеллю модифікованих клітин. При загальній перспективності перенесення генетичної інформації за допомогою мезенхімальних стовбурових клітин результати попередніх досліджень свідчать про необхідність подальшої оптимізації методів трансфекції ex vivo, вибору адекватного промотора, що регулює біологічну активність в потрібному напрямку, і підвищення здатності модифікованих стромальних клітин кісткового мозку до самопідтримки in vivo після трансплантації. Слід зазначити, що використання ретровірусних конструкцій для модифікації стромальних клітин кісткового мозку в потрібному напрямку не завжди вимагає їх обов'язкового приживлення. Трансфіковані мезенхімальні стовбурові клітини можуть виконувати коригуючу функцію на тлі стабільної резидентності і без обов'язкового активного фізичного інкорпорування та функціонування в сполучної тканини. В цьому випадку їх слід розглядати як біологічний міні-насос, який продукує in vivo фактор, дефіцит якого визначає маніфестацію генетичної патології.

Використання перетворених стромальних клітин кісткового мозку для лікування домінантною генетичної патології, яка характеризується експресією гена з патологічною або ненормальною біологічною активністю, є набагато більш проблематичним, оскільки в цьому випадку необхідно блокувати передачу або реалізацію спотвореної генетичної інформації. Один з методів генної інженерії - гомологичное рекомбинирования ембріональних стовбурових клітин з метою створення трансгенних тварин. Однак вкрай низький ступінь гомологичного рекомбинирования в поєднанні з проблемами ідентифікації, сепарації і експансії таких рекомбинантов навряд чи буде сприяти широкому застосуванню даного методу в найближчому майбутньому, навіть за умови розробки нових технологічних прийомів. Другий підхід в генній терапії домінантною патології заснований на автоматичній корекції пошкодженої ДНК, оскільки генетичні мутації можуть коригуватися шляхом введення екзогенної ДНК з потрібною послідовністю (короткі ДНК-олігонуклеотиди або химерні РНК / ДНК-олігонуклеотиди), яка зв'язується з гомологами в пошкодженому геномі. Третій варіант передбачає блокування передачі патологічної інформації, що досягається за рахунок використання специфічно сконструйованих олігонуклеотидів, що зв'язуються з певним геном для формування троичной спіральної структури, яка виключає можливість транскрипції.

Незважаючи на те що корекція генетичного захворювання на рівні генома залишається найбільш оптимальним і бажаним терапевтичним методом, мРНК також є перспективним вектором (можливо навіть більш доступним) для блокування домінантного негативного гена. З метою пригнічення трансляції та / або підвищення деградації мРНК вже давно використовуються білкові молекули з антісенсовимі олігонуклеотидних або повними послідовностями, що блокують зв'язування мРНК з биосинтетическим апаратом клітини. Крім того, двуцепочечной РНК індукує стрімку деградацію мРНК, механізм якої залишається до кінця не з'ясованим. Однак малоймовірно, що одне лише усунення мРНК, транскрибоване з мутантного аллеля з короткими або одиничними мутаціями, сприятиме експресії мРНК нормального алеля. Альтернативу представляє використання рібозінов hammerhead і hairpin, що володіють здатністю зв'язуватися з високоспецифічними ділянками мРНК з подальшою індукцією їх розщеплення і інактивації в процесі трансляції. В даний час вивчається можливість застосування даного методу в терапії патологічного остеогенезу. Незалежно від того що саме є мішенню - геномні або цитоплазматичні елементи, успіх нових технологій генної терапії буде визначатися ефективністю включення реагентів в стромальні клітини кісткового мозку ех vivo, оптимального вибору специфічного вектора і стабільної здатності мезенхімальних стовбурових клітин експресувати потрібні фактори in vivo.

Таким чином, відкриття мезенхімальних стовбурових клітин з їх несподіваними властивостями створює нову концептуальну схему розвитку клітинних ліній. Однак для розуміння біологічної ролі стромальних стовбурових клітин, їх природи, здатності до трансдіфференціровка або дедіфференціровка, їх фізіологічного значення в процесі ембріонального розвитку, постнатального росту, дозрівання і старіння, а також при захворюваннях людини необхідні подальші міждисциплінарні дослідження.