Нейтральні стовбурові клітини

Експериментальні докази можливості регенерації клітин ЦНС були отримані значно раніше відкриття ембріональних стовбурових клітин в дослідженнях, які показали наявність в неокортексе, гіпокампі і нюхових цибулинах головного мозку дорослих щурів клітин, захоплюючих 3Н-тимідину, тобто, здатних до синтезу білка і ділення. Ще в 60-і роки минулого століття допускалося, що ці клітини є попередниками нейронів і беруть безпосередню участь у процесах навчання і пам'яті. Трохи пізніше було виявлено наявність синапсів на освічених de novo нейронах і з'явилися перші роботи про використання ембріональних стовбурових клітин з метою індукції нейроногенеза in vitro. В кінці XX століття експерименти з спрямованої диференціюванням ЕСК в нейтральні клітини-попередники, дофаминергические і серотонінергічні нейрони привели до перегляду класичних уявлень про здатність нервових клітин ссавців до регенерації. Результати численних досліджень переконливо довели як реальність перебудов нейрональних мереж, так і наявність нейроногенеза протягом усього періоду постнатальної життя організму ссавців.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Джерела нейтральні стовбурових клітин

Нейтральні стовбурові клітини людини виділяють під час операцій на субвентрікулярной області бічних шлуночків і зубчастої звивини гіпокампа, клітини яких в культурі утворюють нейросфер (нейтральні кулі), а після диспергування і преформірованія останніх - всі головні клітинні типи ЦНС або, в спеціальному середовищі, нові мікросфери. У суспензійний культурах диссоциированной тканини, виділеної з перивентрикулярних відділів ембріонального мозку, також виникають нейросфер.

Маркерами незрілих клітин головного мозку служать нестін, бета-тубулін III (маркер нейрональної лінії), виментин, GFAP і NCAM, для іммуноцітохіміческіе ідентифікації яких використовуються моноклональні антитіла. Нестін (білок проміжних нейрофиламентов IV типу) експресують мультипотентні нейроектодермальні клітини. Цей білок застосовують для ідентифікації та виділення з ЦНС мультіпотентних нейроепітеліальних клітин-попередників за допомогою моноклональних антитіл Rat-401, які дозволяють виявити до 95% клітин нервової трубки ембріонів щура на одинадцятий день гестації. Нестін НЕ експресується на диференційованих нащадків нейтральні стовбурових клітин, однак присутній в ранніх нейтральні клітинах-попередниках, постмітотіческіх нейронах і ранніх Нейробласти. За допомогою цього маркера ідентифіковані нейроепітеліальние клітини-попередники і доведено існування стовбурових клітин в ЦНС. Віментин (білок проміжних нейрофиламентов III типу) експресується нервовими і гліальними клітинами- попередниками, а також нейронами, фібробластами і гладком'язовими клітинами. Отже, обидва іммуноцітохіміческіе маркера не володіють специфічністю, необхідної для роздільного ідентифікації нейтральні стовбурових і прогеніторних клітин. За допомогою бета-тубуліну III встановлюють нейрональную спрямованість диференціювання стовбурових клітин, тоді як астроцити I типу ідентифікуються за експресією GFAP, а олігодендроціти специфічно експресують галактоцереброзід (Ga! C).

Митогенами для нейтральні клітин-попередників служать FGF2 і EGF, що підтримують проліферацію недиференційованих клітин-попередників в культурі з формуванням нейросфер. Швидкість поділу нейтральні стовбурових клітин значно зростає під впливом FGF2, а також при використанні комбінації FGF2 + EGF. Проліферативні ефекти FGF2 опосередковані рецепторами FGF2-R1. Гепарин підвищує афінність рецепторного зв'язування FGF2 і різко посилює його мітогенний дію на нейроепітеліальние клітини. На ранніх етапах ембріогенезу рецептори FGF2 експресуються в теленцефалоне щурів, на більш пізніх стадіях їх локалізація обмежена вентрикулярной зоною. Пік експресії FGF2-R1 постмітотіческіх клітинами спостерігається по завершенні періоду раннього нейрогенезу. Для початкового періоду розвитку теленцефалона характерний низький рівень експресії рецепторів EGF, переважно в клітинах вентральній області. На більш пізніх стадіях ембріогенезу експресія EGF-R підвищується в дорсальном напрямку. У головному мозку гризунів EGF володіє високою спорідненістю до рецептора трансформуючого фактора росту бета (TGF-бета-R), з яким переважно і зв'язується. Побічно про функціональну роль EGF-R свідчать дані про кортикальном дисгенез переднього мозку, що виникає в пізній період ембріогенезу і постнатальному онтогенезі, зниженні функції переднього мозку, загибелі клітин кори і ектопії гіпокампу у мишей з нокаутом гена рецептора EGF. Крім того, для утворення нейросфер абсолютно необхідним є наявність в живильному середовищі TGF-a. Після видалення факторів росту з кондиційної середовища клітини припиняють ділитися і зазнають спонтанної диференціювання з формуванням нейронів, астроцитів і олігодендробластов.

З огляду на це, реагрегацію дисоційованому стовбурових клітин і культивування нейросфер проводять в поживних середовищах, що містять EGF і основний FGF або FGF2, але без додавання сироватки. Показано, що EGF індукує проліферацію стовбурових клітин субепендімной зони бічних шлуночків, а основний FGF сприяє проліферації стовбурових клітин стриатума, гіпокампу, нової кори і зорового нерва зрілого мозку. Комбінація EGF і основного FGF є абсолютно необхідною для активної проліферації стовбурових клітин, виділених з епендими третього і четвертого шлуночків переднього мозку, а також з спинномозкового каналу грудного і поперекового відділів спинного мозку.

Після дисоціації суспензію нейтральні стовбурових клітин культивують в пластикових чашках або в многолуночних планшетах без адгезивного субстрату для збільшення розміру утворюються нових нейросфер, що зазвичай займає близько 3 тижнів. Метод багаторазового дисперсії і відтворення нейросфер дозволяє отримувати достатню кількість лінійних клонів мультіпотентних стовбурових клітин для внутрішньомозкової трансплантації. Цей принцип покладено і в основу створення банку стовбурових клітин, виділених з ембріонального мозку людини. Їх тривалий (протягом декількох років) клонування дає можливість отримати стабільні лінії нейтральні стовбурових клітин, з яких при індукованої диференціювання формуються катехоламінергіческіх нейрони.

Якщо ж нейросфер НЕ диспергують і вирощуються на адгезивних субстратах в середовищах, позбавлених ростових факторів, пролиферирующие стовбурові клітини починають спонтанно диференціюватися з утворенням клітин-попередників нейронів і глії з експресією маркерів всіх типів нервових клітин: Бер2, Tau-1, NSE, NeuN, бета -тубулін III (нейрони), GFAP (астроцити) і CalC, 04 (олігодендроціти). На відміну від клітин мишей і щурів, в культурах нейтральні стовбурових клітин людини на частку нейронів припадає понад 40% всіх диференційованих клітин (у гризунів - від 1 до 5%), проте виникає значно менше олигодендроцитов, що дуже важливо з точки зору клітинної терапії демієлінізуючих захворювань. Проблема вирішується шляхом додавання культуральної середовища В104, що стимулює утворення міелінпродуцірующіх клітин.

При культивуванні нейтральні прогеніторних клітин мозку ембріонів людини в середовищі, що містить EGF, основний FGF і LIF, кількість клітин-попередників нейральной лінії збільшується в 10 млн разів. Розмноження in vitro клітини зберігають здатність мігрувати і диференціюватися в нервові і гліальні елементи після трансплантації в мозок статевозрілих щурів. Однак in vivo число поділок мультіпотентних клітин-попередників обмежена. Неодноразово зазначалося, що ліміт Хейфліка для "дорослої" нервової стовбурової клітини (близько 50 мітозів) поки ще недосяжний навіть в експерименті - клітини у вигляді нейросфер зберігають свої властивості лише протягом 7 місяців і всього при 8 пасажах. Як вважають, це пов'язано з особливостями способів їх дисперсії при пасирування (тріпсінізаціі або механічний вплив), що різко знижує активність клітин внаслідок порушення міжклітинних контактів. Дійсно, якщо замість диспергирования застосувати спосіб поділу нейросфер на 4 частини, життєздатність клітин при пасирування істотно збільшується. Така методика дозволяє культивувати нейтральні стовбурові клітини людини протягом 300 днів. Однак після закінчення цього терміну клітини втрачають мітотичну активність і піддаються дегенерації або ж виходять на етап спонтанної диференціювання з утворенням нейронів і астроцитів. На цій підставі автор вважає, що 30 митозов є граничним числом поділів для культивованих нейтральні стовбурових клітин.

При культивуванні нейтральні стовбурових клітин людини in vitro утворюються переважно ГАМК-ергічні нейрони. Без створення спеціальних умов нейтральні клітини-попередники дають початок дофаминергическим нейронам (необхідним для клітинної терапії хвороби Паркінсона) тільки в перших пасажах, після чого всі нейрони в культурі складаються виключно з ГАМК-ергічних клітин. У гризунів індукцію дофамінергічних нейронів in vitro викликають IL-1 і IL-11, а також фрагменти мембран нервових клітин, LIF і GDNF. Однак у людини цей методичний прийом виявився безуспішним. Проте, при внутрішньомозкової трансплантації ГАМК-ергічних нейронів in vivo під впливом факторів мікрооточення виникають нервові клітини з різними медіаторнимі фенотипами.

Пошук комбінацій нейротрофічних факторів показав, що FGF2 і IL-1 індукують утворення дофаминергических нейробластов, які, однак, не здатні продукувати дофаминергические нейрони. Диференціація стовбурових клітин гіпокампу в збуджуючі глутаматергіческой і гальмівні ГАМК-ергічні нейрони відбувається під впливом нейротрофинов, a EGF і IGF1 індукують формування глутаматергіческіх і ГАМК-ергічних нейронів з нейтральні клітин-попередників ембріонів людини. Послідовне додавання в культуру ретиноєвої кислоти і нейротрофіну 3 (NT3) істотно підвищує диференціювання стовбурових клітин гіпокампу зрілого мозку в нейрони різної медиаторной природи, тоді як за допомогою комбінації нейротрофічних фактора головного мозку (BNDF), NT3 і GDNF в культурах гіпокампу і нової кори можна отримати пірамідні нейрони.

Таким чином, результати численних досліджень свідчать про те, що, по-перше, стовбурові клітини з різних структур мозку під впливом локальних специфічних тканинних факторів здатні диференціюватися in vivo в нейрональні фенотип, властиві цим структурам. По-друге, спрямована индуцированная диференціювання нейтральні стовбурових клітин in vitro за допомогою клонування клітин-попередників дає можливість отримання нервових і гліальних клітин із заданими фенотипическими характеристиками для внутрішньомозкової трансплантації при різних формах патології мозку.

Немає сумнівів, що плюрипотентні стовбурові клітини, виділені з ембріонів або ЦНС дорослої людини, можуть розглядатися як джерело нових нейронів і використовуватися в клініці з метою лікування неврологічної патології. Однак основною перешкодою для розвитку практичної клітинної нейротрансплантації є той факт, що більшість нейтральні стовбурових клітин не диференціюються в нейрони після імплантації в ненейрогенних зони зрілої ЦНС. В обхід цієї перешкоди пропонується досить оригінальний новаторський метод, що дозволяє in vitro отримати чисту популяцію нейронів з фетальних нейтральні стовбурових клітин людини після трансплантації в ЦНС половозрелой щури. Автори доводять, що диференціювання імплантованих за цим методом клітин закінчується формуванням нейронів холинергического фенотипу, що обумовлено впливом факторів навколишнього мікросередовища. Пропонована технологія представляє інтерес з точки зору розробки нових видів терапії на основі стовбурових клітин і заміни пошкоджених внаслідок травми або нейродегенеративне захворювання нейронів, оскільки холинергические нейрони відіграють провідну роль в становленні моторних функцій, функцій пам'яті та навчання. Зокрема, холинергические нейрони, виділені зі стовбурових клітин людини, можуть використовуватися для заміни мотонейронів, втрачених при аміотрофічному латеральном склерозі або травмах спинного мозку. В даний час немає відомостей про способи напрацювання значної кількості холинергических нейронів з популяції преформованих мітогеном стовбурових клітин. Автори пропонують досить простий, але ефективний метод стимуляції преформованих мітогеном первинних зародкових нейтральні стовбурових клітин людини в напрямку розвитку в практично чисті нейрони після імплантації як в ненейрогенних, так і в нейрогенні зони ЦНС половозрелой щури. Найбільш важливим результатом їх роботи є перетворення досить великої кількості трансплантованих клітин в холинергические нейрони при імплантації в середню мембрану і спинний мозок.

Крім того, для преформации нейтральні стовбурових клітин кори головного мозку 8-тижневого ембріона людини в холіиергіческіе нейрони in vitro пропонується використовувати різні комбінації наступних трофічних факторів і хімічних елементів: рекомбінантний основний FGF, EGF, LIF, аміно-термінальний звуковий пептид миші (Shh-N ), трансретіноевая кислота, NGF, BDNF, NT3, NT4, природний ламінін і гепарин миші. Початкова лінія нейтральні стовбурових клітин людини (К048) підтримувалася in vitro протягом двох років і витримала 85 пасажів без змін проліферативних і дифференцировочного властивостей при збереженні нормального диплоидного кариотипа. Недіспергірованние нейросфер 19-55-го пасажів (38-52-е тижні) висаджувалися на полі-д-лізин і ламінін, а потім оброблялися вищезгаданими факторами в різної концентрації, комбінації і послідовності. Комбінація, що складається з основного FGF, гепарину і ламініну (в абревіатурі FHL), дала унікальний ефект. Через одну добу культивування нейтральні стовбурових клітин ембріона в середовищі FHL з або без Shh-N (комбінація Shh-N + FHL в абревіатурі SFHL) спостерігалося стрімке розмноження великих планарних клітин. Всі інші одноденні протоколи (наприклад такі, як основний FGF + ламінін), навпаки, призвели до обмеженого радіальному поширенню веретеноподібних клітин, причому ці клітини не покидали серцевину нейросфер. Через 6 діб активації і подальшої десятиденної диференціації в середовищі, що містить В27, у краю FHL-активованих сфер були виявлені великі поліполярние нейроноподобние клітини. При цьому в інших протокольних групах більшість нейроноподобних клітин залишалися маленькими і біполярними або однополярним. Іммуноцітохіміческіе аналіз показав, що невеликі (<20 мкм) біполярні або однополярні клітини були або GABA-ергіческімі, або глутаматергіческіх, тоді як більшість великих поліполярних клітин, локалізованих у краю FHL-активованих нейросфер, виявилися холинергическими, оскільки експресували маркери, характерні для холінергічних нейронів (Islet-1 і ChAT). Деякі з цих нейронів одночасно експресували сінапсін 1. В результаті п'яти серій незалежних експериментів автори встановили, що загальна популяція клітин в одношарових зонах на 45,5% дифференцировалась в нейрони TuJl +, в той час як холинергические (ChAT ^) нейрони склали всього 27,8 % клітин тієї ж популяції. Через 10 діб додаткової диференціювання in vitro, крім холинергических нейронів, в FHL-активованих нейросфер було виявлено значну кількість малих нейронів - глутаматергіческіх (6,3%), GABA-ергіческіх (11,3%), а також астроцитів (35,2% ) і нестінпозітівних клітин (18,9%). При використанні інших комбінацій факторів росту холинергические нейрони були відсутні, а крайові клітини нейросфер формували або астроцити, або невеликі глутаматергіческой і GABA-ергічні нейрони. Моніторинг резервного і активного потенціалів із застосуванням техніки whole-cell patch clamp показав, що через сім днів FHL-активування велика частина великих поліполярних клітин володіла потенціалом спокою, що становить -29,0 ± 2,0 mV, при відсутності потенціалу дії. Через 2 тижні потенціал спокою зростав до -63,6 ± 3,0 mV, причому потенціали дії спостерігалися в момент індукції деполяризующих струмів і блокувалися 1М тетродотоксином, що свідчить про функціональну активність холінергічних незрілих нейронів.

Далі автори встановили, що саме по собі FHL- або SFHL- активування in vitro не призводить до утворення зрілих нейронів, і спробували встановити, чи здатні преформовані за допомогою FHL або SFHL стовбурові клітини диференціюватися в холинергические нейрони при трансплантації в ЦНС половозрелой щури. Для цього була проведена ін'єкція активованих клітин в нейрогенную зону (гіпокамп) і в кілька ненейрогенних зон, включаючи предфронтальной ділянку кори головного мозку, середню мембрану і спинний мозок дорослих щурів. Відстеження імплантованих клітин проводили за допомогою САО - ^^ р вектора. Відомо, що ОКР маркує одночасно як ультраструктури клітини, так і клітинні процеси (молекулярний рівень) без витоку і піддається прямій візуалізації. Крім того, ОРР-мічені нейтральні стовбурові клітини підтримують профіль нейрональної і гліальних диференціації, ідентичний профілю непреобразованних стовбурових клітин ембріонального мозку.

Через один-два тижні після імплантації 5 x 10 ⁴ активованих і маркованих нейтральні стовбурових клітин вони були виявлені в спинному або головному мозку щурів, при цьому ОКР +-клітини знаходилися, головним чином, біля місця ін'єкції. Процеси міграції та інтеграції спостерігалися вже через місяць після трансплантації. Межі міграції змінювалися в залежності від місця ін'єкції: при введенні в предфронтальной ділянку кори головного мозку ОКР +-клітини розташовувалися в 0,4-2 мм від зони введення, в разі ж імплантації в середню мембрану, гіпокамп або спинний мозок клітини мігрували на набагато більші відстані - до 1-2 см. Трансплантовані клітини локалізувалися в високоорганізованих структурах ЦНС, включаючи фронтальну область кори головного мозку, середню мембрану, гіпокамп і спинний мозок. ОКР-марковані нейрональні елементи проглядалися вже на 1-му тижні після трансплантації, при цьому їх кількість значно зросла через 1 місяць після операції. Стереологіческій аналіз показав вищий рівень виживання імплантуються клітин в різних структурах головного мозку, в порівнянні зі спинним.

Відомо, що в більшості тканин дорослого організму ссавців зберігається популяція регіонарних стовбурових клітин, трансформація яких у зрілі клітини регулюється специфічними тканинними факторами. Проліферація стовбурових клітин, диференціювання клітин-попередників і формування специфічних для даної структури мозку нейрональних фенотипів in vivo в набагато більшому ступені виражені в ембріональному мозку, що визначається наявністю високих концентрацій морфогенетических факторів локального мікрооточення - нейротрофинов BDNF, NGF, NT3, NT4 / 5 і ростових факторів FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Де знаходяться нейтральні стовбурові клітини?

Встановлено, що нейтральні стовбурові клітини експресують гліальний кислий фібрилярний білок, який серед зрілих клітин нейральной лінії зберігається тільки на астроцитах. Отже, стовбуровим резервом в зрілої ЦНС можуть бути Астроцитарні клітини. Дійсно, в нюхових цибулинах і зубчастої звивини були виявлені нейрони, що відбуваються з GFAP-позитивних попередників, що суперечить традиційним уявленням про прогеніторних ролі радіальної глії, що не експресує GFAP в зубчастій звивині в зрілому віці. Не виключено, що в ЦНС існують дві популяції стовбурових клітин.

Питання про локалізацію стовбурових клітин в субвентрікулярной зоні також залишається неясним. За даними одних авторів, епендімного клітини утворюють в культурі сферичні клони, які не є істинними нейросфер (як клони клітин субепендіми), оскільки здатні диференціюватися тільки в астроцити. З іншого боку, після флюоресцентной або вірусної маркування клітин епендими маркер виявляється в клітинах субепендімного шару і нюхових цибулин. Такі мічені клітини in vitro формують нейросфер і диференціюються в нейрони, астроцити і олігодендроціти. Крім того, показано, що в епендими близько 5% клітин експресують стовбурові маркери - нестін, Notch-1 і Mussashi-1. Передбачається, що механізм асиметричного мітозу пов'язаний з нерівномірним розподілом мембранного рецептора Notch-1, внаслідок чого останній залишається на мембрані дочірньої клітини, локалізованої в епендімного зоні, тоді як материнська клітина, мігруюча в субепендімний шар, позбавляється цього рецептора. З цієї точки зору, субепендімную зону можна розглядати як колектор прогеніторних попередників нейронів і глії, що утворюються зі стовбурових клітин епендімного шару. На думку інших авторів, в каудальних відділах субвентрікулярной зони утворюються тільки клітини глії, а джерелом нейроногенеза є клітини рострально-латерального відділу. У третьому варіанті переднім і заднім відділам субвентрікулярной зони бічних шлуночків надаються рівнозначні нейрогенні потенції.

Краще виглядає четвертий варіант організації стволового резерву в ЦНС, згідно з яким в субвентрікулярной зоні виділяються три основних типи нейтральні клітин-попередників - А, В і С. А-клітини експресують ранні нейрональні маркери (PSA-NCAM, TuJl) і оточені В-клітинами, які по експресії антигенів ідентифікуються як астроцити. C-клітини, не маючи антигенних характеристик нейронів або глії, мають високу проліферативною активністю. Автором досить переконливо доведено, що В-клітини є попередниками А-клітин і утворюються de novo нейронів нюхових цибулин. В процесі міграції А-клітини оточені тяжами нейтральні клітин-попередників, що істотно відрізняється від міграційного механізму постмітотіческіх нейробластов уздовж радіальної глії в ембріональному мозку. Міграція завершується в нюхових цибулинах мітотичним розподілом як А-, так і В-клітин, похідні яких вбудовуються в шари зернистих клітин і в клубочковий шар ольфакторной зони мозку.

У мозку, який розвивається ембріонів немає диференційованих епендімного клітин, а до складу стінок шлуночків входять розмножуються стовбурові клітини вентрикулярной герменатівной й субвентрікулярной зон, куди мігрують первинні нейро- і гліобластом. Виходячи з цього, деякі автори вважають, що субепендімная область зрілого мозку містить редуцированную ембріональну герменатівную нервову тканину, що складається з астроцитів, нейробластов і неідентифікованих клітин. Справжні нейтральні стовбурові клітини складають менше 1% клітин герменатівной зони стінки бічних шлуночків. Почасти тому, а також у зв'язку з даними про те, що астроцити субепендімной зони є попередниками нейтральні стовбурових клітин, не виключається можливість трансдіфференціровка астроцитарної гліальних елементів з придбанням ними нейрональних фенотипических характеристик.

Основна перешкода для остаточного вирішення питання про локалізацію нейтральні стовбурових клітин in vivo - відсутність специфічних маркерів для цих клітин. Тим не менш, дуже цікавими, з практичної точки зору, представляються повідомлення про те, що нейтральні стовбурові клітини були виділені з відділів ЦНС, що не містять субепендімних зон - третього і четвертого шлуночків переднього мозку, спинномозкового каналу грудного і поперекового відділів спинного мозку. Особливо важливим є той факт, що при пошкодженні спинного мозку посилюється проліферація стовбурових клітин епендими центрального каналу з утворенням прогеніторних клітин, що мігрують і диференціюються в астроцити гліомезодермального рубця. Крім того, клітини-попередники астро- і олигодендроцитов виявлені і в непошкодженому спинному мозку дорослих щурів.

Таким чином, дані літератури переконливо свідчать про наявність в ЦНС дорослих ссавців, в тому числі і людини, регіонарного стволового резерву, регенераційно-пластична ємність якого, на жаль, здатна забезпечити тільки процеси фізіологічної регенерації з утворенням нових нейрональних мереж, але не відповідає потребам репаративної регенерації. Це ставить завдання пошуку можливостей збільшення стовбурових ресурсів ЦНС екзогенних шляхом, що нерозв'язною без чіткого уявлення про механізми формування ЦНС в ембріональному періоді.

Сьогодні нам відомо, що в процесі ембріонального розвитку стовбурові клітини нервової трубки є джерелом клітин трьох типів - нейронів, астроцитів і олигодендроцитов, тобто, нейрони і нейроглії відбуваються з єдиною клітини-попередника. Диференціація ектодерми в кластери нейтральні прогеніторних клітин починається під впливом продуктів пронейральних генів сімейства bHLH і блокується при експресії рецепторних трансмембранних білкових похідних генів сімейства Notch, які лімітують детермінацію і ранню диференціювання нейтральні клітин-попередників. У свою чергу, лигандами рецепторів Notch виступають трансмембранні білки Delta сусідніх клітин, за рахунок позаклітинного домену яких здійснюються прямі міжклітинні контакти з індукційним взаємодією між стовбуровими клітинами.

Подальша реалізація програми ембріонального нейрогенезу щонайменше складна і, здавалося б, повинна бути видоспецифічності. Однак результати нейроксенотрансплантаціонних досліджень вказують на те, що стовбурові клітини мають виражену еволюційним консерватизмом, завдяки чому нейтральні стовбурові клітини людини здатні мігрувати і розвиватися при їх трансплантації в мозок щура.

Відомо, що ЦНС ссавців має вкрай низькою купівельною спроможністю до репаративної регенерації, що характеризується відсутністю в зрілому мозку будь-яких ознак виникнення нових клітинних елементів замість загиблих в результаті травми нейронів. Однак в разі трансплантації нейробластов останні не тільки приживляються, проліферують і диференціюються, але і здатні вбудовуватися в структури мозку і функціонально заміщати втрачені нейрони. При трансплантації коммітірованних нейрональних прогеніторних клітин терапевтичний ефект виявився значно слабкіше. У таких клітин виявлена низька здатність до міграції. Крім того, нейрональні клітини-попередники не відтворювався архітектоніку нейронних мереж і функціонально не інтегруються в мозок реципієнта. У зв'язку з цим активно вивчаються питання репаративної-пластичної регенерації при трансплантації непреформірованних мультіпотентних нейтральні стовбурових клітин.

У дослідженні М. Александрової та співавторів (2001) в першому варіанті експериментів реципієнтами виступали статевозрілі самки щурів, а донорами були ембріони 15-добового розвитку. Реципієнтам видаляли ділянку потиличної кори мозку і в порожнину трансплантували механічно суспендованих тканину презумптівного ембріональної кори, що містить мультипотентні стовбурові клітини вентрикулярной і субвентрікулярной області. У другому варіанті експериментів здійснювалася трансплантація нейтральні стовбурових клітин 9-тижневого ембріона людини в мозок половозрелх щурів. З перивентрикулярной області головного мозку ембріонів автори виділяли шматочки тканин, поміщали їх у живильне середовище F-12 і шляхом багаторазового піпетування отримували суспензію клітин, а потім культивували їх в спеціальному середовищі NPBM з добавками ростових факторів - FGF, EGF і NGF. Клітини вирощували в суспензійний культури до формування нейросфер, які дисперговані і знову висаджували в культуру. Через 4 пасажу із загальним терміном культивування 12-16 діб клітини використовували для трансплантації. Реципієнтами були десятісуточкие крисята і статевозрілі двомісячні щури лінії Вістар, яким в область латерального шлуночка головного мозку вводили по 4 мкл суспензії нейтральні стовбурових клітин людини без проведення імуносупресії. Результати роботи показали, що диссоційовані клітини вентрикулярной і субвентрікулярной зони ембріональної закладки кори мозку щура при алотрансплантації в зрілий мозок продовжували свій розвиток, тобто, фактори мікрооточення диференційованого мозку реципієнта не блокували зростання і диференціювання нейтральні стовбурових клітин ембріона. У ранні терміни після пересадки мультипотентні клітини продовжували мітотичний поділ і активно мігрували з області трансплантації в тканину мозку реципієнта. Трансплантовані ембріональні клітини, що володіють величезним потенціалом міграції, були виявлені практично у всіх шарах кори мозку реципієнта уздовж трансплантаційного треку і в білій речовині. Протяжність міграційного тракту нервових клітин завжди була значно менше (до 680 мкм), ніж гліальних елементів (до 3 мм). Структурними векторами для міграції астроцитів служили кровоносні судини і волоконні структури мозку, що відзначалося і в інших дослідженнях.

Раніше вважалося, що накопичення мічених астроцитів в зоні пошкодження кори мозку реципієнта може бути пов'язано з формуванням глиального бар'єру між тканинами трансплантата і реципієнта. Однак дослідження структури компактно розташованих клітинних трансплантатів показало, що їх цитоархітектоніка характеризується хаотичністю, без будь-якого шаруватого розподілу пересаджених клітин. Ступінь впорядкованості трансплантованих нейронів наближалася до такої у клітин нормальної кори мозку тільки за умови відсутності глиального бар'єру між тканинами донора і реципієнта. В іншому випадку структура клітин трансплантата була атипової, а самі нейрони піддавалися гіпертрофії. За допомогою нейроіммунохіміческого типування пересаджених клітин в трансплантата були виявлені гальмівні GABA-ергічні нейрони до виявлена експресія білків PARV, CALB і NPY. Отже, в зрілому мозку зберігаються фактори мікрооточення, здатні підтримувати проліферацію, міграцію і специфічну диференціювання нейтральні мультіпотентних клітин.

У культурі стовбурових клітин людини, виділених з перивентрикулярной області мозку 9-тижневих ембріонів, М. Александрова та співавтори (2001) в четвертому пасажі виявили велику кількість нестінпозітівних мультіпотентних клітин, частина з яких вже піддалася диференціювання in vitro і розвивалася по нейрональная типу, що відповідало результатами досліджень інших авторів. Після трансплантації в мозок дорослих щурів культивовані стовбурні клітини людини мітотично ділилися і мігрували в тканину ксеногенного мозку реципієнта. У клітинних трансплантата автори спостерігали дві популяції клітин - дрібні й більші. Останні мігрували як в паренхімі, так і по волоконних структур мозку реципієнта на незначні відстані - в межах 300 мкм. Найбільша протяжність шляху міграції (до 3 мм) була характерна для дрібних клітин, частина яких дифференцировалась в астроцити, що було встановлено за допомогою моноклональних антитіл до GFAP. Обидва типи клітин виявлялися в стінці латерального шлуночка, що свідчило про вихід трансплантованих клітин на ростральними міграційний тракт. Астроцитарні похідні нейтральні стовбурових клітин як людини, так і щури мігрували переважно по кровоносних капілярах і волоконних структур мозку реципієнта, що збігається з даними інших авторів.

Аналіз диференціювання стовбурових клітин людини in vivo за допомогою моноклональних антитіл до GFAP, CALB і VIM виявив утворення як астроцитів, так і нейронів. На відміну від клітин щурячих трансплантатів, багато стовбурові клітини людини були віментінположітельнимі. Отже, частина мультіпотентних клітин людини не піддавалася диференціювання. Надалі ті ж автори показали, що нейтральні стовбурові клітини людини, пересаджені без застосування імуносупресії, переживають після трансплантації в мозку щура протягом 20 діб при відсутності ознак імунної агресії з боку гліальних елементів зрілого мозку.

Встановлено, що навіть нейтральні стовбурові клітини дрозофіли приживляються і піддаються диференціювання в головному мозку настільки віддаленого від комах таксона, як щур. Коректність експерименту авторів не викликає сумнівів: трансгенні лінії дрозофіли містили гени нейротрофічних факторів людини NGF, GDNF, BDNF, інсертірованние в вектор CaSper під дрозофіліним хіт-шоковим промотором, так що температура тіла ссавців автоматично викликала їх експресію. Автори ідентифікували клітини дрозофіли по продукту гена бактеріальної галактозидази за допомогою гістохімічного X-Gal фарбування. Крім того, виявилося, що нейтральні стовбурові клітини дрозофіли специфічно реагують на нейротрофические фактори, які кодуються генами людини: при ксенотрансплантації клітин трансгенної лінії дрозофіли, що містить ген gdnf, в її диференціюються стовбурових нервових клітинах різко підвищувався синтез тирозингідроксилази, а клітини з геном ngf активно продукували ацетилхолінестеразою . Аналогічні гензавісімие реакції ксенотрансплантати індукував в пересаджують разом з ним алотрансплантатом ембріональної нервової тканини.

Чи означає це, що специфічна диференціювання нейтральні стовбурових клітин активується відонеспеціфічнимі нейротрофическими факторами? За результатами авторів, ксенотрансплантати, який продукує нейротрофические фактори, надавав специфічний ефект на долю аллотрансплантатов, які в цьому випадку розвивалися більш інтенсивно і в 2-3 рази перевищували за розмірами алотрансплантату, введені в мозок без додавання ксенотрансплантатов. Отже, клітини ксенотрансплантата, що містять гени нейротрофинов, зокрема ген, що кодує гліальний нейротрофічний фактор (GDNF) людини, надають на розвиток аллотрансплантата відонеспеціфіческій ефект, подібний до дії відповідного нейротрофіну. Відомо, що GDNF підвищує виживаність дофамінергічних нейронів ембріонального середнього мозку щурів і підсилює метаболізм дофаміну цими клітинами, а також індукує диференціювання позитивних по тирозингідроксилази клітин, посилюючи зростання аксонів і збільшуючи розміри тіла нейронів. Подібні ефекти спостерігаються і в культурі дофамінергічних нейронів середнього мозку щура.

Після ксенотрансплантації нейтральні стовбурових клітин людини в мозок статевозрілих щурів відзначається їх активна міграція. Відомо, що процес міграції та диференціювання нейтральні стовбурових клітин контролюється набором спеціальних генів. Ініціює міграційний сигнал клітці-попереднику до початку диференціювання дає білковий продукт протоонкогена з-ret спільно з GDNF. Наступний сигнал надходить від гена mash-1, який керує вибором шляху розвитку клітини. Крім того, специфічна реакція дифференцирующихся клітин залежить також від а-рецептора циліарного нейротрофічних фактора. Таким чином, з огляду на абсолютно різну генетичну конституцію ксеногенних нейтральні стовбурових клітин людини і клітин мозку реципієнта-щури, слід визнати не тільки відонеспеціфічность нейротрофічних факторів, а й високий еволюційний консерватизм генів, що відповідають за специфічну диференціювання нейтральні стовбурових елементів.

Чи стане можливою ксенотрансплантація ембріонального нейроматеріала в нейрохірургічної практиці лікування нейродегенеративних патологічних процесів, обумовлених порушенням синтезу мієліну олигодендроцитов, покаже майбутнє. Поки ж найбільш інтенсивно вирішуються питання нейротрансплантації, пов'язані з отриманням з ембріонального або зрілого мозку алогенних нейтральні стовбурових клітин в культурі з подальшою їх спрямованої диференціюванням в нейробласти або спеціалізовані нейрони.

Трансплантація нейтральні стовбурових клітин

Для стимуляції проліферації і диференціювання нейтральні стовбурових клітин дорослого організму можна трансплантувати ембріональну нервову тканину. При цьому не виключено, що вноситься з алотрансплантатом стовбурові клітини нервової тканини ембріона самі можуть піддаватися проліферації і диференціювання. Відомо, що після спінальної травми регенерація нервових провідників здійснюється за допомогою подовження пошкоджених аксонів і колатерального спраутінга аксонів непошкоджених відростків мотонейронів. Основними чинниками, що перешкоджають регенерації спинного мозку, є утворення соединительнотканного рубця в зоні пошкодження, дистрофічні і дегенеративні зміни в центральних нейронах, дефіцит NGF, а також наявність в зоні ураження продуктів розпаду мієліну. Показано, що трансплантація в ушкоджений спинний мозок різних типів клітин - фрагментів сідничного нерва дорослих тварин, ембріональної потиличної кори, гіпокампа, спинного мозку, шванновских клітин, астроцитів, мікроглії, макрофагів, фібробластів - сприяє регенерації пошкоджених аксонів шляхом спраутінга і дозволяє новоствореним аксонам проростати крізь зону пошкодження спинного мозку. Експериментально доведено, що трансплантація ембріональної нервової тканини в область пошкодження спинного мозку за допомогою дії нейротрофічних факторів прискорює ріст уражених аксонів, перешкоджає утворенню глиального рубця і розвитку дистрофічних і дегенеративних процесів в центральних нейронах, в той час як клітини трансплантованою ембріональної нервової тканини переживають в спинному мозку, інтегруються з прилеглими тканинами і сприяють проростанню аксонів через область ураження з формуванням синапсів ден дрітіческого типу на спінальних нейронах.

Даний напрямок регенеративно-пластичної медицини отримало найбільший розвиток в Україні завдяки роботі наукового колективу під керівництвом В.І. Цимбалюка. Перш за все, це експериментальні дослідження ефективності трансплантації ембріональної нервової тканини при ушкодженнях спинного мозку. При аутотрансплантации периферичного нерва найбільш виражені зміни деструктивного характеру автори спостерігали в зоні дистального шва, де на 30-у добу після операції вони поєднувалися з процесами репаративного характеру. При аллотрансплантации морфофункціональний стан імплантованого нерва на 30-й день характеризувався вираженою деструкцією з явищами жирового переродження і амілоїдозу на тлі вогнищевої запальної лімфоідноклеточной інфільтрації з переважною атрофією шванновских клітин. Трансплантація ембріональної нервової тканини в більшою мірою сприяла відновленню провідності спинного мозку, особливо у тварин, яким операція проводилася протягом перших 24 годин після травми: на тлі зменшення інтенсивності запально-деструктивних процесів відзначалися гіпертрофія і гіперплазія белоксінтезірующіх і енергопродукуючої ультраструктурних елементів спінальних нейронів, гіпертрофія і гіперплазія олигодендроцитов, на 50% відновлювалася амплітуда потенціалу дії м'яза і на 90% - швидкість проведення імпульсу. При оцінці ефективності трансплантації ембріональної нервової тканини в залежності від зони пересадки було встановлено, що кращі результати спостерігаються при введенні трансплантата безпосередньо в зону пошкодження спинного мозку. При повному перетині спинного мозку трансплантація ембріональної нервової тканини виявилася неефективною. Динамічні дослідження показали, що оптимальним терміном для виконання трансплантації ембріональної нервової тканини є перші 24 години після травми спинного мозку, тоді як проведення операції в період виражених вторинних ішемічно-запальних змін, що виникають на 2-9-у добу після травми, слід визнати недоцільним.

Відомо, що важка черепно-мозкова травма провокує потужну і тривалу активацію пероксидного окислення ліпідів на початкових і проміжних етапах посттравматичного періоду як в пошкодженій мозкової тканини, так і в організмі в цілому, а також порушує процеси енергетичного метаболізму в травмованому мозку. У цих умовах трансплантація ембріональної нервової тканини в область травматичного пошкодження сприяє стабілізації процесів ліпопероксидації і підвищує потенціал антиоксидантної системи мозку і організму в цілому, посилює його антирадикальну захист на 35-60-е добу посттравматичного періоду. У ті ж терміни після трансплантації ембріональної нервової тканини нормалізується енергетичний метаболізм і процеси окисного фосфорилювання в головному мозку. Крім того, показано, що на перший день після експериментальної черепно-мозкової травми імпеданс тканини травмованого півкулі зменшується на 30-37%, контрлатерального - на 20%, що свідчить про розвиток генералізованого набряку мозку. У тварин, яким виконували трансплантацію ембріональної нервової тканини, інволюція набряку відбувалася значно швидше - вже на сьому добу середнє значення імпедансу тканин травмованого півкулі досягало 97,8% від контрольного рівня. Причому повне відновлення величин імпедансу на 30-у добу відзначалося тільки у тварин, яким трансплантували ембріональну нервову тканину.

Загибель частини нейронів мозку після важкої черепно-мозкової травми є однією з основних причин розвитку посттравматичних ускладнень. Особливо чутливі до травми нейрони інтегруючих дофаминергической і норадренергической систем середнього і довгастого мозку. Зниження рівня дофаміну в стриопаллидарной комплексі і корі великих півкуль істотно підвищує ризик розвитку рухових порушень і психічних розладів, епілептиформних станів, а зменшення продукції дофаміну в гіпоталамусі може бути причиною численних вегетативних і соматичних порушень, що спостерігаються у віддаленому посттравматичному періоді. Результати проведених досліджень при експериментальної черепно-мозковій травмі свідчать про те, що пересадка ембріональної нервової тканини сприяє відновленню вмісту дофаміну в травмованому півкулі мозку, дофаміну і норадреналіну - в гіпоталамусі, а також підвищенню рівнів норадреналіну і дофаміну в середньому і довгастому мозку. Крім того, в результаті трансплантації ембріональної нервової тканини в травмованому півкулі мозку експериментальних тварин нормалізується процентне співвідношення фосфоліпідів і підвищується вміст жирних кислот (С16: 0, С17: 0, С17: 1, С18: 0, С18: 1 + С18: 2, С20 : 3 + С20: 4, С20: 5).

Ці дані підтверджують стимуляцію регенеративно-пластичних процесів трансплантованою ембріональної нервової тканиною і свідчать про репаративної-трофическом вплив трансплантата на мозок реципієнта в цілому.

На особливу увагу заслуговує клінічний досвід співробітників Інституту нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова АМН України з трансплантації ембріональної нервової тканини при дитячому церебральному паралічі - вкрай складної патології з грубими порушеннями рухової функції. Клінічні форми дитячого церебрального паралічу залежать від рівня пошкодження інтегральних структур, що відповідають за регуляцію м'язового тонусу і формування рухових стереотипів. В даний час є достатньо доказів на користь того, що в порушеннях рухових функцій і м'язового тонусу важливу роль відіграють патологічні зміни в системі стріопаллідо-таламокортікальную моторного контролю. Стриопаллидарной ланка цієї системи здійснює контролюючу функцію через нігростріарной продукцію дофаміну. Прямий шлях реалізації таламокортікальную контролю починається від нейронів шкаралупи, опосередковується гаммааминомасляной кислотою (ГАМК) і субстанцією Р і проектується безпосередньо в моторну зону внутрішнього сегмента блідої кулі і чорної субстанції. Непрямий шлях, ефект якого реалізується за участю ГАМК і енкефалінів, бере початок від нейронів шкаралупи і впливає на ядра базальних гангліїв через послідовність з'єднань, що включають зовнішній сегмент блідої кулі і субталамическое ядро. Порушення провідності прямого шляху викликають гипокинезию, тоді як зниження провідності структур непрямого шляху призводить до гиперкинезии з відповідними змінами м'язового тонусу. Цілісність ГАМК-ергічних провідних шляхів на різних рівнях в системі моторного контролю та інтеграція дофаминергических зв'язків на рівні шкаралупи мають істотне значення для регуляції таламокортикальних взаємодій. Найбільш загальним проявом рухової патології при різних формах дитячого церебрального паралічу є порушення м'язового тонусу і тісно пов'язана з ним зміна рефлекторної активності м'язів.

Трансплантація ембріональної нервової тканини при дитячому церебральному паралічі вимагає ретельного аналізу характеру пошкоджень мозкових структур. На підставі визначення вмісту дофаміну і ГАМК в субарахноїдальному лікворі автори деталізували рівень порушення інтеграції функціональних структур мозку, що дало можливість об'єктивізувати результати оперативного втручання і скорегувати повторні нейротрансплантації. Ембріональну нервову тканину (абортний матеріал 9-тижневого зародка) трансплантували в паренхіму кори прецентральной звивини півкуль головного мозку в залежності від ступеня вираженості атрофічних змін. В післяопераційному періоді ускладнень або погіршення стану хворих не спостерігалося. Позитивна динаміка відзначалася у 63% хворих із спастичними формами, у 82% дітей з атонически-астетіческой формою і тільки у 24% хворих зі змішаною формою захворювання. Встановлено негативний вплив на результати операції високого рівня нейросенсибілізація з наявністю аутоантитіл до нейроспецифічні білків. Малоефективною трансплантація ембріональної нервової тканини виявилася у хворих у віці 8-10 років і старше, а також при вираженому гиперкинетическом синдромі і епісіндрома. Клінічно ефективність пересадки ембріональної нервової тканини у хворих із спастичними формами дитячого церебрального паралічу виявлялася формуванням нових статомоторних навичок і довільних рухів з корекцією патологічного рухового стереотипу і зменшенням ступеня спастичності, патологічних поз і установок. Автори вважають, що позитивний ефект трансплантації ембріональної нервової тканини є результатом нормалізує впливу на функціональну активність супраспінальних структур, що беруть участь в регуляції тонусу поз і довільних рухів. При цьому позитивні клінічні ефекти трансплантації ембріональної нервової тканини супроводжуються зниженням вмісту нейромедіаторів в субарахноїдальному лікворі, що свідчить про відновлення інтегральних взаємодій уражених структур мозку.

Існує ще одна важка форма неврологічної патології - апалічний синдром, проблема лікування якого, на жаль, далека від вирішення. Апалічний синдром являє собою поліетіологічное підгострий або хронічний стан, що виникає в результаті важких органічних уражень центральної нервової системи (переважно кори великих півкуль), і характеризується розвитком панапраксіі і панагнозіі при відносно збереженій функції сегментарно-стовбурових відділів і утворень лімбіко-ретикулярного комплексу головного мозку. Катамнестические дослідження (від 1 року до 3 років) показали, що апалічний синдром не є кінцевим діагнозом стійкого ураження нервової системи у дітей, а трансформується або в органічну деменцію, або в хронічний вегетативний стан. У відділенні відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова АМН України 21 хворому з наслідками апалічного синдрому була виконана трансплантація ембріональної нервової тканини. Під загальною анестезією корончатой фрезою накладали фрезевое отвір над зоною найбільш виражених атрофічних змін, виявлених при комп'ютерній або магнітно-резонансної томографії, а при наявності дифузної атрофії сірого або білого речовини трансплантат вводили в прецентральная і центральну звивини головного мозку. Після розтину твердої мозкової оболонки шматочки тканини закладки сенсомоторної кори 8-9-тижневий ембріонів імплантували інтракортикальна за допомогою спеціального пристрою. Кількість зразків імплантованою тканини становило від 4 до 10, що визначалося величиною фрезевого отвори і розмірами місцевих змін мозкової речовини. На відміну від інших видів патології, при апалічному синдромі автори прагнули імплантувати якомога більше ембріональної тканини в максимально доступні зони мозку. Тверду мозкову оболонку ушивали, виробляли пластику дефекту черепа. Під час операції у всіх хворих спостерігалися виражені зміни як з боку кори (атрофія, відсутність звивин, зміна кольору і пульсації мозкової речовини), так і оболонок мозку (потовщення твердої мозкової оболонки, значне потовщення арахноидальной оболонки з наявністю в ній власних кровоносних судин, зрощення оболонок з підметом мозковою речовиною). Ці зміни були більш виражені у хворих, в анамнезі яких були вказівки на перенесені запальні ураження головного мозку. У хворих, які перенесли гіпоксію ЦНС, переважали дифузні атрофічні зміни мозкової речовини, особливо коркових відділів, зі збільшенням підпавутинного простору, без виражених змін з боку оболонок головного мозку. У половини хворих відзначалася підвищена кровоточивість м'яких тканин, кісток, мозкової речовини. Після операцій в терміни від шести місяців до трьох років стан покращився у 16 пацієнтів, у п'яти хворих залишилося без змін. Позитивна динаміка спостерігалася як з боку рухової, так і психічної сфери. М'язовий тонус знизився у десяти хворих, у І пацієнтів зросла рухова активність (зменшився парез, покращилася координація рухів), у п'яти дітей помітно підвищилася маніпулятивна здатність верхніх кінцівок. У чотирьох хворих знизилася частота і вираженість епілептичних припадків, а в однієї дитини за весь період спостереження після операції нападів не було взагалі. Агресивність зменшилася у двох дітей, у двох хворих з вираженими бульбарними порушеннями покращився акт ковтання, дві дитини змогли самостійно жувати вже через 2 тижні після операції. Відзначено зменшення вираженості психічних розладів, дев'ять дітей після операції стали більш спокійними, сон і увагу покращилися у семи пацієнтів. Троє хворих з наслідками апалічного синдрому почали впізнавати своїх батьків, один - виконувати інструкції, двоє - вимовляти слова, у трьох знизилася ступінь дизартрії. Автори відзначають, що помітне поліпшення стану хворих починається через 2 місяці після операції, досягає максимуму до 5-6 місяців, потім темп поліпшення сповільнюється і до кінця року у 50% хворих процес стабілізується. Позитивний ефект нейротрансплантації послужив підставою для проведення повторної операції у шести хворих з наслідками апалічного синдрому, але на іншій півкулі головного мозку. Техніка і методика другий трансплантації були ідентичні таким при першій операції, проте клінічний ефект другої операції виявився нижчим, хоча як після першого, так і після другого оперативного втручання серйозних ускладнень не виникало. На думку авторів, механізм лікувальної дії нейротрансплантації пов'язаний з нейротрофическим впливом пересадженою ембріональної нервової тканини, яка містить велику кількість ростових, гормональних та інших біологічно активних речовин, що стимулюють репарацію пошкоджених нейронів і пластичну реорганізацію тканини мозку реципієнта. Не виключається і активують вплив на діяльність нервових клітин, які до цього були морфологічно збережені, але внаслідок захворювання втратили функціональну активність. Саме швидким нейротрофическим дією можна пояснити поліпшення бульбарних функцій у деяких дітей вже в кінці першої-другого тижня після операції. Допускається, що поряд з цим до третього-четвертого місяця між трансплантатом і мозком господаря встановлюються морфофункціональні зв'язку, за допомогою яких нейротрансплантат заміщає функції загиблих клітин мозку, що і є субстратом для поліпшення як рухових, так і психічних функцій хворих.

Вплив трансплантата ембріональної нервової тканини на реорганізацію міжнейронних взаємозв'язків вивчалося експериментально. Автори на білих щурах за допомогою флюоресцентної ліпофільній мітки DIL (1,1-діоктадеціл-3,3,3 \ 3'-тетраметіліндокарбоціаніна перхлорат) і конфокального лазерного сканування досліджували закономірності відновлення міжмодульних аксони зв'язків в зоні механічного пошкодження кори великого мозку на тлі трансплантації ембріональної нервової тканини і без неї. Встановлено, що введення ембріональної нервової тканини в зону пошкодження забезпечує зростання аксонів, які після проходження через трансплантат з'єднуються з прилеглою тканиною мозку, тоді як без трансплантації ембріональної нервової тканини зона ушкодження є для зростаючих аксонів непереборною перешкодою. У цій роботі проводилася трансплантація ембріонального (15-17-е добу гестації) неокортексу. Отримані авторами результати - ще одне свідчення на користь активного впливу трансплантата ембріональної нервової тканини на посттравматичних реорганізацію міжнейронних взаємин сусідніх структурно-функціональних модулів кори великого мозку. Трансплантація ембріональної нервової тканини забезпечує часткове відновлення зв'язків між розділеними пошкодженням ділянками кори великого мозку за рахунок створення сприятливих умов для зростання аксонів в зоні дії нейротрофічёскіх факторів трансплантата. Існування подібного ефекту доведено експериментально і обговорюється в літературі як свідчення високих пластичних можливостей пошкодженого мозку статевозрілих тварин. У зв'язку з цим, клітинна трансплантація розглядається в даний час в якості оптимальної терапевтичної стратегії відновлення функції пошкодженої ЦНС людини.

Отримані авторами дані про ефективність використання ембріональної нервової тканини мозку в якості екзогенної трансплантаційної середовища для зростання аксонів служать підтвердженням перспективності цілеспрямованого створення комунікаційних зв'язків між неушкодженими сусідніми ділянками мозку. Актуальною є робота з вивчення впливу трансплантації нервової тканини на динаміку функціональних параметрів ЦНС, завданням якої було дослідити вплив трансплантації ембріональної закладки locus coeruleus (LC) на морфофункціональні показники нейронів LC і локомоторну активність реципієнтів. Реципієнтами були самки щурів лінії Вістар, донорами - 18-добові ембріони щурів тієї ж лінії. Пересадку ембріонального LC проводили в порожнину третього шлуночка головного мозку. Гістологічно приживлення трансплантата виявлено у 75% тварин-реципієнтів. У випадках приживлення трансплантат прилягав до стінки шлуночка, заповнюючи 1 / 5-2 / 5 його просвіту, і був життєздатний. Через 1 і 6 місяців після операції пересаджена нервова тканина за морфологічними характеристиками представляла структури, які виникли б при їх нормальному онтогенетичному розвитку, тобто, структури LС. Отримані авторами дані свідчать про те, що у тварин, яким було пересаджено ембріональна закладка ЬС, змінюється динамічна активність і збільшується матрична активність хроматину ядер клітин LС. Отже, відбувається інтенсифікація діяльності нейронів власних LС, але і прижився трансплантат теж є функціонально активним. Відомо, що так звана локомоторная область середнього мозку практично збігається з локалізацією ЬС. Автори вважають, що в основі зміни рухової активності щурів-реципієнтів лежить активація клітин LС, як власних, так і трансплантата, з виділенням в результаті великої кількості норадреналіну, в тому числі і в сегментах спинного мозку. Таким чином, передбачається, що підвищення рухової активності в умовах трансплантації LС в інтактний мозок тварин обумовлено присутністю функціонально активного трансплантата, інтегрованого з головним мозком реципієнта і вносить свій вклад в активацію локомоторною активності щурів.

Крім того, показано, що пересаджені нейроепітеліальние клітини ембріональних закладок неокортексу і спинного мозку виживають і диференціюються в нейробласти, молоді і зрілі нейрони протягом 1-2 місяців після їх трансплантації в пошкоджену сідничний нерв статевозрілих щурів. При дослідженні динаміки розвитку NADРН-позитивних нейронів ембріональних закладок неокортексу і спинного мозку щурів в гетеротопічних алотрансплантатом (15- добовий ембріон щури), на поздовжніх зрізах через сідничні нерви щурів-реципієнтів виявлено приживлення від 70 до 80% нейротрансплантатов, що залежало від строків спостереження. Нейробласти уні і біполярної форми з округлими світлими ядрами і одним-двома ядерця починали формуватися в трансплантата через один тиждень після операції, що супроводжувалося утворенням кластерів. Серед нейробластов авторам не вдалося виявити клітини, що містять NADPH-діaфopaзy (NADPH-d). Через 7 діб NADPH-позитивними виявилися лише клітинні елементи кровоносних судин - ендотеліоцити капілярів в товщі трансплантата, а також ендотеліальні і гладком'язові клітини судин сідничного нерва реципієнта. Оскільки в клітинах гладеньких м'язів судин індукція NO-синтази (NOS) відбувається під впливом IL-1, автори пов'язують появу NADPH-позитивних гладких клітин в кровоносних судинах сідничного нерва з присутністю IL-1, синтезованого в пошкоджених нервових стовбурах. Відомо, що нейроногенез в умовах трансплантації ембріональних закладок мозку здійснюється синхронно з розвитком нейронів in situ. Результати морфологічних досліджень свідчать про те, що диференціювання частини нейтральні елементів трансплантатів через сім діб після пересадки відповідає диференціювання клітин аналогічних відділів мозку новонароджених щурів. Таким чином, в умовах гетеротопічною трансплантації в периферичний нерв пересаджені нервові клітини ембріона виявляють здатність синтезувати NADPH-d. При цьому в трансплантата спинного мозку виявляється більше нейронів, що містять NADPH-d, ніж в трансплантата неокортексу, однак синтез оксиду азоту починається в трансплантованих нейронах пізніше, ніж при розвитку in situ. В ЦНС хребетних NOS-позитивні клітини з'являються вже в пренатальний період. Вважається, що NO сприяє утворенню синаптичних зв'язків в мозку, який розвивається, а присутність NOS-позитивних нервових аферентних волокон, що забезпечують синтез NO в Нейробласти мозочка, стимулює міграцію і диференціювання нейронів, завдяки чому формується нормальна цитоархітектоніка мозку. Важлива роль NO в сінапсогенезе встановлена в ТЕКТУМ - NOS-позитивними виявилися лише ті нейрони, які мали синаптичні зв'язки з клітинами сітківки.

Відомо, що оксид азоту є одним з регуляторів діяльності мозку, де він утворюється з аргініну під впливом NO-синтази, яка має діафоразной активністю. В ЦНС N0 синтезується в ендотеліальних клітинах кровоносних судин, мікроглії, астроцитах і в нейронах різних відділів мозку. Після травматичного пошкодження мозку, а також при гіпоксії та ішемії спостерігається збільшення кількості нейронів, що містять NO, який є одним з регуляторів мозкового кровотоку. З огляду на здатність N0 індукувати сінапсогенез, дослідження утворення NO-містять клітин в умовах нейротрансплантації на тлі травматичних ушкоджень нервової тканини реципієнта представляють особливий інтерес.

Не менш важливим є вивчення впливу нейротрансплантації на умовно-рефлекторний стереотип поведінки. В експериментах по дослідженню впливу внутрішньомозкової і дистантной (між СII і СIII) пересадки тканини ембріонального блакитного плями (17-19-е добу гестації) на процеси пам'яті і вміст катехоламінів у щурів з руйнуванням лобно-скроневої неокортексу показано, що електролітичне пошкодження лобно-скроневої кори головного мозку порушує стереотип умовно-рефлекторної емоційної реакції уникнення (пам'ять), послаблює фізіологічну активність, знижує вміст норадреналіну в зоні коагулированного неокортексу, але підвищує т його рівень в гіпоталамусі, де спостерігається зменшення концентрації адреналіну, хоча в крові і надниркових його кількість зростає.

В результаті внутрішньомозкової трансплантації тканини ембріонального блакитного плями у 81,4% тварин відновлюється стереотип умовно-рефлекторної емоційної реакції уникнення, порушений електролітичним пошкодженням лобно-скроневих відділів кори головного мозку, нормалізується вміст адреналіну в ретикулярної формації середнього мозку, гіпоталамусі і неокортексе, а в гіпокампі навіть підвищується його рівень, що поєднується зі зниженням концентрації адреналіну в крові.

Дистантная трансплантація тканини ембріонального блакитного плями сприяє не тільки відновленню порушеного стереотипу умовно-рефлекторної емоційної реакції уникнення у щурів з електролітичним ураженням фронтотемпоральная кори головного мозку, а й підвищує вміст норадреналіну і адреналіну, переважно в гіпоталамусі, крові, надниркових і серце. Передбачається, що це пов'язано з васкуляризацией трансплантата, проникненням нейромедіаторів в кровоносне русло, проходженням їх через гематоенцефалічний бар'єр і активацією механізмів зворотного захоплення адреналіну і норадреналіну за типами uptake 1, 2, 3. Автори вважають, що тривалу стабілізацію рівня норадреналіну в умовах приживлення і функціонування трансплантата можна розглядати як феномен його поступального вивільнення в мінімальних дозах нейронами блакитного плями.

Позитивні клінічні ефекти трансплантації ембріональної нервової тканини можуть бути обумовлені і здатністю останньої впливати на процеси новоутворення судин, у регуляції яких безпосередню участь беруть чинники зростання і цитокіни. Активують васкулогенез ангіогенние чинники зростання - судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), FGF, PDGF і TGF, які синтезуються при ішемії, яка виступає ініціював моментом ангіогенезу. Доведено, що виснаження потенціалу судинного зростання відбувається в процесі старіння організму, що грає істотну роль в патогенезі таких захворювань, як ішемічна хвороба серця і облітеруючий атеросклероз нижніх кінцівок. Ішемія тканин розвивається і при безлічі інших захворювань. Введення ангіогенних факторів в зони ішемії (терапевтичний ангіогенез) стимулює ріст кровоносних судин в ішемізованих тканинах і покращує мікроциркуляцію за рахунок розвитку колатерального кровообігу, що, в свою чергу, підвищує функціональну активність ураженого органу.

Найбільш перспективними для клінічного застосування вважаються VEGF і FGF. Результати перших рандомізованих досліджень виявилися обнадійливими, особливо за умови правильного вибору оптимальних дозувань і способів введення ангіогенних факторів. У зв'язку з цим проведена експериментальна оцінка ангіогенного активності екстракту, виділеного з ембріональної мозкової тканини людини. У роботі використовувався абортний матеріал, отриманий на двадцятому тижні вагітності і оброблений за методикою I. Maciog і співавторів (1979) в модифікації ІЦ АНРФ. Даний препарат є аналогом "Endothelial cell growth supplement" ( "Sigma") і являє собою природну суміш ангіогенних факторів людини, до складу якої входять VEGF і FGF. Експерименти виконані на щурах з моделями ішемії тканини задньої кінцівки і міокарда. На підставі дослідження активності лужної фосфатази у експериментальних тварин, які отримували екстракт ембріональної нервової тканини, виявлено збільшення кількості капілярів на одиницю площі міокарда - як на поздовжніх, так і на поперечних зрізах серця. Ангіогенного активність препарату проявлялася при безпосередньому введенні в зону ішемії, а також в разі системного (внутрішньом'язового) введення, що призводило до зменшення середньої площі постинфарктного рубця.

У будь-якому варіанті виконання трансплантації ембріональної нервової тканини надзвичайно важливо правильно підібрати гестаційний термін трансплантованого ембріонального матеріалу. Порівняльний аналіз ефективності клітинних препаратів з ембріонального вентрального мезенцефалона 8-, 14- і 16-17-денних ембріонів щурів через три місяці після інтрастріарной нейротрансплантації статевозрілим щурам з паркінсонізмом в автоматизованому тесті апоморфініндуцірованной рухової асиметрії виявив достовірно більш високу ефективність клітинних препаратів ЦНС 8-добових ембріонів і найменшу - з 16-17-добової ембріональної нервової тканини. Отримані дані корелювали з результатами гістоморфологічній аналізу, зокрема, з розмірами трансплантатів, виразністю глиальной реакції і кількістю дофамінергічних нейронів в них.

Відмінності терапевтичного ефекту клітин ембріональної нервової тканини можуть бути пов'язані як зі ступенем незрілості і коммитирование самих клітин, так і з їх різною реакцією на фактори росту, які виділяються в зоні індукованого ушкодження дофамінергічних нейронів. Зокрема, вплив EGF і FGF2 на розвиток нейтральні стовбурових клітин теленцефалона in vivo відбувається на різних стадіях ембріогенезу. Нейроепітеліальние клітини 8,5-добових ембріонів миші при культивуванні in vitro в бессивороточной середовищі пролиферируют в присутності FGF2, але не EGF, на який реагують тільки популяції стовбурових клітин, ізольованих з мозку ембріонів на більш пізніх стадіях розвитку. У той же час нейтральні стовбурові клітини проліферують у відповідь на кожен з цих митогенов і адитивно підсилюють зростання в разі додавання EGF і FGF2 в культуру з низькою щільністю посадки клітин. Вважається, що EGF-реактивні нейтральні стовбурові клітини зародкових зон 14,5-добових ембріонів миші є лінійними нащадками FGF-реактивних нейтральні стовбурових клітин, які вперше з'являються через 8,5 доби гестації. Потенційний фенотип нейтральні стовбурових і прогеніторних клітин залежить від комплексного впливу їх мікрооточення. При иммунофенотипирование нейтральні клітин перивентрикулярной і гиппокампального зон 8-12- і 17-20-тижневих ембріонів людини методом проточної цітофлюорометріі виявлена значна варіабельність, пов'язана як з терміном гестації, так і з індивідуальними конституціональними особливостями донорського біоматеріалу. При культивуванні цих нейтральні клітин-попередників в селективної бессивороточной середовищі з EGF, FGF2 і NGF формуються нейросфер зі швидкістю, істотно залежить від терміну гестації. Клітини різних ділянок головного мозку 5-13-тижневого ембріона людини при короткочасній культивації з FGF2 в монослойной культурі на ламініновом субстраті в присутності слідів ростових факторів підтримують проліферацію протягом 6 тижнів з високим відсотком нестінпозітівних клітин на тлі спонтанного утворення клітин з маркерами всіх трьох ліній нейральной диференціювання. Клітини, ізольовані з мезенцефалона зародка людини при терміні гестації, що перевищує 13 тижнів, пролиферируют під впливом EGF та також утворюють нейросфер. Завдяки застосуванню комбінації EGF і FGF2 був досягнутий синергетичний ефект. Найбільш інтенсивна проліферація нейтральні стовбурових клітин з виникненням нейросфер спостерігається при культивуванні тканини кори головного мозку 6-8-тижневих ембріонів людини в присутності EGF2, IGF1 і 5% кінської сироватки на підкладці з фібронектином.

Слід зауважити, що питання, що стосуються терміну гестації і відділу ембріональної ЦНС, тканину якого краще використовувати з метою нейротрансплантації, залишаються відкритими. Відповіді на них слід шукати в Нейрогенез мозку, що розвивається, який триває протягом усього пренатального періоду - в терміни, коли епітелій нервової трубки утворює багатошарову структуру. Вважається, що джерелом стовбурових клітин і нових нейронів є радіальна глия, що складається з витягнутих клітин з довгими відростками, радіально спрямованими по відношенню до стінки мозкових міхурів, і контактують з внутрішньою поверхнею шлуночків і зовнішньої піальной поверхнею стінки мозку. Раніше радіальну глію наділяли лише функцією нейронального тракту, по якому здійснюється міграція нейробластов з вентральної області в поверхневі відділи, а також відводили їй каркасну роль в процесі формування правильної ламінарної організації кори. Сьогодні встановлено, що в міру розвитку радіальна глия трансдіфференціруется в астроцити. Значна її частина у ссавців редукується відразу після народження, проте у тих видів тварин, у яких радіальна глия зберігається до зрілого віку, нейроногенез активно протікає і в постнатальному періоді.

У культурі клітини радіальної глії з ембріонального неокортексу гризунів утворювали нейрони і гліальні клітини, причому на гестационном терміні розвитку зародків від 14 до 16 днів (період максимальної інтенсивності нейроногенеза в корі головного мозку мишей і щурів) формувалися переважно нейрони. На 18-ту добу ембріогенезу диференціювання зміщалася в бік утворення астроцитів при значному зменшенні числа новоутворених нейронів. Маркування in situ клітин радіальної глії за допомогою GFP дозволила виявити в порожнині мозкових міхурів 15-16-добових зародків щура асиметричне розподіл мічених клітин з появою дочірніх клітин, що мають імунологічні та електрофізіологічні характеристики нейробластов. Примітно, що, за результатами динамічних спостережень, що виникли нейробласти використовують материнську клітину радіальної глії для міграції до піальной поверхні.

Ендогенним маркером радіальної глії є білок проміжних філаментів нестін. Методом флюоресцентной проточною сортування клітин, мічених ретровирусом, пов'язаним з GFP і експресується під контролем нестін, показано, що стовбурові клітини області зубчастої звивини і хілус гіпокампу людини (матеріал був отриманий при операціях з приводу епілепсії) експресують нестін. Отже, вони відносяться до радіальної гліе, яка у людини, як і у інших ссавців, зберігається тільки в зубчастій звивині.

Разом з тим, ефективність клітинної трансплантації визначається не тільки високою життєздатністю донорських клітин, їх дифференцировочного потенціалом і властивістю заміщати дефектні клітини, але, в першу чергу, спрямованої міграцією. Саме від міграційної здатності залежить повноцінна функціональна інтеграція трансплантованих клітин - без порушень цитоархітектоніки мозку реципієнта. Оскільки радіальна глия в постнатальному періоді майже повністю піддається редукції, слід було з'ясувати, яким чином у дорослих реципієнтів донорські клітини можуть переміщатися із зони трансплантації в осередок пошкодження головного мозку. Існує два варіанти міграції клітин в ЦНС, які не залежать від радіальної глії: феномен тангенциальной міграції або переміщення нейробластов в процесі розвитку кори головного мозку перпендикулярно мережі радіальної глії, а також міграція "вервечкою" або "по ланцюжку". Зокрема міграція нейтральні клітин-попередників з ростральної субвентрікулярной зони в нюхову цибулину відбувається у вигляді послідовності щільно прилягають один до одного клітин, оточених клітинами глії. Вважається, що ці клітини використовують клітини-партнери в якості міграційного субстрату, а основним регулятором таких міжклітинних взаємодій є PSA-NCAM (полісіалірованная молекула адгезії нервових клітин). Отже, міграція нейронів не обов'язково вимагає участі радіальної глії або предсуществующих аксональних зв'язків. Внерадіальная форма переміщення клітин "вервечкою" по ростральними міграційному тракту підтримується протягом усього життя, що вказує на реальну можливість адресної доставки трансплантуються нейтральні клітин-попередників в зрілу нервову систему.

Існує гіпотеза про наявність лінії стовбурових клітин в онтогенезі головного мозку, згідно з якою на ранніх стадіях розвитку мозку стовбурової клітиною є клітина нейроепітелія, яка в міру дозрівання трансдіфференціруется в радіальну глію. У зрілому віці роль стовбурових клітин виконують клітини, що мають ознаки астроцитів. Незважаючи на ряд спірних моментів (протиріччя щодо стовбурових клітин гіпокампу, а також глибоких відділів мозку, які не мають шаруватого будови кори і розвиваються з таламических горбів, де радіальна глия відсутня), чітка і проста концепція про послідовну зміну фенотипу стовбурових клітин протягом онтогенезу виглядає вельми привабливо.

Вплив факторів мікрооточення на детермінацію і подальшу диференціацію клітин нейрального дифферона чітко продемонстровано при трансплантації стовбурових клітин зрілого спинного мозку щура в різні відділи зрілої нервової системи. При пересадці стволових клітин в зубчасту звивину або в область міграції нейронів нюхових цибулин спостерігалося активне переміщення трансплантованих клітин з утворенням численних нейронів. Пересадка стовбурових клітин в спинний мозок і область Амона роги приводила до утворення астроцитів і олигодендроцитов, тоді як при трансплантації в зубчасту звивину формувалися не тільки гліальні клітини, але і нейрони.

У статевозрілої щури число клітин, які діляться в зубчастій звивині може досягати декількох тисяч на добу - менше 1% від загального числа клітин-зерен. На частку нейронів припадає 50-90% клітин, астоцітов та інших гліальних елементів - близько 15%. Решта клітини не мають антигенних ознак нейронів і глії, проте містять антигени ендотеліальних клітин, що свідчить про тісний взаємозв'язок нейроногенеза і ангіогенезу в зубчастій звивині. Прихильники можливості диференціювання ендотеліальних клітин в клітини-попередники нейронів посилаються на здатність ендотеліоцитів in vitro синтезувати BDNF.

Вражає швидкість самозборки нейронних ланцюгів: в процесі диференціювання клітини-попередники клітин-зерен мігрують в зубчасту звивину і утворюють відростки, що ростуть в сторону зони САЗ Амона роги і формують синапси з пірамідними глутаматергіческіх і вставними гальмівними нейронами. Новостворені клітини-зерна вбудовуються в існуючі нейронні ланцюги протягом 2 тижнів, а перші синапси з'являються вже на 4-6-у добу після виникнення нових клітин. Шляхом частого введення зрілим тваринам BrdU або 3Н-тимідину (один із способів виявлення дорослих стовбурових клітин) виявлена велика кількість мічених нейронів і астроцитів в Аммоновим розі, що свідчить про можливість утворення нових нейронів не тільки в зубчастій звивині, а й в інших відділах гіпокампа. Інтерес до процесів розподілу, диференціювання і загибелі клітин в зубчастій звивині гіпокампу зрілого мозку обумовлений ще й тим, що формуються тут нейрони локалізуються в одному з ключових місць гіпокампу, що відповідає за процеси навчання і пам'яті.

Отже, на сьогодні встановлено, що з клітин субепендімной зони бічного шлуночка зрілих гризунів відбуваються нейтральні клітини-прешественнікі, мігруючі по ростральними міграційному тракту, освіченій поздовжньо орієнтованими клітинами астроглії, до нюхової цибулини, де вони вбудовуються в шар клітин-зерен і диференціюються в нейрони цієї структури. Міграція прогеніторних нейтральні клітин виявлена в ростральними міграційному тракті дорослих мавп, що вказує на можливість формування нових нейронів в нюхової цибулини приматів. Нейтральні стовбурові клітини виділені з нюхової цибулини дорослої людини і переведені в лінії, клоновані клітини яких диференціюються в нейрони, астроцити і олігодендроціти. Стовбурові клітини виявлені в гіпокампі зрілого мозку щурів, мишей, мавп і людини. Нейтральні стовбурові клітини субгранулярной зони зубчастої фасції є джерелом клітин-попередників, мігруючих в медіальний і латеральний лімби гіпокампу, де вони диференціюються в зрілі клітини-зерна і гліальні елементи. Аксони сформованих de novo нейронів зубчастої фасції простежено до поля САЗ, що вказує на участь новоутворених нейронів в реалізації функцій гіпокампу. В асоціативних областях нової кори мозку дорослих мавп виявлено клітини-попередники нейронів, мігруючі з субвентрікулярной зони. У VI шарі нової кори головного мозку мишей нові пірамідні нейрони виявляються через 2-28 тижнів після індукованого ушкодження і загибелі нативних нейронів цього шару за рахунок міграції раніше дормантних клітин-попередників субвентрікулярной зони. Нарешті, про реальність постнатального нейроногенеза в мозку людини свідчить дворазове збільшення числа коркових нейронів, що триває протягом перших 6 років після народження.

Важливе значення для практичної клітинної трансплантології має питання про регуляції процесів розмноження і диференціації нейтральні стовбурових і прогеніторних клітин. Найбільше значення серед факторів, що пригнічують проліферацію нейтральні клітин-попередників, мають глюкокортикоїди, які різко зменшують кількість поділів, тоді як видалення надниркових залоз, навпаки, значно збільшує число мітозів (Gould, 1996). Примітно, що морфогенез зубчастої звивини у гризунів найбільш інтенсивний протягом перших двох тижнів постнатального розвитку в період відсутності реакції на стрес на тлі різкого зниження продукції і секреції стероїдних гормонів коркового речовини надниркових залоз. Кортикостероїди гальмують міграцію клітин-зерен - нові нейрони не вбудовуються в зернистий шар зубчастої звивини, а залишаються в хілус. Допускається, що одночасно порушуються і процеси утворення синаптичних зв'язків. Захист клітин від такої "стероїдної агресії" здійснюється шляхом мінімальної експресії минерало- і глюкокортикоїдних рецепторів на пролиферирующих клітинах-зернах не тільки в ході розвитку зубчастої звивини, а й у зрілих тварин. Проте, з усіх нейронів головного мозку саме нейрони гіпокампу характеризуються найбільш високим вмістом рецепторів глюкокортикоїдів, що й обумовлює стресовий вплив на гіпокамп. Психоемоційне напруження і стресові ситуації пригнічують нейроногенез, а хронічний стрес різко знижує здатність тварин до засвоєння нових навичок і навчання. Більш виражений негативний вплив хронічного стресу на нейроногенез цілком зрозуміло, якщо врахувати переважно дормантное стан нейтральні стовбурових клітин. При іммобілізації вагітних щурів (для гризунів - надсильний стресовий фактор) встановлено, що і пренатальний стрес також викликає зменшення числа клітин в зубчастій звивині і істотно пригнічує нейроногенез. Відомо, що глюкокортикоїди беруть участь в патогенезі депресивних станів, морфологічним еквівалентом яких є гальмування нейроногенеза, патологічна перебудова нейронів і міжнейронних зв'язків, а також загибель нервових клітин. З іншого боку, засоби антидепресивний хіміотерапії активують утворення нейронів de novo, що підтверджує зв'язок між процесами утворення нових нейронів в гіпокампі і розвитком депресії. Істотний вплив на нейроногенез надають естрогени, ефекти яких протилежні дії глюкокортикостероїдів і полягають в підтримці проліферації і життєздатності нейтральні прогеніторних клітин. Потрібно зауважити, що естрогени значно підвищують здатність тварин до навчання. Деякі автори з впливом естрогенів пов'язують циклічні зміни кількості клітин-зерен і перевищує їх число у самок.

Відомо, що нейроногенез контролюється EGF, FGF і BDNF, проте механізми впливу зовнішніх сигналів на стовбурові клітини з боку митогенов і факторів росту вивчені недостатньо. Встановлено, що PDGF in vitro підтримує нейрональную спрямованість диференціювання клітин-попередників, а циліарний нейротрофічний фактор (CNTF), як і трийодтиронін, стимулює формування переважно гліальних елементів - астроцитів і олигодендроцитов. Гіпофізарний Аденилатциклаза-який активує білок (РАСАР) і вазоактивний інтестинального пептид (VIP) активують проліферацію нейтральні клітин-попередників, але при цьому гальмують процеси диференціювання дочірніх клітин. Опіоїди, особливо в разі тривалого їх впливу, значно пригнічують нейроногенез. Однак у стовбурових клітин і нейтральні прогеніторних клітин-попередників зубчастої звивини не виявлено опіоїдних рецепторів (вони є у дифференцирующихся нейронів ембріонального періоду), що не дозволяє оцінити прямі ефекти опіоїдів.

Потреби практичної регенеративно-пластичної медицини змусили дослідників приділити особливу увагу вивченню плюрі- і мультипотентні стовбурових клітин. Реалізація цих властивостей на рівні регионарной стовбурової клітини дорослого організму в перспективі могла б забезпечити напрацювання необхідного трансплантаційного матеріалу. Вище було показано, що епігенетична стимуляція нейтральні стовбурових клітин дозволяє отримати проліферуючі клітини, вже преформовані по нейтральні фенотипам, що обмежує їх кількість. У разі використання тотипотентних властивостей ембріональної стовбурової клітини проліферація до отримання достатньої кількості клітин відбувається раніше нейтральні диференціювання, а розмноження клітини легко конвертуються в нейтральні фенотип. Для отримання нейтральні стовбурових клітин ЕСК виділяють з внутрішньої клітинної маси бластоцисти і культивують при обов'язковій присутності LIF, що зберігає їх тотипотентність і здатність до необмеженого поділу. Після цього за допомогою ретиноєвої кислоти індукують нейтральні диференціювання ЕСК. Трансплантація отриманих таким чином нейтральні стовбурових клітин в пошкоджену квіноліном і 6-гідроксідопаміном стриатум супроводжується їх диференціюванням в дофаминергические і серотонінергічні нейрони. Після введення в шлуночки головного мозку ембріона щура нейтральні клітини-попередники, отримані з ЕСК, мігрують в різні області мозку реципієнта, в тому числі в кору, стриатум, септума, таламус, гіпоталамус і мозочок. Клітини, що залишаються в порожнині шлуночків, формують епітеліальні структури, що нагадують нервову трубку, а також окремі острівці ненейральной тканини. У паренхімі мозку ембріона-реципієнта пересаджені клітини продукують три основних типи клітин нервової системи. Деякі з них мають витягнуті апікальні дендрити, тіла пірамідних клітин і базальні аксони, що проектуються в мозолисте тіло. Астроцити донорського походження простягають відростки до прилеглих капілярах, а олігодендроціти тісно контактують з мієлінових муфтами, беручи участь в утворенні мієліну. Таким чином, нейтральні клітини-попередники, отримані з ЕСК in vitro, здатні до спрямованої міграції та адекватної сигналам микроокружения регионарной диференціювання, забезпечуючи багато областей мозку, що розвивається нейронами і глией.

Деякими авторами розглядається можливість де- і трансдіфференціровка регіонарних стовбурових клітин дорослого організму. Непрямим підтвердженням дедіфференціровкі клітин в культурі з розширенням їх потенцій є дані про приживлення стовбурових нейтральні клітин мишей в червоному кістковому мозку з подальшим розвитком з них клітинних ліній, що дають функціонально активні клітини периферичної крові. Крім того, трансплантація генетично мічених (LacZ) клітин нейросфер, отриманих з зрілого або ембріонального мозку, в головний мозок опромінених мишей з пригніченим кроветворением приводила до утворення зі стовбурових клітин не тільки нейтральні похідних, а й викликала генерацію клітин крові, що свідчить про плюріпотентності нейтральні стовбурових клітин, яка реалізується за межами головного мозку. Таким чином, нейтральні стовбурові клітина здатна диференціюватися в клітини крові під впливом сигналів мікрооточення кісткового мозку з попередньої трансформацією в кровотворну стовбурові клітини. З іншого боку, при пересадці кістковомозкових стовбурових кровотворних клітин в головний мозок встановлена їх диференціювання під впливом мікрооточення тканини мозку в гліальні і нервові клітини. Отже, диференціювання ровочной потенціал нервових і кровотворних стовбурних клітин не обмежений тканинної специфічністю. Іншими словами, фактори локального мікрооточення, відмінні від характерних для тканин головного і кісткового мозку, здатні змінити спрямованість диференціювання цих клітин. Показано, що нейтральні стовбурові клітини, введені в венозну систему опромінених мишей, створюють в селезінці і кістковому мозку популяції мієлоїдних, лімфоїдних і незрілих гемопоетичних клітин. In vitro встановлено вплив морфогенетических білків кісткового мозку (BMPs) на виживаність і диференціювання нейтральні стовбурових клітин, що визначає, як і на ранніх етапах ембріогенезу, їх розвиток в нейтральні або гліальних напрямках. У культурах нейтральні стовбурових клітин 16-добових ембріонів щурів BMPs індукують утворення нейронів і астроглії, тоді як в культурах стовбурових клітин, отриманих з перинатального мозку, формуються тільки астроцити. Крім того, BMPs пригнічують генерацію олигодендроцитов, які in vitro з'являються тільки за умови додавання антагоніста BMPs ноггіна.

Процесам трансдіфференціровка властива відонеспеціфічность: гемопоетичні стовбурові клітини кісткового мозку людини, пересаджені в стриатум статевозрілих щурів, мігрують в білу речовину зовнішньої капсули, ипси- і контралатеральний неокортекс, де утворюють астроцітоподобние клітинні елементи (Azizi et al., 1998). При аллотрансплантации стовбурових клітин кісткового мозку в бічний шлуночок новонароджених мишей міграція гемопоетичних стовбурових клітин простежується до структур переднього мозку і мозочка. У стриатуме і молекулярному шарі гіпокампу мігрували клітини трансформуються в астроцити, а в нюхової цибулини, внутрішньому шарі клітин-зерен мозочка і ретикулярної формації стовбура мозку утворюють нейроноподобние клітини з позитивною реакцією на нейрофіламенти. Після внутрішньовенного введення дорослим мишам гемопоетичних клітин GFP-мічені мікро- і астроцити виявляються в неокортексе, таламусі, стовбурі мозку і мозочку.

Крім того, мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку, що дають початок усім типам клітин сполучної тканини, в певних умовах також можуть зазнавати нейтральні трансдіфференціровка (нагадаємо, що ембріональним джерелом мезенхіми є клітини нервового гребеня). Показано, що стромальні клітини кісткового мозку людини і миші, культивовані in vitro в присутності EGF або BDNF, експресують маркер нейтральні клітин-попередників нестін, а додавання різних комбінацій факторів росту призводить до утворення клітин з маркерами глії (GFAP) і нейронів (ядерний білок, NeuN). Мічені сінгенние мезенхімальні стовбурові клітини, трансплантовані в латеральний шлуночок мозку новонароджених мишей, мігрують і локалізуються в передньому мозку і мозочку, не порушуючи цито-архітектоніку мозку реципієнта. Мезенхімальні стовбурові клітини кісткового мозку диференціюються в зрілі астроцити в смугастому тілі і молекулярному шарі гіпокампу, а також заселяють нюхову цибулину, гранулярні шари мозочка і ретикулярну формацію, де перетворюються в нейрони. Мезенхімальні стовбурові клітини з кісткового мозку людини здатні in vitro диференціюватися в макроглія, а після трансплантації інтегруватися в структури головного мозку щурів. Пряма трансплантація мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку в гіпокамп дорослих щурів також супроводжується їх міграцією в паренхіму мозку і нейрогліальних дифференцировкой.

Допускається, що трансплантація стовбурових клітин кісткового мозку може розширити можливості клітинної терапії захворювань ЦНС, що характеризуються надмірною патологічною загибеллю нейронів. Треба, однак, зауважити, що далеко не всі дослідники визнають факт взаємної трансформації нейтральні і гемопоетичних стовбурових клітин, особливо в умовах in vivo, що знову-таки зумовлено відсутністю надійного маркера для оцінки їх трансдіфференціровка і подальшого розвитку.

Трансплантація стовбурових клітин відкриває нові горизонти для клітинної генної терапії спадкової неврологічної патології. Генетична модифікація нейтральні стовбурових клітин передбачає вбудовування генетичних регуляторних конструкцій, продукти яких взаємодіють з білками клітинного циклу в режимі автоматичного регулювання. Трансдукція таких генів в ембріональні клітини-попередники використовується для розмноження нейтральні стовбурових клітин. Більшість генетично модифікованих клітинних клонів поводиться подібно стабільним клітинним лініях, не проявляючи ознак трансформації in vivo або in vitro, але має виражену здатність до контактного гальмування проліферації. При трансплантації розмножених трансфекованих клітин останні вбудовуються в тканину реципієнта, не порушуючи цитоархітектоніку і не піддаючись пухлинної трансформації. Донорські нейтральні стовбурові клітини не деформують зону інтеграції і рівноправно конкурують за простір з клітинами-попередниками господаря. Однак на 2-3-е добу інтенсивність поділу клітин-трансфектантов різко знижується, що відповідає контактному ингибированию їх проліферації in vitro. У ембріонів-реципієнтів нейтральні стовбурових трансфектантов відсутні аномалії розвитку ЦНС, всі зони головного мозку, що контактують з трансплантатом, розвиваються нормально. Після трансплантації клони нейтральні стовбурових клітин швидко мігрують із зони введення і нерідко виходять за межі відповідних зародкових зон по ростральними тракту, адекватно інтегруючись з іншими зонами мозку. Вбудовування генетично модифікованих клонів і трансфекованих клітинних ліній нейтральні стовбурових клітин в головний мозок організму-господаря характерно не тільки для ембріонального періоду: ці клітини імплантуються в численні зони ЦНС плода, новонародженого, дорослого і навіть старіючого організму реципієнта і виявляють при цьому здатність до адекватної інтеграції та диференціювання. Зокрема, після трансплантації в порожнину шлуночків головного мозку трансфекованих клітини мігрують, не пошкоджуючи гемато енцефалічний бар'єр, і стають інтегральними функціональними клітинними компонентами тканини мозку. Донорські нейрони утворюють відповідні синапси і експресують специфічні іонні канали. При збереженні цілісності гематоенцефалічного бар'єру астроглії, похідна нейтральні стовбурових клітин-трансфектантов, простягає відростки на церебральні судини, а олігодендроціти донорського походження експресують основний білок мієліну і міелінізіруют відростки нейронів.

Крім того, нейтральні стовбурові клітини трансфеціруют для використання в якості клітинних векторів. Такі векторно-генетичні конструкції забезпечують in vivo стабільну експресію чужорідних генів, що беруть участь в розвитку нервової системи, або застосовуються з метою корекції наявних генетичних дефектів, оскільки продукти цих генів здатні заповнювати різні біохімічні аномалії ЦНС. Висока міграційна активність трансфекованих стовбурових клітин і адекватна імплантація в зародкові зони різних областей мозку, що розвивається дозволяють сподіватися на повне відновлення спадкового дефіциту клітинних ферментів. При моделюванні синдрому атаксії-телеангіектазії (мутантні лінії мишей пг і pcd) клітини Пуркіньє зникають з мозочка експериментальних тварин протягом перших тижнів постнатального розвитку. Показано, що введення нейтральні стовбурових клітин в мозок таких тварин супроводжується їх диференціюванням в клітини Пуркіньє і гранулярні нейрони. У мутантів pcd частково коригуються порушення координації рухів і зменшується інтенсивність тремору. Подібні результати отримані при трансплантації клонованих нейтральні стовбурових клітин людини приматам, у яких дегенерацію клітин Пуркіньє индуцировали за допомогою онконази. Після трансплантації донорські нейтральні стовбурові клітини були виявлені в гранулярному і молекулярному шарах, а також в шарі клітин Пуркіньє паренхіми мозочка. Отже, генетична модифікація нейтральні клітин-попередників здатна забезпечити стабільну коммітірованних модифікацію фенотипу, стійку до зовнішніх впливів. Це особливо важливо при патологічних процесах, пов'язаних з виробленням у реципієнта чинників, що перешкоджають виживанню і диференціювання донорських клітин (наприклад, при імунної агресії).

Мукополісахарідоз типу VII у людини характеризується нейродегенерации і прогресуючої затримкою інтелектуального розвитку, що в експерименті на мишах моделюється делеционного мутацією гена бета-глюкуронідази. Після трансплантації в шлуночки мозку новонароджених дефектних мишей-реципієнтів трансфекованих нейтральні стовбурових клітин, які секретують бета-глюкуронідазу, донорські клітини виявляються спочатку в термінальній зоні, а потім поширюються по паренхімі головного мозку, стабільно коригуючи цілісність лізосом в мозку мишей-мутантів. У моделі хвороби Тея-Сакса трансдуцірованние ретровирусом нейтральні стовбурові клітини при внутрішньоутробному введення в плід миші і трансплантації новонародженим мишам забезпечують ефективну експресію бета-субодиниці бета-гексозамінідази у реципієнтів з мутацією, що приводить до патологічного накопичення бета 2 гангліозиду.

Ще одним напрямком регенераційної медицини є стимуляція проліферативної і дифференцировочного потенціалу власних нейтральні стовбурових клітин хворого організму. Зокрема, нейтральні стовбурові клітини секретують NT-3 при гемісекція спинного мозку і асфіксії головного мозку у щурів, експресують NGF і BDNF в септума і базальних гангліях, тирозингідроксилази - в стриатуме, а також рілін - в мозочку і основний білок мієліну - в головному мозку .

Однак питань стимуляції нейроногенеза приділяється явно недостатньо уваги. Нечисленні роботи дають підставу вважати, що функціональне навантаження на нервові центри, відповідальні за розрізнення запахів, відбивається на утворенні нових нейронів. У трансгенних мишей з дефіцитом нейрональних молекул адгезії зниження інтенсивності нейроногенеза і зменшення числа мігруючих в нюхові цибулини нейронів поєднувалося з порушенням здатності розрізняти запахи, хоча поріг сприйняття запаху і короткочасна нюхова пам'ять при цьому не порушувалися. У регуляції нейроногенеза велику роль відіграє функціональний стан клітин зубчастої звивини: ослаблення ефекту впливу глутамату на клітини-зерна після руйнування енторінальной кори сприяє проліферації і диференціювання нейронів, а стимуляція волокон перфорантні шляху (основного аферентного входу в гіпокамп) викликає гальмування нейроногенеза. Антагоністи NMDA-рецепторів активують процеси новоутворення нейронів, тоді як агоністи, навпаки, знижують інтенсивність нейроногенеза, що за ефектом нагадує дію глюкокортикостероїдів. У літературі зустрічаються суперечливі результати досліджень: відомості про експериментально доведений угнетающем впливі збудливого нейромедіатора глутамата на нейроногенез не узгоджуються з даними про стимуляції розмноження клітин-попередників і появі нових нейронів при підвищенні судомної активності в гіпокампі тварин з експериментальними каїнової і пилокарпиновую моделями епілепсії. У той же час на традиційній моделі епілепсії, викликаної багаторазовим субпорогових роздратуванням певної ділянки мозку (кіндлінга) і характеризується менш вираженою загибеллю нейронів, інтенсивність нейроногенеза зростає тільки в пізній фазі кіндлінга, коли в гіпокампі відзначається ушкодження і загибель нейронів. Показано, що при епілепсії судомна активність стимулює нейроногенез з аномальною локалізацією нових зернистих нейронів, багато з яких з'являються не тільки в зубчастій звивині, а й в хілус. Такі нейрони мають велике значення в розвитку спраутінга Моховидних волокон, оскільки їх аксони утворюють відсутні в нормі зворотні колатералі, що формують численні синапси з сусідніми клітинами-зернами.

Використання регіонарних нейтральні стовбурових клітин відкриває нові перспективи застосування клітинної трансплантації в терапії метаболічних і генетичних нейродегенеративних захворювань, демиелинизирующих хвороб і посттравматичних порушень функцій ЦНС. Перед виконанням замісної клітинної трансплантації по одному з методів проводиться селекція і експансія необхідного типу нейтральні клітин-попередників ex vivo з метою їх подальшого введення безпосередньо в пошкоджену ділянку мозку. Терапевтичний ефект в даному випадку обумовлений заміщенням пошкоджених клітин або ж локальним вивільненням чинників зростання і цитокінів. Цей спосіб регенеративно-пластичної терапії вимагає трансплантації досить великої кількості клітин з попередньо заданими функ-нальних характеристиками.

Доцільними слід визнати і подальші дослідження з вивчення молекулярних характеристик і регенеративно-пластичних потенцій стовбурових клітин зрілого мозку, a також здатності до трансдіфференціровка регіонарних стовбурових клітин різного тканинного походження. Сьогодні вже проведено скринінг антигенів кровотворних стовбурних клітин кісткового мозку з визначенням маркерной комбінації клітин, здатних трансдіфференціроваться в нейтральні стовбурові клітини-попередники (CD 133+, 5Е12 +, CD34-, CD45-, CD24). Отримано клітини, що утворюють in vitro нейросфер і формують нейрони при трансплантації в головний мозок новонароджених імунодефіцитних мишей. Інтерес для клітинної ксенотрансплантологіі представляють результати досліджень про можливість перехресної трансплантації стовбурових клітин у особин еволюційно віддалених таксонів. Поки залишаються без належної інтерпретації результати імплантації нейтральні стовбурових клітин в область пухлини головного мозку: пересаджені клітини активно мігрують по всьому об'єму пухлини, не виходячи за її межі, а при введенні клітин в интактную частина мозку спостерігається їх активна міграція в бік пухлини. Питання про біологічну значущості такої міграції залишається відкритим.

Необхідно відзначити, що успішна трансплантація нейтральні стовбурових клітин, як і інших нейтральні клітин-попередників, отриманих з ЕСК, можлива тільки в умовах використання високоочищених нейтральні прогеніторних клітин, оскільки недиференційовані ембріональні стовбурові клітини при трансплантації дорослому імунокомпетентні реципієнту неминуче трансформуються в тератоми і тератокарціноми. Навіть мінімальна кількість низькодиференційованих клітин в донорської клітинної суспензії різко підвищує туморогенну трансплантата і неприпустимо збільшує ризик виникнення пухлин або утворення ненейральной тканини. Отримання гомогенних популяцій нейтральні клітин-попередників можливо при використанні в якості альтернативного джерела донорської тканини клітин, що виникають на певних етапах нормально протікає ембріогенезу. Інший підхід полягає в ретельної елімінації небажаних клітинних популяцій шляхом лініеспеціфіческой селекції. Небезпека також представляє застосування з метою нейротрансплантації ЕСК після їх недостатньою експозиції in vitro з факторами росту. В цьому випадку не виключений збій програми нейральной диференціювання з формуванням структур, властивих нервової трубки.

Сьогодні абсолютно очевидно, що нейтральні стовбурові клітини виявляють тропізм до патологічно змінених областям ЦНС і мають виражений регенеративно-пластичним ефектом. Мікрооточення в осередку загибелі клітин нервової тканини моделює спрямованість диференціювання трансплантованих клітин, заповнюючи, таким чином, дефіцит специфічних нейтральні елементів в межах зони ураження ЦНС. При деяких нейродегенеративних процесах виникають нейрогенні сигнали до рекапитуляции нейроногенеза, і нейтральні стовбурові клітини зрілого мозку здатні відповідати на цю інструктивну інформацію. Наочною ілюстрацією терапевтичних можливостей нейтральні стовбурових клітин служать численні дані експериментальних досліджень. Інтрацистернально введення клону нейтральні стовбурових клітин тваринам з перев'язкою середньої церебральної артерії (модель ішемічного інсульту) сприяє зменшенню площі і обсягу деструктивно зміненої ділянки мозку, особливо в разі пересадки нейтральні стовбурових клітин разом з FGF2. Іммуноцітохіміческіе при цьому спостерігається міграція донорських клітин в зону ішемії з наступною їх інтеграцією з інтактними клітинами мозку реципієнта. Трансплантація незрілих клітин нейроепітеліальние лінії МНР36 миші в головний мозок щурів при експериментальному інсульті покращує сенсомоторную функцію, а введення цих клітин в шлуночки мозку підсилює пізнавальну функцію. В результаті трансплантації щурам нейральні-преформованих гемопоетичних клітин кісткового мозку людини усуваються порушення функції кори головного мозку, викликані ішемічним пошкодженням. При цьому ксеногенні нейтральні прогеніторні клітини мігрують з місця введення в зону деструктивних змін тканини мозку. Інтракраніальна пересадка гомологічних кістковомозкових клітин при травматичному пошкодженні кори головного мозку у щурів призводить до часткового відновлення моторної функції. Клітини донора приживляються, пролиферируют, зазнають нейтральні диференціювання в нейрони і астроцити і мігрують в напрямку осередку ураження. При введенні в стриатум дорослих щурів з експериментальним інсультом клоновані нейтральні стовбурові клітини людини заміщають пошкоджені клітини ЦНС і частково відновлюють порушені функції головного мозку.

Нейтральні стовбурові клітини людини переважно виділяють з ембріонального теленцефалона, який розвивається значно пізніше, ніж більш каудально розташовані ділянки нервового стовбура. Показана можливість виділення нейтральні стовбурових клітин з спинного мозку 43-137-добового плода людини, оскільки в присутності EGF і FGF2 ці клітини формують нейросфер і на ранніх пасажах проявляють мультіпотентность, диференціюючи в нейрони і астроцити. Однак тривале культивування нейтральні клітин-попередників (понад 1 року) позбавляє їх мультипотентні - такі клітини здатні диференціюватися тільки в астроцити, тобто, вони стають уніпотентнимі. Регіонарні нейтральні стовбурові клітини можуть бути отримані в результаті часткової бульбектоміі і після розмноження в культурі в присутності LIF трансплантувати того ж самому хворому з нейродегенеративних змінами в інших відділах ЦНС. У клініці замісна клітинна терапія з використанням нейтральні стовбурових клітин вперше була проведена для лікування хворих з інсультом, що супроводжується ураженням базальних гангліїв головного мозку. В результаті трансплантації донорських клітин відзначено поліпшення клінічного стану більшості хворих.

Деякі автори вважають, що здатність нейтральні стовбурових клітин приживлятися, мігрувати і інтегруватися в різні області нервової тканини при пошкодженні ЦНС відкриває необмежені можливості для клітинної терапії не тільки локальних, але і великих (інсульт або асфіксія), мультіочагових (розсіяний склероз) і навіть глобальних ( більшість успадкованих метаболічних порушень або нейродегенеративні деменції) патологічних процесів. Дійсно, при пересадці клонованих нейтральні стовбурових клітин миші і людини твариною-реципієнтам (мишам і приматам відповідно) з дегенерацією дофамінергічних нейронів в мезостріальной системі, індукованої введенням метил-феніл-тетрапірідіна (модель хвороби Паркінсона) за 8 місяців до трансплантації, донорські нейтральні стовбурові клітини інтегруються в ЦНС реципієнта. Через місяць трансплантовані клітини локалізуються білатерально уздовж середнього мозку. Частина утворилися нейронів донорського походження експрессірует тірозінгідролазу при відсутності ознак імунної реакції на трансплантат. У щурів, яким вводили 6-гідроксідопамін (ще одна експериментальна модель хвороби Паркінсона), адаптація трансплантованих клітин до мікрооточення в мозку господаря визначалася умовами культивування нейтральні стовбурових клітин до їх пересадки. Нейтральні стовбурові клітини, швидко проліферуючі in vitro під впливом EGF, заповнювали дефіцит дофамінергічних нейронів в пошкодженому стриатуме більш ефективно, ніж клітини з 28-добових культур. Автори вважають, що це пов'язано з втратою здатності до сприйняття відповідних дифференцировочного сигналів в процесі клітинного ділення нейтральні клітин-попередників in vitro.

В окремих роботах робилися спроби підвищити ефективність впливу на процеси реиннервации пошкодженого стриатума шляхом пересадки в цю область клітин ембріонального стриатума як джерело нейротрофічних факторів з одночасною трансплантацією дофамінергічних нейронів вентрального мезенцефалона. Як з'ясувалося, ефективність нейротрансплантації багато в чому залежить від способу введення ембріональної нервової тканини. В результаті досліджень з пересадки препаратів ембріональної нервової тканини в шлуночкову систему мозку (щоб уникнути травми паренхіми стриатума) отримані відомості про позитивний їх вплив на моторний дефект при паркінсонізмі.

Однак в інших дослідженнях експериментальні спостереження показали, що трансплантація в шлуночок мозку препаратів ембріональної нервової тканини вентрального мезенцефалона, що містять дофамінергічні нейрони, як і пересадка ГАМК-ергічних ембріональних нейтральні елементів в стриатум щурів з гемипаркинсонизма, не сприяє відновленню порушених функцій дофаминергической системи. Навпаки, іммуноцітохіміческіе аналіз підтвердив дані про низької виживаності дофамінергічних нейронів вентрального мезенцефалона, пересаджених в стриатум щурів. Терапевтичний ефект внутрижелудочковой трансплантації ембріональної нервової тканини вентрального мезенцефалона реалізувався лише за умови одночасної імплантації в денервированной стриатум препарату ембріональних стріарних клітин. Автори вважають, що механізм цього ефекту пов'язаний з позитивним трофічних впливом ГАМК-ергічних елементів ембріонального стриатума на специфічну дофаминергическую активність внутрішньошлуночкових трансплантатів вентрального мезенцефалона. Виражена глиальная реакція в трансплантата супроводжувалася незначним регресом показників апоморфінового тесту. Останні, в свою чергу, корелювали з вмістом GFAP в сироватці крові, що прямо вказувало на порушення проникності гематоенцефалічного бар'єру. На підставі цих даних, автори дійшли висновку, що рівень GFAP в сироватці крові може бути використаний як адекватний критерій оцінки функціонального стану трансплантата, а підвищена проникність гематоенцефалічного бар'єру для нейроспецифических антигенів типу GFAP є патогенетичною ланкою в розвитку неспроможності трансплантатів внаслідок аутоімунного пошкодження нервової тканини реципієнта .

З точки зору інших дослідників, приживлення і інтеграція нейтральні стовбурових клітин після трансплантації стабільні і довічне, оскільки донорські клітини виявляються у реципієнтів на протязі не менше двох років після пересадки і без істотного зменшення їх кількості. Спроби пояснити це тим, що в недиференційованому стані нейтральні стовбурові клітини не експресують молекули МНС класів I і II на рівні, достатньому для індукції реакції імунного відторгнення, можна визнати справедливими тільки по відношенню до низькодиференційованих нейтральні попередникам. Однак не всі нейтральні стовбурові клітини в мозку реципієнта зберігаються в незрелодормантном стані. Велика їх частина піддається диференціювання, в процесі якої молекули МНС експресуються в повному обсязі.

Зокрема, недостатня ефективність використання з метою лікування експериментального паркінсонізму інтрастріарной трансплантації препаратів ембріонального вентрального мезенцефалона, що містять дофамінергічні нейрони, зв'язується з низькою виживання пересаджених дофамінер- ня нейронів (всього 5-20%), що обумовлено реактивним глиозом, супроводжуючим локальну травму паренхіми мозку при трансплантації. Відомо, що локальна травма паренхіми мозку і супутній глиоз призводять до порушення цілісності гематоенцефалічного бар'єру з виходом в периферичну кров антигенів нервової тканини, зокрема Окара і нейронспецифічна антигену. Наявність в крові цих антигенів може викликати вироблення специфічних цитотоксичних антитіл до них і розвиток аутоімунної агресії.

В. Цимбалюк та співавтори (2001) повідомляють про те, що поки що в силі залишається традиційна точка зору, згідно з якою ЦНС є імунологічно привілейованої зоною, ізольованою від імунної системи гематоенцефалічний бар'єр. У своєму огляді літератури автори посилаються на цілий ряд робіт, які свідчать про те, що ця точка зору не повною мірою відповідає сутності імунних процесів в мозку ссавців. Встановлено, що мічені речовини, введені в паренхіму мозку, можуть досягати глибоких шийних лімфатичних вузлів, а після внутрішньоцеребральному ін'єкції антигенів в організмі утворюються специфічні антитіла. Клітини шийних лімфатичних вузлів відповідають проліферацією на такі антигени, починаючи з 5-го дня після ін'єкції. Виявлено формування специфічних антитіл і при трансплантації шкіри в паренхіму мозку. Автори огляду наводять кілька можливих шляхів транспорту антигену з мозку в лімфатичну систему. Один з них - перехід антигенів з периваскулярних просторів в субарахноїдальний простір. Допускається, що периваскулярні простору, локалізовані уздовж великих судин головного мозку, є еквівалентом лімфатичної системи в мозку. Другий шлях лежить уздовж білих волокон - через гратчасту кістку в лімфатичні судини слизової оболонки носа. Крім того, існує велика мережа лімфатичних судин і в твердій мозковій оболонці. Дуже відносна і непроникність гематоенцефалічного бар'єру для лімфоцитів. Доведено, що активовані лімфоцити здатні продукувати ензими, що впливають на проникність структур "імунного фільтра" мозку. На рівні посткапілярних венул активовані Т-хелпери проникають і через інтактний гематоенцефалічний бар'єр. Не витримує критики теза про відсутність в мозку клітин, які репрезентують антиген. В даний час переконливо доведена можливість подання антигенів в ЦНС принаймні трьома видами клітин. По-перше, це дендритні клітини кістковомозкового походження, які локалізуються в головному мозку вздовж великих кровоносних судин і в білій речовині. По-друге, антигени здатні презентувати ендотеліальні клітини кровоносних судин мозку, причому в асоціації з антигенами МНС, що підтримує клональний зростання специфічних до цих антигенів Т-клітин. По-третє, в якості антігенпредставляющіх агентів виступають клітини мікро- і астроглії. Беручи участь у формуванні імунної відповіді в ЦНС, астроцити набувають властивостей іммунноеффекторной клітини і експресують ряд антигенів, цитокінів і імуномодуляторів. При інкубації з у-інтерферону (y-INF) астрогліальние клітини in vitro експресують антигени МНС класів I і II, а стимульовані астроцити здатні до антигенною репрезентації і підтримці клональной проліферації лімфоцитів.

Травматизація тканини мозку, післяопераційне запалення, набряк і відкладення фібрину, які супроводжують трансплантацію ембріональної нервової тканини, створюють умови для підвищення проникності гематоенцефалічного бар'єру з порушенням аутотолерантності, сенсибилизацией і активацією СDЗ + СD4 + -лімфоцитів. Презентацію ауто- і аллоантігенов здійснюють астроцити і мікрогліальні клітини, що реагують на y-INF експресією молекул МНС, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, костімулірующіх молекул В7-1 (CD80) і В7-2 (CD86), а також секрецією IL-la, IL-ip і y-INF.

Отже, факт більш тривалого виживання ембріональної нервової тканини при интрацеребрально трансплантації, ніж при її периферичному введенні, навряд чи можна пов'язати з відсутністю ініціації трансплантаційного імунітету. Тим більше, що моноцити, активовані лімфоцити (цитотоксичні CD3 + CD8 + і Т-клітини-хелпери) і цитокіни, які вони продукують, а також антитіла до антигенів периферичного трансплантата ембріональної нервової тканини відіграють головну роль в процесі його відторгнення. Певне значення в створенні умов для більш тривалої стійкості нейротрансплантатов до Т-клітинним імунним процесам має невисокий рівень експресії молекул МНС в ембріональної нервової тканини. Саме тому в експерименті імунне запалення після трансплантації ембріональної нервової тканини в мозок розвивається більш повільно, ніж після пересадки шкіри. Проте, через 6 місяців спостерігається повна деструкція окремих трансплантатів нервової тканини. При цьому в зоні трансплантації локалізуються переважно Т-лімфоцити, рестріктірованние за антигенами МНС класу II (Nicholas et al., 1988). Експериментально встановлено, що при ксенологіческой нейротрансплантації виснаження рівня Т-хелперів (L3T4 +), але не цитотоксичних Т-лімфоцитів (Lyt-2), продовжує виживання нервової тканини щурів в мозку мишей-реципієнтів. Відторгнення нейротрансплантата супроводжується його інфільтрацією макрофагами і Т-лімфоцитами господаря. Отже, макрофаги і активовані клітини мікроглії господаря діють in situ як антігенпрезентірующіх імуностимулюючі клітини, а підвищення експресії донорських антигенів МНС класу I підсилює киллерную активність цитотоксичних Т-лімфоцитів реципієнта.

Не має сенсу аналізувати численні спекулятивні спроби пояснити факт відторгнення нейротрансплантата реакцією імунної системи організму реципієнта на ендотеліоцити або гліальні елементи донора, оскільки і чисті лінії нейтральні клітин-попередників піддаються імунної атаки. Заслуговує на увагу повідомлення про те, що в механізмах більш тривалого виживання трансплантата в межах ЦНС важливу роль відіграє експресія клітинами мозку Fas-лігандів, що пов'язують рецептори апоптозу (Fas-молекули) на Т-лімфоцитах, інфільтруючих мозок, і індукують їх апоптоз, що є типовим захисним механізмом забар єрні аутоіммуногенних тканин.

Як справедливо зазначають В. Цимбалюк та співавтори (2001), трансплантація ембріональної нервової тканини характеризується розвитком запалення за участю сенсибілізованих до антигенів мозку і активованих клітин, антитіл, а також внаслідок локальної продукції цитокінів. Важливу роль при цьому відіграє предсуществующей сенсибілізація організму до антигенів мозку, яка виникає в період розвитку захворювань ЦНС і може бути спрямована на антигени трансплантата. Саме тому реально тривалий виживання гістонесовместімих нейротрансплантатов досягається тільки шляхом супресії системи імунітету з допомогою циклоспорину А чи введення моноклональних антитіл до СD4 + -лімфоцитів реципієнта.

Таким чином, залишається невирішеним безліч проблем нейротрансплантації, в тому числі і пов'язаних з імунологічної сумісністю тканин, дозволити які можна тільки після цілеспрямованих фундаментальних і клінічних досліджень.