Причини туберкульозу

Сімейство Mycobacteriaceae порядку Actinomycetales містить єдиний рід Mycobacterium. У 1975 році цей рід налічував близько 30 видів, а до 2000 р це число вже наблизилося до 100. Більшість видів мікобактерій відносять до сапрофітним мікроорганізмам, широко поширеним в навколишньому середовищі.

Група облігатних паразитів незначна, однак її практична значущість велика і визначається видами, що викликають туберкульоз у людини і тварин. Існує думка, що попередниками патогенних для людини мікобактерій були стародавні грунтові мікобактерії.

[1], [2], [3], [4],

Таксономія мікобактерій

Всі мікобактерії розділяють на патогенні для людини і умовно-патогенні.

У клінічній мікробіології використовують кілька підходів для класифікації мікобактерій:

• за швидкістю і оптимальній температурі зростання, здатності до утворення пігменту;
• по клінічно значущим комплексам.

Викликають туберкульоз види мікобактерій об'єднані в комплекс М. Tuberculosis, що включає М. Tuberculosis, М. Bovis. М. Bovis BCG, М. Africanum, М. Microti, М. Canettii. Останнім часом до нього віднесені М. Pinnipedii, М. Сарган, філогенетично мають відношення до М. Microti і М. Bovis.

Решта мікобактерії, що викликають різні мікобактеріози, віднесені до групи нетуберкульозних мікобактерій. З цієї групи виділяють наступні комплекси: М. Avium, що складається з М. Avium, М. Intracellulare, М. Scrofulaceum; M.fortuitum включає підвиди M.fortuitum і М. Chelonae, і М. Terrae, що включає М. Terrae, М. Triviale і М. Nonchromogenicum. Найважливіші групи складають збудники прокази М. Leprae, а також збудники виразкових поразок Buruli М. Ulcerans.

Така класифікація об'єднує види мікобактерій з однаковою клінічною значимістю, коли тонша їх диференціація несуттєва. Для ідентифікації видів всередині груп і комплексів використовують біологічні, біохімічні та молекулярні методи.

Класифікація нетуберкульозних мікобактерій на основі культуральних відмінностей була розроблена Раньон в 1959 р Відповідно до неї. Виділяють 4 групи мікобактерій.

Група I - фотохромогенние мікобактерії

До цієї групи відносять мікобактерії, що не пігментовані при вирощуванні про темряву, але набувають яскраво-жовту або жовто-помаранчеву пігментацію після витримування на світлі. Потенційно патогенні штами, які стосуються цій групі. - М. Asiaticum, М. Kansasii, М. Marinum, М. Simiae. Серед мікобактерій цієї групи є як швидкорослі (М. Marinum), так і повільно зростаючі (М. Asiaticum, М. Kansasii). Оптимальна температура росту варіює від 25 ^про С для М. Simiae, 32-33 ^про З для М. Marinum до 37 ^про З для М. Asiaticum.

Найбільшу клінічну значимість в нашій країні має вигляд М. Kansasii, зустрічається в водоймах. Штам М. Kansasii (М. Luciflavum) викликає захворювання у людей. На яєчної середовищі росте у вигляді шорсткуватих або гладких колоній, температурний оптимум 37 ^про С. Морфологічно бактерії помірної довжини. На сьогоднішній день описані 2 варіанти М. Kansasii: помаранчевий і білий. При введенні морським свинкам М. Kansasii викликають інфільтрати і ущільнення регіональних лімфатичних вузлів.

Група II - скотохромогенние мікобактерії (від грецького слова scotos - темрява)

До цієї групи відносять мікобактерії, що утворюють пігмент в темряві. Швидкість зростання 30-60 днів. У цю групу входять М. Aquae (М. Gordonae) і М. Scrofulaceum.

М. Scrofulaceum відносять до потенційно патогенним видам. На яєчної середовищі бактерії цього виду ростуть у вигляді гладких або шорстких колоній оранжевого кольору. Морфологічно мікобактерії мають паличкоподібну форму, короткі або довгі. Ростуть при температурі 25-37 ^про С. У дітей викликають ураження лімфатичних вузлів і легких.

М. Aquae (М. Gordonae) відносять до сапрофітним скотохромогенним мікобактерій. На яєчної середовищі ростуть у вигляді помаранчевих колоній при температурі 25-37 ° С. Морфологічно мікобактерії палочковидной форми і помірної довжини (> 5 мкм). Виявлено в водоймах.

Група III - нефотохромогенние мікобактерії

До цієї групи відносять мікобактерії, що не утворюють пігмент або мають блідо-жовте забарвлення, яка не підсилюється на світлі. Ростуть протягом 2-3 або 5-6 тижнів. До них відносять. М. Avium, М. Intracellulare, М. Xenopi, М terrae, М. Gastri, М. Hattey, М. Bruiiense.

М. Avium (мікобактерії пташиного типу) ростуть на середовищі Левенштейна-Йенсена у вигляді пігментованих або слабопигментированние колоній при 37 ^про С і 45 ^про С. Морфологічно - це палички, що мають середню довжину. Вони можуть бути патогенні для людини і ряду лабораторних, а також домашніх тварин (наприклад, свиней). Виявлено в воді та грунті.

М. Xenopi виділена від жаби. Молоді культури ростуть у вигляді непігментовані колоній. Пізніше з'являється пігмент жовтого кольору. Морфологічно - довгі ниткоподібні палички. Ростуть при температурі 40-45 ^про С. Умовно патогенні для людини.

М. Terrae вперше були виділені з редьки. Ростуть на середовищі Левенштейна-Йенсена та вигляді безпігментні колоній. Оптимум зростання 37 ^про С. Морфологічно представлені паличками помірної довжини, сапрофіти.

Група IV - швидкозростаючі мікобактерії

Мікобактерії, що відносяться до цієї групи, характеризуються швидким ростом (до 7-10 днів). Ростуть у вигляді пігментних або безпігментні колоній, частіше у вигляді R-форми. Хороший зростання дають протягом 2-5 днів при температурі 25 ^про С. До цієї групи відносять потенційно патогенні мікобактерії M.fortuitum, а також сапрофітні мікобактерії, такі, як М. Phlei, М. Smegmatis і ін. M. Fortuitum дає видимий зростання на яєчної середовищі на 2-4-й день у вигляді «розетки». Морфологічно мікобактерії представлені короткими паличками. На середовищі Левенштейна-Йенсена можуть поглинати малахітову зелень і фарбуватися в зелений колір. Широко поширені в природі.

Класифікація за Раньон виявилася дуже зручною для проведення ідентифікації найбільш часто зустрічаються видів мікобактерій. Однак виявлення нових видів і поява все більшого числа проміжних форм мікобактерій викликає труднощі в їх реєстрації в тій чи іншій групі Раньон.

М. Tuberculosis - молоде еволюційне утворення. Останнім часом простежується тенденція до поділу М. Tuberculosis на кластери або сімейства. Найбільш важливими можна вважати штами, що відносяться до сімейства Beijing, що відрізняються клональний поведінкою і здатністю викликати мікроспалахи туберкульозу.

Морфологія мікобактерій

Мікобактерії - тонкі паличкоподібні клітини з характерним властивістю кислото і спиртостійкі (на одній зі стадій зростання), аеробні. При фарбуванні за Грамом слабо грамположительни. Мікобактерії нерухомі, спор не утворюють. Конідії або капсули відсутні. Ростуть на щільних поживних середовищах повільно або дуже повільно: при оптимальній температурі видимі колонії з'являються через 2-60 діб. Колонії рожеві, помаранчеві або жовті, особливо при зростанні на світлі. Пігмент НЕ дифундує. Поверхня колоній зазвичай матова (S-тип) або шорстка (R-тип). Нерідко мікобактерії ростуть у вигляді слизових або зморшкуватих колоній. На рідких середовищах мікобактерії ростуть на поверхні. Ніжна суха плівка з часом потовщується, стає бугристо-зморшкуватою і знаходить жовтуватий відтінок. Бульйон залишається прозорим і домогтися дифузного росту вдається в присутності детергентів. У мікроколонії М. Tuberculosis (тобто на ранніх термінах) утворюються структури, що нагадують джгути - ознака, який пов'язують з корд-фактором.

При фарбуванні карболовим фуксином мікобактерії туберкульозу виявляються у вигляді тонких, злегка вигнутих паличок малиново-червоного кольору, що містять різну кількість гранул.

Довжина мікобактерій становить приблизно 1-10мкм. А ширина - 0.2-0.7 мкм. Іноді можна виявити вигнуті або звиті варіанти. Мікроорганізми, розташовані поодинці, парами або у вигляді груп, добре виділяються на блакитному тлі інших компонентів препарату. Нерідко бактеріальні клітини можуть розташовуватися у вигляді римської цифри «V».

У препараті можна виявити також змінені кокковидной кислотостійкі форми збудника, округлі сферичні або міцеліеподобние структури. В цьому випадку позитивну відповідь повинен бути підтверджений додатковими методами.

Будова клітинної стінки мікобактерій

Клітинна стінка мікобактерій - найскладніша в порівнянні з іншими прокариотами.

У той час як грамнегативні бактерії мають дві мембрани, клітинна стінка мікобактерій складається з декількох шарів, частина з яких містить цукру і характеризується відносно постійним складом. Зовнішні шари мають мінливий хімічний склад і в основному представлені ліпідами, більшість з яких - міколових кислоти і їх похідні. Як правило, ці шари не видно при електронній мікроскопії. Первинним каркасом клітинної стінки служать перехресно пов'язані пептидоглікани - електронноплотний шар. Шар арабіногалактанов повторює шар пептідогліканов, утворюючи полисахаридную строму клітинної стінки. Він має точки зв'язку з пептидоглікановому шаром і структури для кріплення міколових кислот і їх похідних.

Міколових кислоти присутні у вигляді вільних сульфоліпіди і корд-фактора, з наявністю якого на поверхні клітин пов'язано характерне утворення колоній М. Tuberculosis у вигляді джгутів. Унікальність і ключова роль міколових кислот в структурній організації і фізіології мікобактерій роблять їх відмінною мішенню для етіотропної терапії.

Шар гликолипидов називають «мікозідамі» і іноді порівнюють з мікрокапсул. Мікозіди структурно і функцій нально нагадують ліпополісахариди зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій, але позбавлені їх агресивності, проте вони токсичні і (подібно корд-фактору і сульфоліпіди) викликають утворення гранульом.

Клітинна мембрана і шари клітинної оболонки пронизані каналами або порами, серед яких можна виділити пасивні пори з малим часом життя, що забезпечують керовану дифузію речовин, і канали з більш тривалим часом життя, що забезпечують енергозалежний транспорт речовин.

Ще одним компонентом клітинної стінки мікобактерій є ліпоарабіноманнан. Він заякорити на плазматичній мембрані, пронизує клітинну стінку і виходить на її поверхню. В цьому відношенні він схожий на ліпотейхоевая кислоти грампозитивних бактерій або ліпополісахаридний О-антиген грамнегативнихбактерій. Термінальні фрагменти ліпоарабіноманнана, перш за все його маннозние радикали, неспецифічно пригнічують активацію Т-лімфоцитів і лейкоцитів периферичної крові. Це призводить до порушення імунної відповіді на мікобактерії.

Мінливість і форми існування мікобактерій

Персистенція бактерій має особливе патогенетичне значення. Лабораторні експерименти, що проводилися in vitro і in vivo, показали, що бактерицидні препарати ізоніазид і піразинамід вбивають мікобактерії тільки в фазі розмноження. Якщо ж мікобактерії знаходяться в фазі низької метаболічної активності (тобто бактеріальний зростання майже повністю припинений і бактерії можна назвати «дрімають»), бактерицидні препарати на них не діють. Такий стан прийнято називати дормантним, а мікроорганізми - персістерамі. Персістери не чутливі до хіміопрепаратів, тобто поводяться як стійкі мікроорганізми. Насправді вони можуть зберігати чутливість до лікарських засобів.

Потужним стимулом для переходу клітин мікобактерій в дормантное стан є хіміотерапевтичні препарати, а також фактори імунної системи господаря. Персістери здатні зберігатися в осередках ураження місяцями або навіть роками. Під час персистенції мікобактерії можуть трансформуватися в L-форми. У цьому виді мікобактерії виявляють вкрай низьку метаболічну активність, спрямовану в першу чергу на збільшення товщини клітинної стінки і позаклітинного матриксу, що перешкоджає простої дифузії речовин. Крім того, в микобактериях відбувається накопичення генетичного матеріалу, що дозволяє збільшити ймовірність відтворення нормально функціонуючої клітини при настанні сприятливих умов. Виявлення L-форм стандартними мікробіологічними методами утруднено.

Якщо дрімаючі мікобактерії знову набувають метаболічну активність і починають розмножуватися під час проведення хіміотерапії, вони швидко гинуть. Якщо ж хіміотерапія завершена, такі «ожилі» мікобактерії продовжують розмножуватися і викликають рецидив захворювання. Цим пояснюють виправданість тривалих курсів хіміотерапії та застосування наступних коротких профілактичних. Як правило сезонних, курсів хіміопрофілактики.

Фізіологія мікобактерій

У царстві прокаріотів мікобактерії є безсумнівними лідерами в області синтезу складних органічних сполук. Ймовірно, вони мають найгнучкішим метаболізмом, що забезпечує необхідну мінливість для виживання як у зовнішньому середовищі, так і в макроорганизме. На сьогоднішній день описані понад 100 ферментативних реакцій, що показують розгалужений і складний характер метаболізму мікобактерій. Для синтезу кінцевих сполук чи забезпечення необхідних фізіологічних функцій в микобактериях можуть здійснюватися паралельні метаболічні шляхи в залежності від доступності субстрату, хімічного оточення, забезпеченості дихальних циклів необхідними компонентами (іони металів, парціальний тиск кисню, вуглекислого газу та ін.).

Біохімічні властивості мікобактерій

[5], [6], [7], [8], [9], [10]

Метаболізм ліпідів

Ліпіди клітинної стінки, що становлять до 60% сухої маси клітини, визначають нестандартність тинкторіальних, фізіологічних і екологічних властивостей мікобактерій.

Описані до теперішнього часу специфічні ліпіди мікобактерій по структурним ознаками ділять на 7 основних груп:

1. жирнокислотного похідні вуглеводів (головним чином, трегалози - корд-фактор):
2. маннозіди фосфатіділміоінозіта:
3. жирнокислотного похідні пептидів;
4. глікозиди N-ацілпептідов - мікозіди С;
5. жирнокислотного ефіри фтіоцеролов;
6. мікозіди А, В. G;
7. міколати гліцерину.

Ліпіди груп 4-6 знайдені тільки в микобактериях.

Серед унікальних слід зазначити туберкулостеаріновую і туберкулопальмітіновую кислоти, які є попередниками міколових кислот.

Міколових кислоти - група високомолекулярних жирних кислот з довжиною ланцюга до 84 вуглецевих атомів, структура основному ланцюзі яких визначається систематичним положенням мікроорганізму і умовами його зростання. Їх низька реакційна здатність забезпечує високу хімічну стійкість клітинної стінки мікобактерій. Міколати пригнічують ферментні розщеплення клітинної стінки і вільнорадикальні реакції.

Корд-фактор відносять до 1-й групі ліпідів. З ним пов'язують високу токсичність мікобактерій і вірулентність.

Поверхнево-активні ліпіди, або сульфоліпіди, грають важливу роль у внутрішньоклітинної адаптації мікобактерій. Разом з корд-фактором вони утворюють цитотоксичні мембранотропні комплекси.

Ліпоарабіноманнан представляє собою гетерогенну суміш високомолекулярних липополисахаридов: розгалужені полімери Арабіноза і манози з діацілгліцеріновимі похідними пальмітинової і туберкулостеаріновой кислот.

Мікозіди З представляють собою пептідогліколіпіди. Утворюють зовнішню оболонку мікобактерій, яку можна спостерігати при електронній мікроскопії у вигляді прозорої зони на периферії клітин. Мікозіди - видоспецифічі з'єднання. Від їх типу залежать антигенні властивості мікобактерій.

Кількісний та якісний склад ліпідних сполук мікобактерій має динамічний характер і залежить від віку клітин, складу поживних середовищ, фізико-хімічних характеристик навколишнього середовища. Молоді клітини мікобактерій починають формувати клітинну стінку з синтезу ліпополісахаридів з відносно короткими аліфатичними ланцюгами. На цій стадії вони досить вразливі і доступні для імунної системи. У міру нарощування клітинної стінки і формування високомолекулярних ліпідів мікобактерії набувають стійкості і індиферентність у взаєминах з імунною системою.

Метаболізм вуглеводів

Найкращим джерелом вуглецю для мікобактерій є гліцерин.

Найважливіші вуглеводи - арабиноза. Манноза і мальтоза - складають більше половини всіх сахаридов. Крім того, в життєдіяльності клітини відіграють роль трегалоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, Рамноза і деякі інші цукри. При цьому синтез йде по гідролазних і альдолазному шляхах. Піруватний шлях використовується для синтезу глікогену. Арабиноза і манноза беруть участь в утворенні важливих структурний з'єднань. Для отримання енергії використовується пентозофосфатний шлях окислення глюкози. Він забезпечується ферментами малат-, ізоцітрат- і сукцінат- дегідрогеназ, що надає гнучкість дихальній системі.

Унікальний гліоксилатний шлях, який мікобактерії використовують для залучення в цикл трикарбонових кислот вільних жирних кислот, які накопичуються в процесі росту мікобактерії. Цей цикл привертає увагу дослідників як можливий механізм хемотаксиса мікобактерій під час персистенції.

Метаболізм азоту і амінокислот

Швидкість утилізації мікобактеріями нітратів, нітритів, гідроксиламін може служити для ідентифікації видів. Як джерело азоту мікобактерії воліють аспарагин. Синтез амінокислот є енергозалежною процесом і забезпечується групою ферментів, що дозволяють використовувати інші амінокислотні з'єднання, наприклад, глутамат.

Нітрит і нітратредуктазная активність

Мікобактерії туберкульозу можуть утворювати аденозинтрифосфат (АТФ) при перенесенні електронів по ланцюгу переносників, що кінчається NО ₃ -, а не Про ₂ В цих реакція відбувається відновлення NО ₃ до NH ₃ в кількостях, які необхідні для синтезів амінокислот, пуринових і піримідинових основ. Це здійснюється за допомогою послідовного дії нітрат-і нітритредуктази.

Каталазна і пероксидазна активність

Каталаза запобігає накопиченню перекису водню, що утворюється при аеробному окисленні відновлених флавопротеїдів. Активність ферменту залежить від pH середовища і температури. При температурі 56 ° С каталаза не активна. Існують тести на приналежність до патогенного комплексу мікобактерій, засновані на термолабильности каталази.

Відомо, що 70% штамів мікобактерій туберкульозу, стійких до ізоніазиду, втрачає свою каталазну і Пероксидазну активність.

Пероксидазна і каталазная активність здійснюється одним і тим же ферментним комплексом.

[11], [12], [13], [14], [15]

Вітаміни та коферменти

До складу М. Tuberculosis входять вітаміни групи В (рибофлавін, піридоксин. Цианокобаламин, тіамін), вітаміни С і К. Парааминобензойная кислота, пантотенова і нікотинова кислоти, біотин і фолієва кислота.

Обмін речовин, харчування і дихання мікобактерій

У звичайних, сприятливих, умов мікобактерії туберкульозу - строгі аероби і мезофіли, тобто вони ростуть при наявності кисню і в діапазоні температур 30-42 ^про З, найкраще при 37 ^про С. При несприятливих зовнішніх умовах і (або) недостатності кисню мікобактерії туберкульозу виявляють себе як мікроаерофіли і навіть як анаероби. При цьому їх обмін речовин істотно змінюється.

За споживанням кисню і розвиненості оксидазний систем мікобактерії схожі з істинними грибами. В як сполучна ланка між НАДН-дегідрогеназ і цитохромом b в переносить системі роду Mycobacterium служить вітамін К ₉. Ця система цитохромів нагадує мітохондріальну. Вона чутлива до Дінітрофенол, так само як і у вищих організмів.

Описаний тип дихання не єдине джерело утворення АТФ. Крім Про ₂ -термінальной. Мікобактерії можуть використовувати дихальні ланцюги, які переносять електрони і закінчуються нітратами (NО ₃ ^- ). Резервом дихальної системи мікобактерій є гліоксилатний цикл.

Бескислородное (ендогенне) дихання, що виявляється в атмосфері з концентрацією кисню менше 1%, стимулюють азідние з'єднання, які зменшують окислення пірувату або трегалози.

Зростання і розмноження мікобактерій

Мікобактерії туберкульозу розмножуються вкрай повільно: період подвоєння 18-24 год (звичайні бактерії діляться кожні 15 хв). Тому для отримання видимого росту типових колоній потрібно не менше 4-6 тижнів. Однією з причин повільного розмноження мікобактерій вважають їх виражену гідрофобність яка ускладнює дифузію поживних речовин. Більш ймовірно, що це генетично детерміноване і пов'язане з більш складним пристроєм мікобактерій. Відомо, наприклад, що більшість бактерій має безліч копій оперона рібосомалиюй рибонуклеїнової кислоти (рРНК). Повільно зростаючі мікобактерії (М. Tuberculosis, М. Leprae) мають по одній копії оперона, а швидкозростаючі (М. Smegmatis) - лише дві копії.

При культивуванні на рідких середовищах мікобактерії ростуть на поверхні. Ніжна суха плівка з часом потовщується, стає бугристо-зморшкуватою і знаходить жовтуватий відтінок, часто порівнюваний з кольором слонової кістки. Бульйон залишається прозорим, і домогтися дифузного росту вдається тільки в присутності детергентів, наприклад твін-80. У мікроколонії (тобто на ранніх термінах) утворюються структури, що нагадують джгути, - ознака, який пов'язують з корд-фактором М. Tuberculosis.

Генетика мікобактерій

Рід мікобактерій з генетичної точки зору дуже різноманітний. На відміну від багатьох сапрофітних і нетуберкульозних мікобактерій мікобактерії туберкульозу не містять екстрахромосомних включень (наприклад, плазмід). Все розмаїття властивостей мікобактерій туберкульозу визначається її хромосомою.

Геном М. Tuberculosis complex надзвичайно консервативний. Його представники мають гомології ДНК на рівні 85-100%. В той час як ДНК інших видів мікобактерій гомологични М. Tuberculosis лише на 4-26%.

Представники роду мікобактерій мають в порівнянні з іншими прокариотами великі геноми - 3,1-4,5x10 ⁹ Так. Проте геноми патогенних видів менше, ніж у інших мікобактерій (у М. Tuberculosis - 2,5x10 ⁹ Так). У класичного збудника туберкульозу людини, М. Tuberculosis, більше генів, ніж у М. Africanum і М. Bovis, які втратили частину генетичного матеріалу в ході еволюції.

У 1998 р була опублікована нуклеотидних послідовність хромосоми штаму H37Rv М. Tuberculosis. Її протяжність - 4 411529 пар основ. Хромосома мікобактерії туберкульозу є кільцеву структуру. В її складі визначено близько 4000 генів, що кодують білки, а також 60. Кодують функціональні компоненти РНК: унікальний рибосомальних РНК-оперон, 10Sa РНК. Бере участь в деградації білків з нетиповою матричної РНК. 45 транспортних РНК (тРНК), більше 90 ліпопротеїнів.

Більше 20% генома займають гени метаболізму жирних кислот клітинної стінки, в тому числі міколових кислот, багатих гліцином кислих поліпептидів (сімейства РЕ і рре), кодованих поліморфними ділянками генома PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) і MPTR (Major polymorphic tandem repeat) , відповідно (п'яте і четверте кільця геномної хромосомної карти). Варіабельність цих ділянок геному забезпечує відмінності антигенів і здатність пригнічувати імунну відповідь. У геномі мікобактерії туберкульозу широко представлені гени, які контролюють фактори вірулентності.

Мікобактерії туберкульозу синтезують всі необхідні для обміну компоненти: незамінні амінокислоти, вітаміни, ферменти і кофактор. У порівнянні з іншими видами бактерій у М. Tuberculosis підвищена активність ферментів липогенеза. Два гени кодують гемоглобінподобние білки, які відіграють роль антиокисних протекторів або пасток надлишку клітинного кисню. Ці особливості сприяють швидкій адаптації мікобактерій туберкульозу до різких змін умов навколишнього середовища.

Особливість геному М.tuberculosis complex - велике число повторюваних послідовностей ДНК. Так. В хромосомі М. Tuberculosis H37Rv налічують до 56 копій IS-елементів (insertion sequences - вбудовується послідовностей), які забезпечують ДНК-поліморфізм мікобактерій туберкульозу. Більшість з них. За винятком елемента IS6110. Незмінні. У складі хромосоми різних штамів мікобактерій туберкульозу, як правило, присутня від 5 до 20 копій IS6110, проте зустрічаються штами, які не мають даного елемента. Поряд з IS-елементами геном містить кілька типів коротких повторів нуклеотидів (PGRS і MPTR), а також прямі повтори DR (Direct Repeat), що знаходяться в DR-області і розділені варіабельними послідовностями - спейсерами (шосте кільце на карті хромосоми). Відмінності в кількості копій і локалізації на хромосомі цих генетичних елементів використовують для диференціації штамів мікобактерій туберкульозу в молекулярної епідеміології. Найбільш досконалі схеми генотипування мікобактерій засновані на виявленні геномного поліморфізму, обумовленого елементом IS6110, а також DR і їх спейсерами. Характерно, що дивергенція виду М. Tuberculosis відбувається, як правило, за рахунок рекомбінації між копіями елемента IS6110. Які фланкують різні гени.

У геномі H37Rv знайдені два профага - phiRv1 і phiRv2. Як і поліморфний сайт Dral вони. Ймовірно, асоційовані з факторами патогенності, оскільки саме ці ділянки генома відрізняються від аналогічних ділянок авірулентних штамів М. Tuberculosis H37Ra і М. Bom BCG, Визначено ділянки геному (mutT, ogt-genes), що відповідають за збільшення частоти мутацій і адаптацію мікобактерій туберкульозу в пресових умовах. Виявлення тригерних генів дормантності мікобактерій туберкульозу змінило уявлення про латентної туберкульозної інфекції.

Вивчення поліморфізму генів, що кодують каталазу, пероксидазу і А-субодиницю ДНК-гірази. У М. Tuberculosis complex були виділені три генотипические групи. Найбільш давня (з точки зору еволюції) I група: М. Аfricanum, М. Bovis. М. Tuberculosis і М. Microti. II і III групи включають різні штами М. Tuberculosis, які поширені в деяких географічних регіонах. Клональне поведінка характерна для I і II груп, а штами III групи вкрай рідко викликають масові захворювання. У різних регіонах світу поширені генетичні сімейства М. Tuberculosis, що одержали назви Haarlem. Africa, Filipino.

Особливе місце займає сімейство Beijing, вперше виявленого в гістологічних препаратах легеневої тканини 1956-1990 рр. Від хворих передмістя Пекіна. На сьогоднішній лінь штами цього сімейства виявлені в державах Азії. Південної Африки, країнах Карибського басейну, США. Поширення даного генотипу на різних територіях визначається етнічними характеристиками корінного населення та мігрантів. Нещодавно отримані дані про поширення штамів генотипу SI / Beijing на північному заході європейської частини Росії (Санкт-Петербург) і в регіонах Сибіру.

Стійкість мікобактерій

В ході еволюції мікобактерії туберкульозу виробили різні механізми подолання або інактивації несприятливих факторів зовнішнього середовища. По перше. Це потужна клітинна стінка. По-друге, це великі метаболічні можливості. Вони здатні інактивувати багато клітинні токсини і речовини (різні перекису, альдегіди та інші), що руйнують клітинну оболонку. По-третє, це морфологічна пластичність, яка полягає в трансформації мікобактерій (утворення L-форм. Дормантним клітин). За своєю стійкості, після спороутворюючих бактерій, вони займають лідируюче місце в царстві прокаріотів.

Збудник зберігає свою життєздатність в сухому стані до 3 років. При нагріванні мікобактерії туберкульозу можуть витримувати температуру істотно вище 80С. На сьогоднішній день вважають, що мікобактерії туберкульозу, що знаходяться в мокроті, залишаються життєздатними при відкритому кип'ятінні останньої в межах 5 хв.

Мікобактерії туберкульозу стійкі до органічних і неорганічних кислот, лугів, багатьом окислювача, а також до ряду антисептичних і дегидратирующих речовин, що надають згубну дію на інші патогенні мікроорганізми. Мікобактерії проявляють стійкість до впливу спиртів і ацетону.

Відзначено, що засоби на основі четвертинного амонію не виявляють протитуберкульозної активності В певних умовах концентрації радикалів хлору і кисню до 0,5% також не роблять згубного дії на мікобактерії туберкульозу. Це має на увазі неможливість використання подібних засобів для стерилізації мокротиння та інших інфікованих біологічних матеріалів.

Мікобактерії туберкульозу нечутливі до розсіяного сонячного світла і можуть більше року існувати у зовнішньому середовищі без втрати життєздатності. Короткохвильове ультрафіолетове вивчення надає універсальне бактерицидну дію на всі мікроорганізми. Однак в реальних умовах, коли мікобактерії туберкульозу знаходяться в підвішеному стані у вигляді клітинних агломератів з пиловими частинками, їх стійкість до ультрафіолетового випромінювання зростає.

Висока виживаність мікобактерій туберкульозу сприяє надзвичайно широкому поширенню цієї інфекції серед населення незалежно від кліматичних умов. Однак не тільки це сприяє глобалізації проблеми - мікобактерії туберкульозу можуть тривалий час персистувати в організмі людини і ре через необмежені проміжки часу.

Локалізація мікобактерії туберкульозу всередині макрофагів забезпечує, достатню субстратную стабільність, враховуючи «довгожительство» фагоцитів і тривалість реплікації мікобактерій, а також ізоляцію від ефекторів гуморального імунітету. У той же час збудник вибирає біотоп, який через потенційну небезпеку неприйнятний для більшості мікроорганізмів. Цей симбіоз забезпечується цілим рядом пристосувальних механізмів мікобактерій.

Процес ураження макрофагів і паразитування в ньому виглядає наступним чином: проникнення мікобактерій в макрофаг без його активації; придушення утворення фаголізосом або трансформація їх в зону, комфортну для бактерій; прорив з фагосом в цитоплазму з інактивацією антимікробних факторів; втручання в життєдіяльність клітини; ослаблення чутливості макрофагів до активує сигналам Т-лімфоцитів; зниження антігенпредставляющіе функції макрофагів і поєднане з цим ослаблення реакцій цитотоксичних Т-лімфоцитів, налаштованих на знищення заражених клітин.

Безумовно, в забезпеченні цього важливу роль відіграють особливості клітинної стінки. А також метаболічні і функціональні можливості. При першому контакті з мікобактеріями імунні системи макроорганізму не здатні підключити гуморальний імунітет, швидко знешкодити і елімінувати клітку з організму, так як рухомі алифатические ланцюга мікобактеріальній стінки не дають можливості провести оцінку поверхневих структур збудника і передати відповідну інформацію для синтезу необхідного набору антитіл.

Висока гідрофобність мікобактерій забезпечує неспецифічні, тобто незалежні від рецепторів, контакти з макрофагами. Утворюючи навколо клітини мікобактерії фагосому, макрофаг поміщає її в собі. Поверхневі мікозідние і ліпоарабіноманнановие комплекси можуть розпізнаватися рецепторами, однак запускаються через них сигнали активують або слабо активують макрофаги. Внаслідок цього фагоцитоз не супроводжується виділенням вільнорадикальних форм кисню та азоту. Вважають, що в більшій мірі це характерно для вірулентних штамів М. Tuberculosis, які завдяки структурним особливостям ліпоарабіноманнана, ініціюють «неагресивний» фагоцитоз. У розпізнаванні М. Tuberculosis беруть участь і інші рецептори макрофагів, зокрема CD 14 і рецептори СЗ-компонента комплементу (CR1-CR3).

Проникнувши всередину макрофагів, мікобактерія включає ряд механізмів, що перешкоджають утворенню фаголізосоми: продукування амонію, який защелачівает середу всередині фагосоми, синтез сульфоліпіди, що веде до формування негативного заряду на поверхні фагосоми. Що перешкоджає злиттю фагосоми і лізосоми.

Якщо все ж фаголізосоми утворилася, мікобактерія завдяки потужній воскової оболонці здатна погасити вільнорадикальні реакції, викликані бактерицидними речовинами фагоцитів. Амоній защелачівает середу, блокуючи активність лізосомальних ферментів, а сульфоліпіди нейтралізують мембранотропні катіонні білки. Крім того, мікобактерії туберкульозу продукують високоактивні ферменти з каталазной і пероксидазною активністю, які конкурують з пероксидазного системами макрофагів, і одночасно інактивують гідропероксид лізосом Все це підвищує стійкість мікобактерій до оксидантного стресу.

Подальша адаптація мікобактерій полягає у використанні залізовмісних з'єднанні макрофагів для своїх ферментних систем і блокування іммуноспеціфіческіх функцій макрофагів. Макрофаги є одним з головних резервуарів заліза, надлишок якого накопичується у вигляді феритину. Вміст заліза в альвеолярних макрофагах в 100 разів вище, ніж в моноцитах крові, що, безумовно, сприяє їх колонізації мікобактеріями туберкульозу.

Токсична дія на макрофаги мікобактерії здійснюють за допомогою ендотоксинів і неспецифічних факторів. І ті, і інші вражають в першу чергу дихальну систему макрофагів - мітохондрії. До ендотоксинів відносять міколових арабіноліпіди, які пригнічують дихання мітохондрій. До неспецифічним токсинів відносять продукти синтезу ліпідної частини клітини мікобактерії - фтіеновие і фтіоновие кислоти, які викликають роз'єднання окисного фосфорилювання. Посилення метаболічних процесів в цих умовах не супроводжується належним синтезом АТФ. Клітини господаря починають відчувати енергетичний голод, що призводить до пригнічення їх життєдіяльності, а в подальшому до цитолизу і апоптозу.

Не виключено, що деякі фактори патогенності утворюються тільки всередині заражених клітин, як це відбувається в інших бактерій, що вважають за краще внутрішньоклітинний спосіб життя. Наприклад, сальмонели, паразитуючи всередині макрофагів, додатково експресують більше 30 генів. Незважаючи на повний опис генома мікобактерії туберкульозу. 30% кодонів мають відношення до білків з невідомими властивостями.

Лікарська стійкість мікобактерій

З клінічної точки зору лікарська чутливість мікроорганізму визначає можливість застосування стандартної хіміотерапії показаним препаратом для лікування захворювання, викликаного виділеним штамом. Стійкість «пророкує невдачу лікування тестованим хіміопрепаратом». Іншими словами, використання стандартної хіміотерапії, що приводить до досягнення системної концентрації препарату, зазвичай ефективної в нормальних умовах, не пригнічує розмноження «стійких мікроорганізмів».

У мікробіології в основі визначення лікарської чутливості або лікарської стійкості лежить популяційний підхід, що припускає різну ступінь стійкості пулу (різнорідної сукупності) мікробних клітин. Лікарську стійкість оцінюють в кількісних характеристиках, таких, як «мінімальна інгібуюча концентрація» (МІК). Наприклад, при МІК-90 гине 90% мікроорганізмів (бактеріостатична концентрація). Таким чином, під резистентністю слід розуміти її ступінь у частині мікробної популяції, яка зумовлює невдачу лікування в більшості випадків. Загальноприйнято, що 10% стійких штамів серед всієї мікробної популяції хворого здатне надати патогенну дію. У фтізіобактеріологіі для протитуберкульозних препаратів першого ряду вона становить 1%. Або 20 колонієутворюючих одиниць - КУО). Така частина мікробної популяції через місяць здатна витіснити вихідну і сформувати вогнище ураження. Для протитуберкульозних препаратів другого ряду критерієм стійкості служить 10% зростання мікробної популяції.

Розвиток лікарської стійкості мікроорганізмів пов'язане з селекцією (відбором) в присутності антибіотика і з переважним виживанням частини мікробної популяції, що має механізми захисту проти антибактеріального агента. У кожній популяції знаходиться незначна кількість мутантних клітин (як правило, 10 ⁶ -10 ⁹ ), резистентних до того чи іншого препарату. При проведенні хіміотерапії гинуть чутливі мікробні клітини, а резистентні розмножуються. В результаті відбувається заміщення чутливих клітин стійкими.

Мікобактерії початково мають високу природну стійкість до багатьох антибактеріальних препаратів широкого спектра дії, проте у різних видів - різні спектр і ступінь цієї чутливості.

Під істинної природною стійкістю розуміють постійний видовий ознака мікроорганізмів, пов'язаний з відсутністю мішені дії антибіотика або недоступністю мішені внаслідок первинно низької проникності клітинної стінки, ферментативної інактивації речовини або інших механізмів.

Придбана стійкість - властивість окремих штамів зберігати життєздатність при тих концентраціях антибіотиків, які пригнічують ріст основної частини мікробної популяції. Придбання резистентності у всіх випадках зумовлено генетично: появою нової генетичної інформації або зміною рівня експресії власних генів.

В даний час виявлено різні молекулярні механізми стійкості мікобактерій туберкульозу:

• інактивація антибіотиків (інактивація ферментації), наприклад, β-лактамазами;
• модифікація мішені дії (зміна просторової конфігурації білка внаслідок мутації відповідного ділянки геному):
• гиперпродукция мішені, що приводить до зміни співвідношення агент-мішень і вивільненню частини білків життєзабезпечення бактерії;
• активне виведення препарату з мікробної клітини (Еффлюкс) внаслідок включення стресових механізмів захисту:
• зміна параметрів проникності зовнішніх структур мікробної клітини, які блокують здатність антибіотика проникати всередину клітини;
• включення «метаболічного шунта» (обхідного шляху обміну).

Крім прямого впливу на метаболізм мікробних клітин, багато антибактеріальні препарати (бензилпеніцилін. Стрептоміцин, рифампіцин) і інші несприятливі фактори (біоциди імунної системи) призводять до появи змінених форм мікобактерій (протопластів, L-форми). А також переводять клітини в дормантное стан: інтенсивність обміну клітини знижується і бактерія стає несприйнятливою до дії антибіотика.

Всі механізми формують різну ступінь стійкості, забезпечуючи резистентність до різних концентрацій хіміопрепаратів, тому поява у бактерій стійкості не завжди супроводжується зниженням клінічної ефективності антибіотика. Для оцінки ефективності та прогнозу лікування важливо знати ступінь резистентності.

В даний час для кожного протитуберкульозного препарату першого ряду і для більшості резервних препаратів визначено хоча б один ген. Специфічні мутації в якому призводять до розвитку стійких варіантів мікобактерій. У широкому поширенні лікарської стійкості у мікобактерій має значення висока частота мутацій in vivo, велика, ніж in vitro.

[16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25],

Види лікарської стійкості мікобактерій

Розрізняють первинну і придбану лікарську стійкість. До мікроорганізмів з первинної стійкістю відносять штами, виділені від пацієнтів, які не отримували специфічну терапію або отримували препарати протягом місяця або менше. При неможливості уточнення факту застосування протитуберкульозних препаратів використовують термін «початкова стійкість».

Первинна лікарська стійкість має велике клінічне та епідеміологічне значення, тому для правильної її оцінки необхідно не проводити вперше виявленому хворому на туберкульоз хіміотерапію до мікробіологічного дослідження діагностичного матеріалу. Частоту первинної лікарської стійкості розраховують як відношення кількості вперше виявлених хворих на туберкульоз з первинної резистентністю до числа всіх вперше виявлених хворих, яким проводили дослідження на лікарську чутливість протягом голи Якщо стійкий штам виділений у пацієнта на тлі протитуберкульозної терапії, що проводиться протягом місяця і більше, стійкість розцінюють як придбану. Частота первинної лікарської стійкості характеризує епідеміологічний стан популяції збудника туберкульозу.

Придбана лікарська стійкість серед вперше виявлених хворих - результат невдалого лікування (невірний підбір препаратів, недотримання режиму прийому, зниження дозувань препаратів, непостійне постачання і погана якість препаратів). Ці фактори призводять до зниження системної концентрації препаратів в крові і їх ефективності, одночасно «запускаючи» в клітинах мікобактерій захисні механізми.

Для епідеміологічних цілей розраховують частоту раніше нелікованих випадків. Для цього в розрахунок беруть хворих, зареєстрованих на повторне лікування після невдалого курсу хіміотерапії або рецидивів. Розраховують відношення кількості резистентних культур мікобактерій туберкульозу до числа всіх штамів, досліджених на наявність лікарської стійкості протягом року серед хворих даної групи на момент їх реєстрації.

У структурі лікарської стійкості мікобактерій туберкульозу розрізняють:

Монорезістентность - стійкість до одного з протитуберкульозних препаратів, чутливість до інших препаратів збережена. При застосуванні комплексної терапії монорезістентность виявляють досить рідко і. Як правило, до стрептоміцину (в 10-15% випадків серед вперше виявлених хворих).

Полірезистентність - стійкість до двох і більше препаратів.

Множинна лікарська стійкість - стійкість до ізоніазиду і рифампіцину одночасно (незалежно від наявності стійкості до інших препаратів). Вона супроводжується, як правило, стійкістю до стрептоміцину і ін. В даний час МЛС збудників туберкульозу стала епідеміологічно небезпечним явищем. Розрахунки показують, що виявлення збудників з МЛС більш ніж в 6,6% випадків (серед вперше виявлених хворих) вимагає зміни стратегії Національної протитуберкульозної програми. За даними моніторингу лікарської стійкості, частота МЛУ серед вперше виявлених хворих становить від 4 до 15%, серед рецидивів - 45-55%, а серед випадків невдалого лікування - до 80%.

Суперстійкі - множинна лікарська стійкість в поєднанні зі стійкістю до фторхінолонів і одному з ін'єкційних препаратів (канаміцин, амікацин, капреоміцин). Туберкульоз, викликаний штамами з суперстійкі, є прямою загрозою для життя пацієнтів, так як інші протитуберкульозні препарати другого ряду не мають вираженого антибактеріальної дії. З 2006 р в деяких країнах організовано спостереження за поширенням штамів мікобактерій з суперстійкі. За кордоном прийнято позначати цей варіант МЛС як XDR.

Перехресна стійкість - коли виникнення стійкості до одного препарату спричиняє стійкість до інших препаратів. У М. Tuberculosis, як правило, асоційовані зі стійкістю мутації не пов'язані. Розвиток перехресної стійкості обумовлено схожістю хімічної структури деяких протитуберкульозних препаратів. Особливо часто перехресну стійкість виявляють всередині однієї групи препаратів, наприклад аміноглікозидів. Для прогнозування перехресної резистентності необхідні дослідження культури мікобактерій на генетичному рівні в поєднанні з мікробіологічними вивченням стійкості.

Нетуберкулезные микобактерии

Нетуберкульозних мікобактерії передаються від людини до людини вкрай рідко. Частота виділення деяких їх видів з матеріалу від хворих порівнянна з частотою виділення цих видів з об'єктів зовнішнього середовища. Джерелами зараження можуть бути сільськогосподарські тварини і птахи, необроблені продукти. Мікобактерії виявляють в послеубойном матеріалі і молоці великої рогатої худоби.

За даними бактеріологічних лабораторій, поширеність нетуберкульозних мікобактерій в 2004-2005 рр. Склала 0.5-6.2% серед всіх мікобактерій у вперше виявлених хворих. Ймовірно, частота може бути трохи вище, так як використовуваний спосіб обробки діагностичного матеріалу не є оптимальним для нетуберкульозних мікобактерій. Сапрофітні мікобактерії можуть бути присутніми в діагностичному матеріалі при недотриманні правил збору, або в силу особливостей матеріалу (наприклад. М. Smegmatis може виділятися з сечі пацієнтів чоловічої статі).

У зв'язку з цим важливо багаторазово підтвердити виявлений виду мікобактерій з матеріалу від хворого.

Мікобактерії вражають шкірні покриви, м'які тканини, а також можуть викликати мікобактеріоз легких, що особливо часто при імунодефіцитних станах. При легеневій локалізації частіше виявляється у чоловіків похилого віку, в анамнезі яких є хронічні легеневі захворювання, в тому числі з грибковими ураженнями.

З усіх мікобактерій комплекс М. Avium-intracellularae є найбільш поширеним збудником микобактериозов легких у людини. Він викликає захворювання легенів, периферичних лімфатичних вузлів і дисеміновані процеси. На півночі європейського регіону близько 60% микобактериозов легких. Переважають фіброзно-кавернозні і інфільтративні процеси, які беруть хронічний перебіг через високу резистентності до протитуберкульозних препаратів.

М. Kansasii є збудниками хронічного захворювання легенів, що нагадує туберкульоз. Хіміотерапія ефективніша, внаслідок більш високої чутливості М. Kansasii до антибактеріальних препаратів. М. Xenopi і М. Malmoense викликають, головним чином, хронічні захворювання легень. Вони можуть забруднювати водопровідну систему гарячої та холодної води. Ареал проживання М. Malmoens не цілком встановлено. М. Xenopi проявляють досить хорошу чутливість до протитуберкульозної терапії. М. Malmoense проявляють досить високу чутливість до антибіотиків in vitro, але консервативне лікування часто неефективно аж до летального результату. М. Fortuitum і М. Chelonae визнані збудниками захворювань кісток і м'яких тканин внаслідок прямого зараження рани при травмі, хірургічному втручанні і проникаюче поранення. Вони викликають до 10% микобактериозов легких. Протікає як хронічне деструктивне двобічне ураження, часто летально. Протитуберкульозні препарати і антибіотики широкого спектру дії не активні або мало активні проти цих видів мікобактерій.

У південних регіонах поширення мають мікобактеріози шкірних покривів і м'яких тканин, викликані М. Leprae, М. Ulceranse. Виявлення нетуберкульозних мікобактерій проводять в лабораторіях провідних протитуберкульозних установ країни. Це вимагає високої кваліфікації і гарного оснащення лабораторій.