Діагностика мітохондріальних хвороб

Оцінка характеру успадкування та прояву клінічних ознак мітохондріальних захворювань

Оскільки міотохондріальні захворювання в деяких випадках можуть бути спричинені пошкодженням ядерного геному, передача захворювання відповідатиме менделівським законам успадкування. У тих випадках, коли розвиток захворювання спричинений мутаціями в мітохондріальній ДНК, успадкування відповідатиме мітохондріальному типу, тобто передаватися по материнській лінії. Нарешті, коли патологія розвивається з одночасним пошкодженням генів ядерного та мітохондріального геномів, успадкування буде складним і визначатиметься різними факторами. У зв'язку з цим, при генеалогічному аналізі за формальною ознакою (характер успадкування за родоводом) можна констатувати найрізноманітніші типи успадкування: аутосомно-домінантне, аутосомно-рецесивне, Х-зчеплене, мітохондріальне.

Розвиток таких міохондріальних захворювань, як порушення метаболізму піровиноградної кислоти або бета-окислення жирних кислот, цикл Кребса, пов'язаний з мутаціями генів ядерного геному. Ці патології характеризуються аутосомно-рецесивним типом успадкування, коли батьки є носіями мутацій (гетерозиготи), а дитина є носієм обох успадкованих мутацій, отриманих від батька та матері (гомозигота). Батьки зазвичай зовні здорові, і подібне захворювання або його мікроознаки слід шукати у братів і сестер хворої дитини (пробанд-сібси) та у родичів як з боку матері, так і з боку батька (двоюрідні брати і сестри).

У випадку рецесивного, зчепленого з Х-хромосомою типу успадкування (наприклад, глутарова ацидурія новонароджених II типу або дефіцит субодиниці E1 піровиноградного комплексу, хвороба Менкеса тощо) частіше уражаються хлопчики, а матері є носіями мутацій і передають їх своїм синам. Материнське успадкування відрізняється від Х-зчепленого тим, що уражаються обидві статі. У цих випадках при аналізі родоводу необхідно проаналізувати частоту захворювання у чоловіків, оскільки воно не проявлятиметься у жінок. Родовід не показує передачі захворювання по лінії батько-син, оскільки батько може передати синові лише Y-хромосому.

Коли захворювання розвивається внаслідок пошкодження мітохондріального геному (наприклад, ряд захворювань дихального ланцюга, оптична нейропатія Лебера, синдроми MELAS, MERF, NARP тощо), простежується материнська спадковість, оскільки дитина успадковує мітохондрії від матері, і вона може передати їх як хлопчикам, так і дівчаткам. Таким чином, обидві статі уражаються однаково. У зв'язку з цим, передача захворювання по лінії матері повинна бути відстежена в родоводі.

Під час аналізу генеалогічного дерева та пошуку симптомів мітохондріальних захворювань у родичів слід пам'ятати, що тяжкість захворювання (вираженість ознаки) може значно варіюватися, що може бути пов'язано з різною кількістю пошкоджених мітохондрій, характером їх пошкодження, різним розподілом мутацій у клітинах тощо. Таким чином, не завжди вдається виявити явні ознаки захворювань. У деяких випадках виявляються або окремі, стерті симптоми, або ознаки, які можна виявити під час їх цілеспрямованого пошуку.

Розвиток мітохондріальної патології може бути пов'язаний з пошкодженням великих ділянок мітохондрій, так званими мікроделеціями (наприклад, синдром Кірнса-Сейра, синдром Пірсона, деякі форми цукрового діабету з глухотою, прогресуюча зовнішня офтальмоплегія тощо). У цих випадках характерні симптоми часто не виявляються у родичів, оскільки розвиток захворювань пов'язаний з виникненням нових мутацій, що виникли в зиготі одразу після запліднення яйцеклітини ( de novo мутація). Захворювання має спорадичний характер. Часто поряд з цими захворюваннями зустрічається ряд станів, пов'язаних з множинними мутаціями мітохондріальної ДНК, які успадковуються за аутосомно-домінантним типом: наприклад, деякі форми енцефаломіопатії, міопатії з ураженням очей, незважаючи на наявність мутацій мтДНК (множинні делеції), мають аутосомно-домінантний тип успадкування.

Однак, на відміну від менделівського успадкування, аутосомно-домінантний тип успадкування при мітохондріальній патології характеризується великою кількістю уражених осіб у наступних поколіннях.

Зрештою, деякі мітохондріальні захворювання, часто пов'язані з виснаженням мітохондрій мтДНК або їх відсутністю в клітинах, можуть успадковуватися за аутосомно-рецесивним типом. До них належать вроджені форми міопатії, кардіоміопатії, нейродистрес-синдрому, лактатного ацидозу, ураження печінки тощо.

Вивчення характеру спадкової передачі захворювання має важливе значення для медико-генетичного прогнозування та вимагає глибокого аналізу клінічних ознак зі знанням механізмів формування мітохондріальної патології та типів її успадкування.

Прояв клінічних проявів значно варіюється від перших днів життя до дорослого віку. При аналізі цього показника необхідно враховувати нозологічні форми, оскільки кожна з них має певний вік дебюту.

Метаболічні порушення, що спостерігаються при мітохондріальних захворюваннях, у переважній більшості випадків прогресують. Початкові симптоми часто легкі, потім прогресують і можуть призвести до значних інвалідизуючих розладів. Рідкісні форми патології, такі як доброякісна дитяча міопатія та деякі форми оптичної нейропатії Лебера, можуть бути доброякісними та схильними до регресії.

Під час лабораторних досліджень звертають увагу на характерні ознаки мітохондріальних захворювань:

• наявність ацидозу;
• підвищений рівень лактату та пірувату в крові, збільшення індексу лактат/піруват більше 15, особливо зростаючий при навантаженні глюкозою або фізичних вправах;
• гіперкетонемія;
• гіпоглікемія;
• гіперамоніємія;
• підвищена концентрація ацетоацетату та 3-гідроксибутирату;
• підвищене співвідношення 3-гідроксимасляної кислоти/ацетооцтової кислоти в крові;
• підвищений рівень амінокислот у крові та сечі (аланін, глутамін, глутамінова кислота, валін, лейцин, ізолейцин);
• підвищений рівень жирних кислот у крові;
• гіперекскреція органічних кислот із сечею;
• зниження рівня карнітину в крові;
• збільшення вмісту міоглобіну в біологічних рідинах;
• зниження активності мітохондріальних ферментів у міоцитах та фібробластах.

Діагностична цінність цих показників вища при харчовому навантаженні, ніж натщесерце. На практиці добре зарекомендував себе діагностичний тест: визначення лактату в крові на тлі глюкозного навантаження, що дозволяє чіткіше виявити недостатність дихального ланцюга на додаткове глюкозне навантаження.

Для лабораторної діагностики мітохондріальної дисфункції та її специфічних нозологічних форм звичайних, рутинних біохімічних методів дослідження недостатньо; необхідно проводити спеціальні тести. Особливо зручно аналізувати активність ферментів у біоптатах скелетних м'язів, ніж в інших тканинах. Можливе визначення активності ферментів дихального ланцюга, особливо цитратсинтетази, сукцинатдегідрогенази та цитохром-С-оксидази.

Дані морфологічних та молекулярно-генетичних досліджень

Морфологічні дослідження мають особливе значення в діагностиці мітохондріальної патології. Через їхню велику інформативність часто потрібна біопсія м'язової тканини та гістохімічне дослідження отриманих біоптатів. Важливу інформацію можна отримати, одночасно досліджуючи матеріал за допомогою світлової та електронної мікроскопії.

Одним із важливих маркерів мітохондріальних захворювань є феномен «рваних» червоних волокон [феномен RRF (ragged red fibres)], встановлений у 1963 році. Він пов'язаний з утворенням генетично змінених аномальних мітохондрій по краю м'язового волокна внаслідок проліферації та вогнищевого накопичення. Це явище виявляється за допомогою світлової мікроскопії з використанням спеціального барвника Гоморі, але в останні роки для цієї мети використовуються різні мітохондріальні маркери та різні імунологічні методи.

Інші морфологічні ознаки мітохондріальної патології включають:

• різке збільшення розмірів мітохондрій;
• накопичення глікогену, ліпідів та конгломератів кальцію в субсарколемі;
• зниження активності мітохондріальних ферментів;
• порушений розподіл гранул активності ферментів сукцинатдегідрогенази (СДГ), НАДН-оксидоредуктази, цитохром-С-оксидази тощо.

У пацієнтів з мітохондріальними захворюваннями світлова мікроскопія м'язової тканини може виявити неспецифічні морфологічні ознаки: локальний некроз м'язових волокон, накопичення саркоплазматичних мас, наявність лізису субсарколемальних ділянок саркоплазми, базофілію саркоплазми, збільшення кількості м'язових ядер, активацію процесів регенерації тощо.

Вивчення ролі феномену «рваних» червоних волокон показало його важливість для діагностики таких станів, як MELAS, MERRF, синдроми Кірнса-Сейра, хронічна прогресуюча офтальмоплегія та інші, пов'язані з мутаціями мтДНК. Цей феномен може розвиватися і при інших захворюваннях: м'язова дистрофія Дюшена, дерматоміозит, міотонічна дистрофія, прийом медикаментів (клофібрат) та інші патологічні стани. Таким чином, поряд з первинними мітохондріальними захворюваннями, феномен RRF може супроводжувати вторинні мітохондріальні дисфункції.

Наразі широкого поширення набули гістохімічні та електронно-мікроскопічні дослідження м'язової тканини для виявлення ознак мітохондріальної недостатності. У деяких випадках вони допомагають у діагностиці, особливо за нормальної морфологічної картини м'язової тканини за даними світлової мікроскопії.

Електронно-мікроскопічні ознаки – виявлення проліферації мітохондрій, порушення їх форми та розмірів, дезорганізація та збільшення крист, накопичення аномальних мітохондрій під сарколемою, накопичення ліпідних та аномальних паракристалічних (переважно складаються з білка) або осмофільних включень, локалізованих між внутрішньою та зовнішньою мембранами або всередині крист, сферичні скупчення, часто розташовані в матриксі (складаються переважно з тригліцеридів) тощо.

У деяких пацієнтів можна виявити цитохімічні порушення в лейкоцитах.

Комплекс біохімічних та морфологічних досліджень доповнюється сучасними методами молекулярної діагностики (виявлення ядерних або мітохондріальних мутацій), які проводяться у спеціалізованих ДНК-діагностичних лабораторіях. При мітохондріальних захворюваннях виявляються різні типи мутацій: точкові мутації, делеції, дуплікації, кількісні аномалії ДНК тощо.

За відсутності мутацій у мтДНК, якщо є підозра на мітохондріальну патологію, проводиться дослідження ядерної ДНК.

Діагностичні критерії

Існує 2 групи діагностичних критеріїв мітохондріальних захворювань. Основні діагностичні критерії (перша група).

• Клінічні:
  • встановлені діагнози: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, синдроми Пірсона, нейропатія Лебера, хвороби Лі та Альперса;
  • наявність 2 або поєднання наступних ознак:
    • мультисистемне ураження, патогномонічне для захворювань дихального ланцюга;
    • прогресуючий перебіг з епізодами загострення або наявністю мітохондріальних мутацій у родині;
    • виключення метаболічних та інших захворювань шляхом проведення відповідних аналізів.
• Гістологічний – виявлення феномену RRF у понад 2% м’язової тканини.
• Ферментативний:
  • цитохром с оксидаза-негативні волокна;
  • знижена активність ферментів дихального ланцюга (<20% від норми в тканинах, <30% у клітинах або кількох тканинах).
• Функціональний – зниження синтезу АТФ у фібробластах більш ніж на 3 стандартні відхилення.
• Молекулярно-генетичні – патогенетично значущі мутації ядерної або мтДНК.

Додаткові діагностичні критерії (друга група).

• Клінічні – неспецифічні симптоми, що виникають при захворюваннях дихального ланцюга (мертвонародження, зниження рухової активності плода, рання неонатальна смерть, рухові порушення, порушення розвитку, порушення м’язового тонусу в неонатальному періоді).
• Гістологічно – невеликий відсоток феномену RRF, субсарколемальне скупчення мітохондрій або їх аномалії.
• Ферментативний – низька активність ферментів дихального комплексу (20-30% від норми в тканинах, 30-40% у клітинах або клітинних лініях).
• Функціональний – зниження синтезу АТФ у фібробластах на 2-3 стандартних відхилення або відсутність росту фібробластів у середовищі з галактозою.
• Молекулярно-генетичний – виявлення мутацій у ядерній або мтДНК з передбачуваним патогенетичним зв’язком.
• Метаболічний – виявлення одного або кількох метаболітів, що вказує на порушення клітинної біоенергетики.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]