Діагностика мітохондріальних хвороб

Оцінка характеру успадкування і маніфестації клінічних ознак мітохондріальних захворювань

У зв'язку з тим що міотохондріальние хвороби в ряді випадків можуть бути обумовлені пошкодженням ядерного генома, передача захворювання буде відповідати менделевским законам наслідування. У тих же випадках, коли розвиток хвороби обумовлено мутаціями мітохондріальної ДНК, успадкування буде відповідати мітохондріального типу, тобто передаватися по материнській лінії. Нарешті, коли патологія розвивається при одночасному пошкодженні генів ядерного і мітохондріального геномів, успадкування буде носити складний характер і визначатися різними чинниками. У зв'язку з цим при генеалогічному аналізі за формальною ознакою (характером спадкування за родоводом) можна констатувати найрізноманітніші типи успадкування: аутосомно-домінантний, аутосомно-рецесивний, Х-зчеплений, мітохондріальний.

Розвиток таких міотохондріальних хвороб, як порушення обміну піровиноградної кислоти або бета-окислення жирних кислот, циклу Кребса, пов'язане з мутаціями генів ядерного генома. Для цих патологій характерний аутосомно-рецесивний шлях наслідування, коли батьки - носії мутацій (гетерозиготи), а дитина - носій обох успадкованих мутацій, отриманих від батька і матері (гомозигота). Батьки, як правило, зовні здорові, а аналогічне захворювання або його мікропрізнакі слід шукати у братів і сестер хворої дитини (сибсов пробанда) і у родичів по лінії як матері, так і батька (у двоюрідних братів і сестер).

У разі рецесивного, зчепленого з Х-хромосомою типу успадкування (наприклад, неонатальна форма глутаровой ацидурія II типу або дефіцит субодиниці Е1 Піровиноградна комплексу, хвороба Менкеса і ін.) Хворіють частіше хлопчики, а матері виступають носіями мутацій і передають їх своїм синам. Материнське успадкування відрізняється від Х-зчепленого ураженням осіб обох статей. У цих випадках при аналізі родоводу необхідно аналізувати захворюваність у чоловіків, так як у жінок воно не буде проявлятися. У родоводі не простежується передача захворювання по лінії батько-син, так як батько може передати синові тільки Y-хромосому.

При розвитку захворювання в зв'язку з пошкодженням генома мітохондрій (наприклад, ряд хвороб дихальної ланцюга, оптичної нейропатії Лебера, синдроми MELAS, MERF, NARP і ін.) Простежується материнське успадкування, так як мітохондрії дитина успадковує від матері, а вона може передавати їх як хлопчикам , так і дівчаткам. Таким чином, лиця обох статей уражаються в рівній мірі. У зв'язку з цим в родоводу слід простежити передачу хвороби по лінії матері.

При аналізі родоводу і пошуку симптомів мітохондріальних хвороб у родичів слід пам'ятати, що ступінь вираженості захворювання (експресивність ознаки) може широко варіювати, що може бути пов'язано з різною кількістю пошкоджених мітохондрій, характером їх ушкоджень, різним розподілом мутацій по клітинам і т.д. Так, не завжди можна виявити явні ознаки хвороб. У ряді випадків виявляють або окремі, стерті симптоми, які ознаки, які можуть бути виявлені при їх цілеспрямованому пошуку.

Розвиток мітохондріальної патології може бути пов'язано з пошкодженням великих ділянок мітохондрій, так званих мікроделецій (наприклад, синдром Кернса-Сейра, синдром Пірсона, деякі форми цукрового діабету з глухотою, прогресуюча зовнішня офтальмоплегия і ін.). У цих випадках часто не знаходять характерні симптоми у родичів, так як розвиток хвороб пов'язано з виникненням нових мутацій, що відбулися в зиготі відразу після запліднення яйцеклітини (мутація de novo ). Захворювання носить спорадичний характер. Найчастіше разом з цими хворобами по аутосомно-домінантним типом успадковується ряд станів, пов'язаних з множинними мутаціями мітохондріальної ДНК: наприклад, деякі форми енцефаломіопатія, міопатії з ураженням очей, незважаючи на наявність мутацій мтДНК (множинні делеції), мають аутосомно-домінантний тип спадкування.

Однак на відміну від менделевского аутосомно-домінантний тип спадкування при мітохондріальної патології відрізняється великою кількістю уражених осіб в наступних поколіннях.

Нарешті, деякі мітохондріальні хвороби, пов'язані часто з деплеціей мітохондрій мтДНК або їх відсутністю в клітинах, можуть успадковуватися по аутосомно-рецесивним типом. До них відносять вроджені форми міопатії, кардіоміопатії, нейродістресс-синдром, лактатацидоз, ураження печінки та ін.

Вивчення характеру спадкової передачі захворювання має важливе значення для медико-генетичного прогнозу і вимагає глибокого аналізу клінічних ознак зі знанням механізмів формування мітохондріальної патології і типів її успадкування.

Маніфестація клінічних проявів широко варіює від перших днів життя до дорослого періоду. При аналізі даного показника потрібно враховувати нозологічні форми, так як кожна з них має певний вік дебюту.

Обмінні порушення, що спостерігаються при мітохондріальних хворобах, носять в переважній більшості випадків прогресуючий характер. Початкові симптоми часто маловиражен, в подальшому прогресують і можуть призводити до значних інвалідизуючим розладів. Рідкісні форми патології, такі як доброякісна дитяча міопатія і деякі форми оптичної нейропатії Лебера, можуть носити сприятливий характер і піддаватися зворотному розвитку.

При лабораторному дослідженні звертають увагу на характерні ознаки мітохондріальних хвороб:

• наявність ацидозу;
• підвищені рівні лактату і пірувату в крові, збільшення індексу лактат / піруват більше 15, особливо посилюються при навантаженні глюкозою або фізичними вправами;
• гиперкетонемию;
• гіпоглікемію;
• гіперамоніємія;
• підвищення концентрації ацетоацетата і 3-оксибутират;
• збільшення співвідношення 3-гідроксимасляної кислоти / ацетоуксусной кислоти в крові;
• підвищений вміст амінокислот в крові і сечі (аланіну, глутаміну, глутамінової кислоти, валіну, лейцину, ізолейцину);
• підвищені рівні жирних кислот в крові;
• гіперекскрецію органічних кислот з сечею;
• зниження рівня карнітину в крові;
• збільшення вмісту міоглобіну в біологічних рідинах;
• зниження активності мітохондріальних ферментів в міоцитах і фібробластах.

Діагностична цінність цих показників вище при харчовому навантаженні, ніж натщесерце. На практиці добре зарекомендував себе діагностичний тест: визначення лактату в крові на тлі навантаження глюкозою, що дозволяє більш чітко виявити неспроможність дихального ланцюга на додаткове навантаження глюкозою.

Для лабораторної діагностики мітохондріальної дисфункції і її конкретних нозологічних форм недостатньо звичайних, рутинних біохімічних методів дослідження, необхідне проведення спеціальних тестів. Особливо зручно проводити аналіз активності ферментів в біоптатах скелетних м'язів, ніж в інших тканинах. Можливо визначення активності ферментів дихального ланцюга, особливо цитрат-синтетази, сукцинатдегідрогенази і цитохром С-оксидази.

Дані морфологічних і молекулярно-генетичних досліджень

Морфологічним дослідженням при діагностиці мітохондріальної патології надають особливого значення. З огляду на велику інформативною значимості часто потрібні проведення біопсії м'язової тканини і гистохимическое дослідження отриманих біоптатів. Важлива інформація може бути отримана при одночасному дослідженні матеріалу за допомогою світлової та електронної мікроскопії.

Один з важливих маркерів мітохондріальних хвороб - феномен «рваних» червоних волокон [феномен RRF (ragged red fibres)], встановлений в 1963 р Він пов'язаний з утворенням внаслідок проліферації і осередкового скупчення генетично змінених аномальних мітохондрій по краю м'язового волокна. Цей феномен виявляють при світловій мікроскопії з використанням спеціального фарбування Гомори, проте в останні роки для цього використовують різні мітохондріальні маркери і різноманітні імунологічні методи.

До іншим морфологічними ознаками мітохондріальної патології відносять:

• різке збільшення розмірів мітохондрій;
• накопичення глікогену, ліпідів і конгломератів кальцію в субсарколеммах;
• зниження активності мітохондріальних ферментів;
• порушене розподіл гранул активності ферментів сукцинатдегідрогенази (СДГ), НАДН-оксидоредуктаз, цитохром С-оксидази та ін.

У хворих з мітохондріальними хворобами при світловій мікроскопії м'язової тканини можна виявити неспецифічні морфологічні ознаки: локальні некрози м'язових волокон, накопичення саркоплазменних мас, наявність лізису субсарколеммальних ділянок саркоплазми, базофілію саркоплазми, підвищена кількість м'язових ядер, активацію процесів регенерації і ін.

Дослідження ролі феномена «рваних» червоних волокон показало його значення для діагностики таких станів, як синдроми MELAS, MERRF, Кернса-Сейра, хронічної прогресуючої офтальмоплегии та інших, пов'язаних з мутаціями мтДНК. Цей феномен може розвиватися при інших хворобах: міодистрофії Дюшена, дерматоміозитах, миотонической дистрофії, прийомі лікарських препаратів (клофібрат) і інших патологічних станах. Таким чином, поряд з первинними мітохондріальними хворобами феномен RRF може супроводжувати вторинні мітохондріальні дисфункції.

В даний час широкого поширення набуло гистохимическое і електронно-мікроскопічне дослідження м'язової тканини для виявлення ознак мітохондріальної недостатності. У ряді випадків вони допомагають діагностиці, особливо при нормальній морфологічної картини м'язової тканини за даними світлової мікроскопії.

Електронно-мікроскопічні ознаки - виявлення проліферації мітохондрій, порушення їх форми і розмірів, дезорганізація і збільшення крист, скупчення аномальних мітохондрій під сарколеммой, накопичення ліпідних і аномальних паракрісталліческіх (головним чином складаються з білка) або осмофільних включень, що локалізуються між внутрішньою і зовнішньою мембранами або в межах крист, кулясті скупчення, часто розташовані в матриксі (що складаються головним чином з тригліцеридів) та ін.

У окремих хворих можна виявити цитохимические порушення в лейкоцитах.

Комплекс біохімічних і морфологічних досліджень доповнюється сучасними методами молекулярної діагностики (виявленням ядерних або мітохондріальних мутацій), які виконують в спеціалізованих лабораторіях ДНК-діагностики. При мітохондріальних хворобах виявляють різноманітні типи мутацій: точкові, делеции, дуплікації, кількісні аномалії ДНК і ін.

При відсутності мутацій в мтДНК, якщо підозрюють мітохондріальну патологію, проводять дослідження ядерної ДНК.

Критерії діагностики

Виділяють 2 групи критеріїв діагностики мітохондріальних хвороб. Основні критерії діагностики (перша група).

• Клінічні:
  • встановлені діагнози: синдроми MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, Пірсона, нейропатія Лебера, хвороби Лея, Альперса;
  • наявність 2 або комбінація таких ознак:
    • мультисистемного ураження, патогномоничного для хвороб дихальної ланцюга;
    • прогресуючого перебігу з епізодами екзацеребраціі або наявності мітохондріальних мутацій в сім'ї;
    • виключення метаболічних і інших захворювань проведенням відповідних тестів.
• Гістологічні - виявлення феномена RRF більш ніж в 2% м'язової тканини.
• ферментні:
  • цитохром С-оксідазонегатівние волокна;
  • зниження активності ензимів комплексу дихального ланцюга (<20% норми в тканини, <30% в клітинах або декількох тканинах).
• Функціональні - зниження синтезу АТФ в фібробластах більше 3 стандартних відхилень.
• Молекулярно-генетичні - патогенетично значущі мутації ядерної або мтДНК.

Додаткові критерії діагностики (друга група).

• Клінічні - неспецифічні симптоми, що зустрічаються при хворобах дихальної ланцюга (мертвонародження, зниження рухової активності плода, рання неонатальна смерть, рухові розлади, порушення розвитку, порушення м'язового тонусу в неонатальному періоді).
• Гістологічні - малий відсоток феномена RRF, субсарколеммальное накопичення мітохондрій або їх аномалій.
• Ферментні - низька активність ферментів дихального комплексу (20-30% норми в тканини, 30-40% - в клітинах або клітинних лініях).
• Функціональні - зниження синтезу АТФ в фібробластах на 2-3 стандартних відхилення або відсутність росту фібробластів в середовищі з галактозою.
• Молекулярно-генетичні - виявлення мутацій ядерної або мтДНК з імовірною патогенетичної зв'язком.
• Метаболічні - виявлення одного або більше метаболітів, що вказують на порушення клітинної біоенергетики.

[1], [2], [3], [4]