Імунологічні дослідження в урології

Призначення імунограми урологічному пацієнту означає, що лікуючий лікар підозрює наявність порушень в імунній системі. Рецидивуючі бактеріальні, вірусні, грибкові інфекції, алергічні прояви, системні захворювання можуть бути ознаками цих порушень, які характеризуються низкою синдромів (інфекційний, онкологічний, алергічний, аутоімунний, лімфопроліферативний). В одного пацієнта може бути кілька синдромів. Наприклад, хронічні інфекційні захворювання (інфекційний синдром) можуть викликати імунодефіцит, а імунодефіцит може проявлятися як схильність до інфекційних та онкологічних захворювань (онкологічний синдром). Схильність до інфекцій може виникати на тлі вторинного імунодефіциту, що розвинувся внаслідок лімфопроліферативного захворювання, такого як лейкоз. Виділяють три основні групи патологічних змін в імунній системі:

• кількісна або функціональна недостатність тієї чи іншої ланки імунної системи, що призводить до розвитку імунодефіцитного стану;
• порушення розпізнавання антигенів імунною системою, що призводить до розвитку аутоімунних процесів;
• гіперреактивна або «збочена» імунна відповідь, що проявляється розвитком алергічних захворювань.

Існують скринінгові (тести 1 рівня) та уточнюючі (тести 2 рівня) методи імунодіагностики. Перші існують для фіксації порушень в імунній системі, другі – для встановлення механізмів, що беруть участь в їх реалізації, з метою подальшої імунокорекції.

В-клітинний імунітет

Методи скринінгу

• Визначення відносної та абсолютної кількості В-лімфоцитів за допомогою імунофлуоресценції або проточної цитофлуориметрії з моноклональними антитілами до В-клітинних антигенів (CD19, CD20, де CD – кластери диференціації). Нормальний вміст В-лімфоцитів у дорослих становить 8-19% від загальної кількості лейкоцитів або 190-380 клітин/мкл. Збільшення вмісту В-лімфоцитів спостерігається при гострих та хронічних бактеріальних та грибкових інфекціях, хронічних захворюваннях печінки, системних захворюваннях сполучної тканини, хронічному лімфолейкозі та мієломі.
• Визначення концентрації неспецифічних імуноглобулінів (F, M, G, E) методом простої радіальної імунодифузії, нефелометрії або турбометрії, радіоімунологічного аналізу або імуноферментного аналізу (ІФА). Норми для дорослих: імуноглобулін (Ig) A 0,9-4,5 г/л. IgM 03-3,7 г/л. IgG 8,0-17 г/л. Підвищення концентрації імуноглобулінів відбувається за тих самих патологічних станів, за яких відбувається збільшення вмісту B-лімфоцитів. Зниження концентрації імуноглобулінів відбувається при вродженій гіпогаммаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, видаленні селезінки, втраті білка, захворюваннях нирок або кишечника, лікуванні цитостатиками та імуносупресантами.

Методи уточнення

• Визначення циркулюючих імунних комплексів у крові шляхом селективного осадження в поліетиленгліколі з подальшим спектрофотометричним визначенням щільності (норма 80-20 Од). Збільшення циркулюючих імунних комплексів типове для гострих бактеріальних, грибкових, вірусних інфекцій, аутоімунних, імунокомплексних захворювань, сироваткової хвороби, алергічних реакцій 3 типу;
• Визначення специфічних імуноглобулінів у крові стосовно бактеріальних та вірусних антигенів, дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) при аутоімунних захворюваннях, виявлення антиспермальних (аутоімунне безпліддя) та антиренальних антитіл (пієлонефрит та гломерулонефрит) методом радіальної імунодифузії або ІФА.
• Визначення антиспермальних антитіл у сперматозоїдах [MAR-тест (змішана антиглобулінова реакція)], норма - негативний результат.
• Визначення концентрації імуноглобулінів у сечі з метою диференціальної діагностики між пієлонефритом та гломерулонефритом (селективність протеїнурії).
• Визначення вмісту IgE у соку передміхурової залози з метою діагностики алергічного простатиту методом радіальної імунодифузії або ІФА.
• Вивчення відповіді в реакції бластної трансформації В-лімфоцитів на В-клітинний мітоген (мітоген лаконоса для стимуляції реакції бластної трансформації В-лімфоцитів у присутності Т-лімфоцитів), нормативне значення якого становить 95-100%.

Т-клітинна ланка імунітету

Методи скринінгу

• Визначення відносної та абсолютної кількості зрілих CD3 T-лімфоцитів методом імунофлуоресценції або проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних анти-CD3 антитіл. Норма для дорослих становить 58-76% або 1100-1700 клітин/мкл. Зниження кількості T-лімфоцитів є показником недостатності клітинної ланки імунітету. Це характерно для деяких вторинних та первинних імунодефіцитів (хронічні бактеріальні та вірусні інфекції: туберкульоз, синдром набутого імунодефіциту, злоякісні пухлини, хронічна ниркова недостатність, травми, стрес, старіння, недоїдання, лікування цитостатиками, вплив іонізуючого випромінювання). Збільшення кількості T-лімфоцитів відбувається на тлі імунної гіперактивності або при лімфопроліферативних захворюваннях. При запаленні кількість T-лімфоцитів спочатку збільшується, а потім зменшується. Відсутність зниження кількості T-лімфоцитів свідчить про хронічний запальний процес.
• Оцінка субпопуляцій лімфоцитів.
  • Визначення кількості Т-хелперів (анти-CD4 антитіл). У нормі 36-55% або 400-1100 клітин/мкл. Збільшення кількості цих клітин відбувається при аутоімунних захворюваннях, хворобі Вальденстрема, активації антитрансплантатного імунітету; зменшення кількості Т-хелперів відбувається при хронічних бактеріальних, вірусних, протозойних інфекціях, туберкульозі, синдромі набутого імунодефіциту, злоякісних пухлинах, опіках, травмах, недоїданні, старінні, лікуванні цитостатиками, впливі іонізуючого випромінювання.
  • Визначення кількості Т-супресорів (анти-CD4 антитіл). У нормі 17-37% або 300-700 клітин/мкл. Збільшення кількості Т-супресорів відбувається за тих самих умов, за яких зменшується кількість Т-хелперів, а їх зменшення відбувається за тих самих умов, за яких вміст Т-хелперів збільшується.
  • Імунорегуляторний індекс CD4/CD8, у нормі 1,5-2,5. Гіперактивність зі значеннями понад 2,5 (алергічні та аутоімунні захворювання); гіпоактивність - менше 1,0 (схильність до хронічних інфекцій). На початку запального процесу імунорегуляторний індекс підвищується, а при його стиханні нормалізується.

Методи уточнення

• Визначення кількості природних кілерів (NK-клітин) – антитіл до CD16 та CD56. Норма для CD 16-лімфоцитів становить 6-26%, CD56 – 9-19%. Збільшення кількості NK-клітин відбувається під час відторгнення трансплантата, зниження – при вірусних інфекціях, раку, первинних та вторинних імунодефіцитах, опіках, травмах та стресі, лікуванні цитостатиками та впливі іонізуючого випромінювання.
• Визначення кількості Т-лімфоцитів з рецептором до інтерлейкіну-2 (маркер активації) - антитілами до CD25. Норма становить 10-15%. Збільшення їх кількості спостерігається при алергічних захворюваннях, відторгненні трансплантата, відповіді на тимусзалежні антигени в гострому періоді первинної інфекції, зменшення - при тих самих захворюваннях, при яких спостерігається зменшення кількості NK-клітин.
• Вивчення експресії маркера активації - молекули гістосумісності II класу HLA-DR. Підвищена експресія спостерігається при запальних процесах, у пацієнтів з гепатитом С, целіакією, сифілісом, гострими респіраторними захворюваннями.
• Оцінка апоптозу лімфоцитів. Приблизне уявлення про готовність лімфоцитів до апоптозу можна отримати за експресією Fas-рецептора (CD95) на їх поверхні та протоонкогена bd-2 у мітохондріях. Апоптоз лімфоцитів оцінюють, обробивши їх двома флуоресцентними барвниками: йодидом пропідію, який зв'язується з фрагментами ДНК, та анексином Y, який зв'язується з фосфатидилсерином, що з'являється на клітинній мембрані на початку апоптозу. Результати оцінюють за допомогою проточного цитофлуориметра. Результати розраховують на основі співвідношення клітин, забарвлених різними барвниками. Незабарвлені клітини є життєздатними, клітини, зв'язані лише з анексином Y, є ранніми проявами апоптозу, з йодидом пропідію та анексином Y є пізніми проявами апоптозу, забарвлення лише йодидом пропідію вказує на некроз.
• Оцінка проліферації Т-лімфоцитів in vitro.
  • Зміни в бластогенезі клітин - реакція бластної трансформації лімфоцитів. Лейкоцити інкубують з будь-яким мітогеном рослинного походження (лектинами). Фітогемаглютинін найчастіше використовують протягом 72 годин, потім беруть мазок, забарвлюють його та підраховують кількість бластів! Індекс стимуляції - це відношення відсотка трансформованих клітин в експерименті (культура з фітогемаглютиніном) до відсотка трансформованих клітин у контролі (культура без фітогемаглютиніну). Реакцію бластної трансформації лімфоцитів можна оцінити шляхом включення радіоактивної мітки (ZN-тимніну) до складу культивованих клітин, оскільки синтез ДНК збільшується під час поділу клітин. Порушення проліферативної відповіді виникають як при первинних, так і при вторинних імунодефіцитах, пов'язаних з інфекціями, раком, нирковою недостатністю та хірургічними втручаннями.
  • У цих дослідженнях оцінюється експресія маркерів активації (CD25, рецептор трансферину - CD71) та молекули головного комплексу гістосумісності II класу HLA-DR, які практично відсутні на Т-лімфоцитах у стані спокою. Т-лімфоцити стимулюють фітогемаглютиніном, через 3 дні експресію маркерів активації аналізують методом прямої або непрямої імунофлуоресцентної реакції, проточної цитофлуориметрії, використовуючи моноклональні антитіла до ізольованих рецепторів.
  • Вимірювання кількості медіаторів, що синтезуються активованими Т-лімфоцитами [інтерлейкін (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-інтерферон тощо] за допомогою радіоімунологічного аналізу або ІФА. Особливе значення має оцінка концентрації γ-інтерферону та IL-4 як маркерів Th1 та Th2 у супернатанті активованих культур та всередині клітини. Якщо можливо, корисно визначити експресію генів відповідного цитокіну за рівнем матриксної рибонуклеїнової кислоти в клітині-продуценті та інтенсивністю експресії рецепторів відповідних цитокінів.
    
• Реакція гальмування міграції лімфоцитів. Сенсибілізовані Т-лімфоцити в реакції з антигеном секретують лімфокіни, включаючи фактори, що гальмують міграцію лімфоцитів. Явище гальмування спостерігається при внесенні мітогенів у культуру клітин. Оцінка ступеня гальмування дозволяє судити про здатність лімфоцитів секретувати цитокіни. У нормі частота міграції, залежно від конкретного мітогену, становить 20-80%.
• Оцінка цитотоксичності NK-клітин. Визначається здатність природних клітин-кілерів знищувати клітини-мішені еритромієлоїдної лінії K-562. Якщо оцінюється антитілозалежна цитотоксичність, використовуються клітини-мішені, покриті антитілами IgG. Клітини-мішені мічать 3H-уридином та інкубують з ефекторними клітинами. Загибель клітин-мішеней оцінюють за вивільненням радіоактивної мітки в розчин. Зниження цитотоксичності відбувається при злоякісних новоутвореннях. У деяких випадках, коли необхідно передбачити ефективність лікування інтерлейкінами, цитотоксичність NK-клітин оцінюють під час інкубації з певними цитокінами.

Вивчення функції фагоцитів

Методи скринінгу

Вивчення інтенсивності поглинання мікробних клітин фагоцитами (фагоцитоз латексних частинок, тест-культура стафілокока, кишкової палички або мікроорганізмів, виділених від пацієнта). Центрифугуванням гепаринізованої крові виділяють суспензію лейкоцитів, додають сироватку крові IV групи крові для опсонізації (опсоніни – білки, що посилюють фагоцитоз). Мікробну суспензію розбавляють, змішують з лейкоцитами та інкубують протягом 120 хвилин, відбираючи проби для аналізу через 30.90.120 хвилин після початку інкубації. Зібраної суспензії лейкоцитів роблять мазки. Визначають такі показники фагоцитозу:

• фагоцитарний індекс – відсоток клітин, що вступили у фагоцитоз протягом 30 хв та 120 хв інкубації; стандартне значення фагоцитарного індексу (30) становить 94%, фагоцитарного індексу (120) – 92%;
• фагоцитарне число – середня кількість бактерій, розташованих внутрішньоклітинно; стандартне значення фагоцитарного числа (30) становить 11%, фагоцитарного числа (120) – 9,8%;
• коефіцієнт фагоцитарного числа – відношення фагоцитарного числа (30) до фагоцитарного числа (120); у нормі 1,16;
• Бактерицидний індекс нейтрофілів – відношення кількості мікробів, знищених усередині фагоцитів, до загальної кількості поглинутих мікробів; у нормі 66%.

Методи уточнення

• Вивчення бактерицидної здатності фагоцитів у тесті з нітросинім тетразолієм (НБТ) - НБТ-тест. До лейкоцитів додають жовтий барвник нітросиній тетразолій. Коли нейтрофіл поглинає барвник, під впливом вільних кисневих радикалів відбувається процес відновлення, що призводить до синє забарвлення. Реакцію проводять у 96-лунковому плоскодонному планшеті. У перші три лунки із сумішшю НБТ та лейкоцитів додають розчин Хенкса (спонтанний НБТ), а в другу - частинки латексу; суміш інкубують при 37°C протягом 25 хв. Результати зчитують при 540 нм на рідері та виражають в умовних одиницях. Розраховують коефіцієнт стимуляції (K _st ), що дорівнює відношенню оптичної густини у стимульованих лунках до середньої оптичної густини в лунках без стимуляції. У здорових людей НБТ _spont = 90 ± 45 CU, НБТ _stim = 140 ± 60 CU. К _ст = 1,78±0,36.
• Дослідження молекул адгезії. Проточна цитофлуориметрія використовується для визначення експресії поверхневих антигенів CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Імунодефіцити з порушенням адгезії проявляються рецидивуючими інфекціями, повільним загоєнням ран та відсутністю гною в осередках інфекції.

Вивчення системи комплементу

Методи скринінгу

Визначення гемолітичної активності комплементу – це вивчення класичного шляху активації комплементу. Різні розведення сироватки крові хворої та здорової людини додають до еритроцитів барана, покритих антитілами. Одиницею гемолітичної активності є величина, обернена до розведення сироватки, при якому руйнується 50% еритроцитів. Ступінь гемолізу оцінюється фотометрично за виходом гемоглобіну в розчин. Зниження гемолітичної активності комплементу спостерігається при системному червоному вовчаку з ураженням нирок, гострому гломерулонефриті, комбінованих імунодефіцитах, міастенії, вірусному гепатиті, лімфомах, підвищення – при механічній жовтяниці, тиреоїдиті Хашимото, ревматизмі, ревматоїдному артриті, вузликовому періартеріїті, дерматоміозиті, інфаркті міокарда, виразковому коліті, синдромі Рейтера, подагрі.

Методи уточнення

• Визначення компонентів комплементу. Кількісне визначення проводиться за допомогою радіальної імунодифузії та нефелометрії.
  Дослідження не є інформативним, якщо не змінюються антигенні властивості компонентів комплементу.
• Встановлено, що компонент комплементу Clq посилює фагоцитоз та опосередковує клітинну цитотоксичність. Його зниження відбувається при імунокомплексних захворюваннях, системному червоному вовчаку, гнійних інфекціях та пухлинах.
• Компонент C3 бере участь в активації класичного та альтернативного шляхів комплементу. Зниження його концентрації пов'язане з хронічними бактеріальними та грибковими інфекціями, наявністю циркулюючих або тканинних імунних комплексів.
• Компонент С4 бере участь в активації класичного шляху. Зниження його концентрації пов'язане з тривалою активацією комплементу імунними комплексами та зниженням концентрації інгібітора С1, який контролює активацію класичного шляху комплементу. Дефіцит С4 виникає при системному червоному вовчаку, збільшення С4 - при захворюваннях нирок, відторгненні трансплантата, гострому запаленні та захворюваннях шлунково-кишкового тракту.
• C5a – це невеликий фрагмент молекули C5, який відщеплюється від неї в результаті активації системи комплементу. Його концентрація зростає під час запалення, сепсису, атопічних та алергічних захворювань.
• Cl-інгібітор є багатофункціональним фактором. Він контролює активацію компонента комплементу C1, пригнічує активність калікреїну, плазміну та активованого фактора Хагемана, Cl- та Or-протеаз. Дефіцит C1-інгібітора призводить до ангіоневротичного набряку.
• функціональні дослідження комплементу. Досліджувану сироватку додають до стандартної сироватки, що не містить жодного компонента комплементу, і визначають гемолітичну активність комплементу. Якщо гемолітична активність не відновлюється до норми, активність цього компонента комплементу в досліджуваній сироватці вважається зниженою.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]