Імунологічні дослідження в урології

Призначення імунограми урологічному хворому означає, що лікуючий лікар припускає наявність порушень в імунній системі. Повторювані бактеріальні, вірусні, грибкові інфекції, алергічні прояви, системні захворювання можуть бути ознаками цих порушень, для яких характерний ряд синдромів (інфекційний, онкологічний, алергічний, аутоімунний, лімфопроліферативний). У одного хворого може бути кілька синдромів. Наприклад, хронічні інфекційні захворювання (інфекційний синдром) можуть викликати імунодефіцит, а імунодефіцит може проявлятися схильністю до інфекційних і онкологічних захворювань (онкологічний синдром). Схильність до інфекцій може виникати на тлі вторинного імунодефіциту, що розвинувся внаслідок лімфопроліферативного захворювання, наприклад лейкозу. Розрізняють три основні групи патологічних змін імунної системи:

• кількісна або функціональна недостатність того чи іншого ланки імунітету, що веде до розвитку імунодефіцитного стану;
• порушення в розпізнаванні антигену імунною системою, що приводить до розвитку аутоімунних процесів;
• ГІПЕРРЕАКТИВНОСТІ або «збочений» імунну відповідь, що виявляється розвитком алергічних захворювань.

Розрізняють скринінгові (тести 1 рівня) і уточнюючі (тести 2 рівня) методи иммунодиагностики. Перші існують для фіксування порушень в імунній системі, другі - для встановлення механізмів, задіяних в їх реалізації з метою подальшої імунокорекції.

По-Клітинна ланка імунітету

Скринінгові методи

• Визначення відносного і абсолютного числа В-лімфоцитів за допомогою реакції імунофлюоресценції або проточною цитофлюориметрії з використанням моноклональних антитіл до В-клітинним антигенів (CD19, CD20, де CD - кластери диференціювання). Зміст В-лімфоцитів в нормі у дорослих: 8-19% від загальної кількості лейкоцитів або 190-380 клітин / мкл. Підвищення змісту В-лімфоцитів виникає при гострих і хронічних бактеріальних та грибкових інфекціях, хронічних захворюваннях печінки, системних захворюваннях сполучної тканини, хронічному лімфолейкозі, мієломної хвороби.
• Визначення концентрації неспеспеціфіческіх імуноглобулінів (F, М, G, Е) методом простої радіальної імунодифузії, нефелометрії або турбометріі, радіоімунного аналізом або імуноферментним аналізом (ІФА). Норми для дорослих: імуноглобулін (Ig) A 0.9-4.5 г / л. IgM 03-3.7 г / л. IgG 8.0-17 г / л. Збільшення концентрації імуноглобулінів виникає при тих же патологічних станах, при яких відбувається збільшення вмісту В-лімфоцитів. Зниження концентрації імуноглобулінів буває при вродженої гипогаммаглобулинемии, новоутвореннях імунної системи, видаленні селезінки, втрати білка, при захворюваннях нирок або кишечника, лікуванні цитостатиками і іммунодепреесантамі.

Уточнюючі методи

• Визначення в крові циркулюючих імунних комплексів методом селективної преципітації в полізтіленгліколе з подальшим спектрофотометрическим дослідженням щільності (норма 80-20 УЕ). Підвищення циркулюючих імунних комплексів характерно для гострих бактеріальних, грибкових, вірусних інфекцій, аутоімунних, імунокомплексних захворювань, сироваткової хвороби, алергічних реакцій 3 типу;
• Визначення в крові специфічних імуноглобулінів по відношенню до бактеріальних і вірусних антигенів, дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) при аутоімунних захворюваннях, виявлення антиспермальних (аутоімунне безпліддя) і протиниркові антитіл (пієлонефрит і гломерулонефрит) методом радіальної імунодифузії або ІФА.
• Визначення в спермі антиспермальних антитіл [MAR-тест (mixed antiglobulin reaction - змішана антиглобулінова реакція)], норма - негативний результат.
• Визначення в сечі концентрації імуноглобулінів з метою диференціальної діагностики між пієлонефритом і гломерулонефрит (селективність протеїнурії).
• Визначення змісту IgE в соку простати з метою діагностики алергічного простатиту методом радіальної імунодифузії або ІФА. 
• Дослідження відповіді в реакції бласттрансформації В-лімфоцитів на В-клітинний мітоген (мітоген лаконоса для стимуляції реакції бласттрансформації В-лімфоцитів в присутності Т-лімфоцитів), нормативне значення якої 95-100%.

Т-клітинну ланку імунітету

Скринінгові методи

• Визначення відносного і абсолютного числа зрілих CD3 Т-лімфоцитів методом реакції імунофлюоресценції або проточною цітофлюорометріі з використанням моноклональних анти-СDЗ-антитіл. Норма для дорослих 58-76% або 1100-1700 клітин / мкл. Зниження числа Т-лімфоцитів показник недостатності клітинної ланки імунітету. Це характерно для деяких вторинних і первинних імунодефіцитів (хронічні бактеріальні та вірусні інфекції: туберкульоз, синдром набутого імунодефіциту, злоякісні пухлини, хронічна ниркова недостатність, травми, стрес, старіння, недостатність харчування, лікування цитостатиками, дія іонізуючого випромінювання). Підвищення числа Т-лімфоцитів буває на тлі гіперактивності імунітету або при лімфопроліферативних захворюваннях. При запаленні кількість Т-лімфоцитів спочатку підвищується, а потім знижується. Відсутність зниження Т-лімфоцитів говорить про хронізації запального процесу.
• Оцінка субпопопуляцій лімфоцитів.
  • Визначення кількості Т-хелперів (анти-СD4-антитіла). У нормі 36-55% або 400-1100 клітин / мкл. Збільшення числа цих клітин виникає при аутоімунних захворюваннях, хвороби Вальденстрема, активації антітрансплантаціонного імунітету; зниження числа Т-хелперів відбувається при хронічних бактеріальних, вірусних, протозойних інфекціях, туберкульозі, синдромі набутого імунодефіциту, злоякісних пухлинах, опіках, травмах, недостатності харчування, старінні, лікуванні цитостатиками, дії іонізуючого випромінювання.
  • Визначення кількості Т-супресорів (анти-СD4-антитіла). У нормі 17-37% або 300-700 клітин / мкл. Збільшення числа Т-супресорів виникає при тих же станах, при яких знижується кількість Т-хелперів, а їх зниження при тих же станах, при яких вміст Т-хелперів підвищується.
  • Імунорегуляторний індекс CD4 / CD8, в нормі 1,5-2,5. Гіперактивність при показниках більше 2,5 (алергічні та автоімунні захворювання); гипоактивность - менше 1,0 (схильність до хронічних інфекцій). На початку запального процесу імунорегуляторний індекс підвищується, при стиханні - нормалізується.

Уточнюючі методи

• Визначення кількості природних кілерів (NK-клітини) - анти-CD16- і анти-СD56-антитіл. Норма для CD 16-лімфоцитів становить 6-26%, CD56 - 9-19%. Підвищення числа NK-клітин відбувається при відторгненні трансплантата, зниження - при вірусних інфекціях, онкологічних захворюваннях, первинних і вторинних імунодефіцитах, опіках, травмах і стресі, лікуванні цитостатиками і впливі іонізуючого випромінювання. 
• Визначення колічестваТ-лімфоцитів з рецептором до інтерлейкіну-2 (активаційний маркер) - анти-СD25-антитіл. Норма 10-15%. Збільшення їх числа спостерігають при алергічних захворюваннях, відторгненні трансплантата, відповіді на тімусзавісімие антигени в гострий період первинної інфекції, зменшення - при тих же захворюваннях, при яких відбувається зменшення кількості NK-клітин.
• Дослідження експресії активационного маркера - молекули гістосумісності II класу HLA-DR. Підвищення експресії виникає при запальних процесах, у хворих з гепатитом С, на целіакію, сифілісом, гострі респіраторні захворювання.
• Оцінка апоптозу лімфоцитів. Орієнтовна уявлення про готовність лімфоцитів до апоптозу можна визначити за експресією на їх поверхні Fas-рецептора (CD95) і в мітохондріях протоонкогена bd-2. Апоптоз лімфоцитів оцінюють шляхом їх обробки двома флуоресцентними барвниками: пропідіумом йодидом, який зв'язується з фрагментами ДНК, і аннексіном Y, що зв'язуються з Фосфатидилсерин, які з'являтимуться на мембрані клітин на початку апоптозу. Оцінку результатів проводять на проточної цитофлюориметрії. Облік результатів заснований на співвідношенні клітин, забарвлених різними барвниками. Незабарвлені клітини життєздатні, клітини, пов'язані тільки з аннексіном Y, - ранні прояви апоптозу, з пропідія йодидом і аннексіном У - пізні прояви апоптозу, фарбування тільки пропідія йодидом свідчить про некроз.
• Оцінка проліферації Т-лімфоцитів in vitro.
  • Зміна бластогенеза клітин - реакція бласттрансформації лімфоцитів. Лейкоцити инкубируют з будь-яким мітогеном рослинного походження (лектини). Найчастіше використовують фитогемагглютинин протягом 72 год, потім роблять мазок, фарбують його і підраховують кількість бластів! Індекс стимуляції - відношення відсотка трансформованих клітин в досвіді (культура з фитогемагглютинином) до відсотку трансформованих клітин в контролі (культура без фитогемагглютинина). Реакцію бласттрансформації лімфоцитів можна оцінювати по включенню в культивовані клітини радіоактивності (ДТ-тімндін), так як при діленні клітин збільшується синтез ДНК. Порушення в пролиферативном відповіді виникають як при первинних, так і при вторинних імунодефіцитах, асоційованих з інфекціями, онкологічними захворюваннями, нирковою недостатністю, оперативними втручаннями.
  • Оцінка в цих дослідженнях експресії активаційних маркерів (CD25, рецептор до трансферрину - CD71) і молекули головного комплексу гістосумісності II класу HLA-DR, які практично відсутні на покояться Т-лімфоцитах. Т-лімфоцити стимулюють фитогемагглютинином, через 3 доби аналізують експресію активаційних маркерів методом прямої або непрямої реакції імунофлюоресценції, проточної цитофлюориметрії, використовуючи моноклональні антитіла до виділеним рецепторам.
  • Вимірювання кількості медіаторів, що синтезуються активованими Т-лімфоцитами [інтерлейкін (ІЛ) 2, ІЛ-4, ІЛ-5, ІЛ-6, у-інтерферону та ін.], За допомогою радіоімунного аналізу або ІФА. Особливо важлива оцінка концентрації у-інтерферону і ІЛ-4 як маркерів ТИ і Th2 в супернатанті активованих культур і всередині клітини. При можливості корисно визначати експресію гена для відповідного цитокіну за рівнем матричної рибонуклеїнової кислоти в клітці-продуцента і інтенсивності експресії рецепторів для відповідних цитокінів.
    
• Реакція гальмування міграції лімфоцитів. Сенсибілізовані Т-лімфоцити в реакції з антигеном виділяють лімфокіни, в тому числі фактори. Ингибирующие міграцію лімфоцитів. Феномен гальмування спостерігають при внесенні в культуру клітин митогенов. Оцінка ступеня гальмування дозволяє судити про здатність лімфоцитів виділяти цитокіни. У нормі частота міграції в залежності від специфічного митогена становить 20-80%.
• Оцінка цитотоксичности NK-клітин. Визначають здатність природних кілерних клітин вбивати клітини-мішені ерітроміелоідной лінії К-562. Якщо оцінюють антителозависимую цитотоксичность, використовують клітки-мішені, покриті антитілами класу IgG. Клітини-мішені мітять ДТ-уридин і інкубують з клітинами-ефекторами. Загибель клітин-мішеней оцінюють по виходу радіоактивності в розчин. Зниження цитотоксичности відбувається при злоякісних новоутвореннях. У деяких випадках, коли необхідний прогноз ефективності лікування інтерлейкіну, оцінюють цитотоксичність NK-клітин при інкубації з певними цитокінами.

Дослідження функції фагоцитів

скринінгові методи

Дослідження інтенсивності поглинання мікробних клітин фагоцитами (фагоцитоз частинок латексу, тест-культури стафілокока, кишкової палички або мікроорганізмів, виділених у хворого). Шляхом центрифугування гепаринизированной крові виділяють суспензія лейкоцитів, додають сироватку IV групи крові для опсонізації (опсоніни - білки, які посилюють фагоцитоз). Мікробну суспензію розбавляють, змішують з лейкоцитами і інкубують протягом 120 хв, відбираючи проби для аналізу через 30.90.120 хв після початку інкубації. З відібраної лейкоцитарної суспензії роблять мазки. Визначають такі показники фагоцитозу:

• фагоцитарний індекс - відсоток клітин, що вступили в фагоцитоз за 30 хв і 120 хв інкубації; нормативне значення фагоцитарного індексу (30) 94% фагоцитарного індексу (120) - 92%;
• фагоцитарне число - середнє число бактерій, що знаходяться внутрішньоклітинно; нормативне значення фагоцитарного числа (30) 11%, фагоцитарної числа (120) - 9,8%;  
• коефіцієнт фагоцитарного числа - відношення фагоцитарного числа (30) до ФАГОЦИТАРНОЇ числу (120); в нормі 1,16;
• індекс бактерицидності нейтрофілів - відношення числа убитих всередині фагоцитів мікробів до загальної кількості поглинених мікробів; в нормі 66%.

Уточнюючі методи

• Дослідження бактерицидности фагоцитів в тесті з нитросиним тетразолием (НСТ) - НСТ-тест. До лейкоцитам додають барвник нітросинім тетразолієм жовтого кольору. При поглинанні нейтрофілом барвника під дією вільних радикалів кисню йде процес відновлення, в результаті цього виникає синє забарвлення. Реакцію проводять в 96-лунковому плоскодонна планшеті. У перші три лунки з сумішшю НСТ і лейкоцитів додають розчин Хенкса (спонтанний НСТ), у другі - частинки латексу; інкубують при 37 ° С 25 хв. Результати зчитують при 540 нм на рідері і висловлюють в умовних одиницях. Розраховують коефіцієнт стимуляції (К _ст ), що дорівнює відношенню оптичної щільності в стимульованих лунках до середньої оптичної щільності в лунках без стимуляції. У здорових людей НСТ _спонт = 90 ± 45 у.о., НСТ _стим = 140 ± 60 УЕ. До _ст = 1,78 ± 0.36.
• Дослідження молекул адгезії. За допомогою проточної цитофлюориметрії визначають експресію поверхневих антигенів CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Імунодефіцити з порушенням адгезії виявляються рецидивуючими інфекціями, повільним загоєнням ран і відсутністю гною в осередках інфекції.

Дослідження системи комплементу

скринінгові методи

Визначення гемолітичної активності комплементу - дослідження класичного шляху активації комплементу. Різні розведення сироватки хворого і здорової людини додають до еритроцитів барана, покритим антитілами. За одиницю гемолітичної активності приймають величину, зворотну тому розведення сироватки, при якій руйнується 50% еритроцитів. Ступінь гемолізу оцінюють фотометрически по виходу гемоглобіну в розчин. Зниження гемолітичної активності комплементу спостерігають при системний червоний вовчак з ураженням нирок, гострому гломерулонефриті. Комбінованих імунодефіцитах, міастенії, вірусному гепатиті, лімфомах, збільшення - при обструктивної жовтяниці, тиреоїдиті Хасімото. Ревматизмі, ревматоїдному артриті, вузликовому периартеріїт. Дерматомиозите, інфаркті міокарда, виразковий коліт, синдром Рейтера, подагрі.

Уточнюючі методи

• Визначення компонентів комплементу. Кількісне визначення проводять методом радіальної імунодифузії і нефелометрії.
  Дослідження не інформативно, якщо не змінені антигенні властивості компонентів комплементу.
• Встановлено, що Clq-компонент комплементу посилює фагоцитоз і опосередковує клітинну цитотоксичність. Його зниження відбувається при хворобах імунних комплексів, системний червоний вовчак, гнійних інфекціях і пухлинах.
• С3-компонент бере участь в активації класичного і альтернативного шляху комплементу. Зниження його концентрації пов'язують з хронічними бактеріальними та грибковими інфекціями, наявністю циркулюючих або тканинних імунних комплексів.
• С4-компонент бере участь в активації класичного шляху. Зниження його концентрації пов'язують із тривалою активацією комплементу імунними комплексами і зниженням концентрації С1-інгібітора, який контролює активацію класичного шляху комплементу. Дефіцит С4 буває при системний червоний вовчак, збільшення С4 відбувається при хворобах нирок, відторгненні трансплантата, гострому запаленні, захворюваннях шлунково-кишкового тракту.
• С5а-малий фрагмент молекули С5, відщеплюється від неї в результаті активації системи комплементу. Підвищення його концентрації виникає при запаленні, сепсисі, атопічних і алергічних захворюваннях.
• Cl-інгібітор - багатофункціональний фактор. Він контролює активацію С1-компонента комплементу, пригнічує активність калікреїну, плазміну і активованого фактора Хагемана, протеаз Cls і Or. Дефіцит С1-інгібітору призводить до Набряк Квінке.
• ункціональние дослідження комплементу. До стандартної сироватці, позбавленої будь-якого компонента комплементу, додають досліджувану сироватку і визначають гемолітичну активність комплементу. Якщо гемолітична активність не відновлюється до норми, вважають, що активність цього компонента комплементу в досліджуваній сироватці знижена.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]