Конфокальна прижиттєва мікроскопія рогівки

Конфокальна мікроскопія рогівки - один із сучасних методів дослідження; дозволяє проводити прижиттєвий моніторинг стану рогівки з візуалізацією тканин на клітинному і мікроструктурному рівні.

Даний метод в силу оригінальної конструкції мікроскопа і його великий роздільної здатності дозволяє візуалізувати живі тканини рогівки, виміряти товщину кожного з її шарів, а також оцінити ступінь морфологічних порушень.

Мета конфокальної мікроскопії рогівки

Охарактеризувати морфологічні зміни рогівки, що виникають при різних запальних і дистрофічних її захворюваннях, а також внаслідок хірургічних втручань і впливу КЛ.

Дані морфологічного дослідження необхідні, щоб оцінити тяжкість патологічного процесу, ефективність лікування і визначити тактику ведення хворого.

Показання

• Запальні захворювання рогівки ( кератити ).
• Дистрофічні захворювання рогівки ( кератоконус, дистрофія Фукса і ін.).
• Синдром «сухого ока».
• Стану після хірургічних втручань на рогівці (наскрізний пересадки рогівки, кераторефракціонних операцій).
• Стани, пов'язані з носінням контактних лінз.

[1], [2], [3], [4]

Підготовка

Проведення даного дослідження можливо без застосування анестетиків. На об'єктив лінзи конфокального мікроскопа поміщають краплю імерсійної рідини. Це виключає безпосередній контакт лінзи з рогівкою і зводить до мінімуму ризик пошкодження епітелію.

[5], [6], [7], [8], [9],

Техніка конфокальної мікроскопії рогівки

Дослідження виконують на конфокальному мікроскопі ConfoScan 4 (Nider) зі збільшенням в 500 раз. Прилад дозволяє оглянути рогівку по всій її товщині.

Розмір досліджуваної зони становить 440 × 330 мкм, товщина шару сканування - 5 мкм. Лінзу з краплею гелю підводять до рогівці до торкання і встановлюють так, щоб товщина шару иммерсионной рідини становила 2 мм. Конструкція приладу дозволяє досліджувати рогівку в центральній зоні і її парацентральних ділянках.

Протипоказання до проведення

Відносне протипоказання виражене роздратування очі на тлі гострого запального процесу.

[10], [11]

Норма

Нормальна морфологічна картина рогівки

Передній епітелій складається з 5-6 шарів клітин. Середня товщина всього епітелію - приблизно 50 мкм. За морфологічною структурою виділяють наступні шари (зсередини назовні): базальний, шиловидних клітин і поверхневий.

• Найбільш внутрішній (базальний) шар представлений маленькими щільними циліндричними клітинами без видимого ядра. Межі базальних клітин чіткі, яскраві.
• Середній шар складається з 2-3 шарів шіповідних (крилатих) клітин з глибокими інвагінації, в які вбудовуються вирости сусідніх клітин. Мікроскопічно кордону клітин досить добре помітні, а ядра можуть не визначатися або бути нечіткими.
• Поверхневий шар епітелію представлений одним або двома шарами полігональних клітин з чіткими кордонами і гомогенної щільністю. Ядра зазвичай яскравіше, ніж цитоплазма, в якій також можна розрізнити околоядерное темне кільце.

Серед клітин поверхневого шару розрізняють темні і світлі. Підвищена відбивна здатність епітеліальних клітин свідчить про зниження в них рівня метаболізму і починається їх десквамації.

Боуменова мембрана прозора структура, яка не відображає світло, тому в нормі при конфокальної мікроскопії її візуалізація неможлива.

Суббазальное нервове сплетіння знаходиться під боуменовой мембраною. У нормі нервові волокна виглядають як паралельно йдуть на темному тлі яскраві смуги, які контактують між собою. Рефлективність (відбивна здатність) може бути нерівномірною по протягу волокна.

Строма рогівки займає від 80 до 90% товщини рогівки і складається з клітинного і позаклітинного компонента. Основні клітинні елементи строми - кератоціти; складають приблизно 5% обсягу.

Типова мікроскопічна картина строми включає кілька яскравих неправильної овальної форми тіл (ядер кератоцитов), які лежать в товщі прозорого темно-сірого або чорного матриксу. У нормі візуалізація позаклітинних структур неможлива через їх прозорості. Строма може бути умовно розділена на субслоі: передній (розташований безпосередньо під боуменовой мембраною і становить 10% товщини строми), переднесредній, середній і задній.

Середня щільність кератоцитов вище в передній стромі, поступово їх кількість зменшується у напрямку до задніх верствам. Щільність клітин передньої строми майже в два рази більше, ніж клітин задньої строми (якщо щільність клітин передньої строми прийняти за 100%, то щільність клітин задньої складе близько 53,7%). У передній стромі ядра кератоцитов мають округлу бобовидную форму, а в задній овальну і більш витягнуту.

Ядра кератоцитов можуть відрізнятися за яскравістю. Різна здатність відбивати світло залежить від їх метаболічного стану. Більш яскраві клітини прийнято вважати активованими кератоцітов ( «стресовими» клітинами), діяльність яких спрямована на підтримку внутрішнього гомеостазу рогівки. У нормі і поле зору зустрічаються поодинокі активовані клітини.

Нервові волокна в передній стромі рогівки візуалізуються у вигляді яскравих гомогенних смуг, нерідко утворюють біфуркації.

Десцеметова мембрана в нормі прозора і не візуалізується при конфокальної мікроскопії.

Задній епітелій являє собою моношар гексагональних або полігональних плоских клітин з рівномірно світлою поверхнею на тлі чітких темних міжклітинних меж.

У приладі закладена можливість мануального або автоматичного підрахунку щільності клітин, їх площі і коефіцієнта варіабельності.

Патологічні зміни будови рогівки

Кератоконус характеризується значними змінами в передньому епітелії і стромі рогівки.

[12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]